Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi
26 settembre 2016
Il protocollo prevede una metodologia per solubilizzare fango granulare aerobico per estrarre polimeri extracellulari alginato-like (ALE).
L'obiettivo generale del seguente esperimento è illustrare una metodologia di estrazione per ottenere sostanze polimeriche extracellulari strutturali, o EPS, dai biofilm schiumosi, in particolare dal fango granulare aerobico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del fango granulare, come comprendere il processo di granulazione e analizzare la composizione delle EPS.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che la presenza di polimeri gelificanti nei EPS può essere testata in breve tempo. Centrifugare il fango granulare a 4.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti e decantare il soprannatante. Raccogliere i granuli nel pellet per l'estrazione.
Riscaldare 150 millilitri di acqua di rubinetto in un becher di vetro da 1.000 millilitri su un agitatore magnetico fino a 80 gradi Celsius. Trasferire tre grammi di granuli in un matraccio baffato da 250 millilitri e portare il volume a 50 millilitri con acqua demineralizzata. Aggiungere 0,67 grammi di carbonato di sodio decaidrato nel matraccio per ottenere una concentrazione di carbonato di sodio dello 0,5% peso/volume.
Posizionare il matraccio contenente la miscela nel bagno d'acqua. Coprire separatamente il matraccio e il bicchiere con carta d'alluminio, per prevenire l'evaporazione. Mescolare la miscela per 35 minuti a 400 giri al minuto e 80 gradi Celsius.
Trasferire la miscela in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare il tubo contenente la miscela a 4.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Raccogliere il soprannatante e scartare il pellet.
Il passaggio di dialisi è facoltativo per ottenere EPS strutturali dal fango granulare aerobico. Tuttavia, presenta diversi vantaggi descritti nel protocollo. Pipettare il surnatante in un sacchetto da dialisi con cutoff di peso molecolare di 3.500 dalton e dializzare per 24 ore contro 1000 ml di acqua ultrapura.
Cambiare l'acqua della dialisi dopo 12 ore per potenziare l'effetto della dialisi stessa. Trasferire l'estratto dializzato in un becher di vetro da 250 ml e mescolare lentamente l'estrazione a 100 giri/min e a temperatura ambiente. Monitorare costantemente le variazioni di pH mediante un elettrodo per pH, aggiungendo contemporaneamente acido cloridrico 1 molare fino a raggiungere un pH finale di 2,2 ± 0,5 per ottenere l'ale in forma acida.
Dopo aver regolato il pH a 2,2, trasferire l'estratto in un tubo da centrifuga da 50 ml e centrifugare a 4000 ×g e quattro gradi Celsius per venti minuti. Eliminare il soprannatante e raccogliere il pellet di aspetto gelatinoso. Il pellet gelatinoso è l'acido nella sua forma acida.
Per ottenere la forma sodica dell'ale, aggiungere lentamente 0,5 moli di idrossido di sodio al gel, mescolando il gel lentamente con un bastoncino di vetro a mano fino a quando non si raggiunge un pH di 8,5. Utilizzando una pipetta di Pasteur, far cadere goccia a goccia l'estratto di ale sodico in una soluzione di cloruro di calcio. Se l’EPS estratto possiede proprietà gelificanti di idrogel ionico, si formeranno delle perle di forma sferica a goccia.
In alternativa, se l’EPS estratto non possiede proprietà di formazione di idrogel ionici, l’estratto si disperderà nella soluzione di cloruro di calcio. Mantenere le perle di idrogel e la soluzione di cloruro di calcio per 30 minuti. Utilizzare un cucchiaio per rimuovere le perle di idrogel dalla soluzione di cloruro di calcio e trasferirle in una soluzione di EDTA.
Conservare le microsfere di idrogel in 10 ml di soluzione di EDTA per tre ore a quattro gradi Celsius. Questo test illustra un esempio dei test di stabilità descritti nel protocollo. Monitorare la presenza di disintegrazione visibile delle microsfere durante la conservazione, per valutare se queste ultime possono resistere a tali condizioni.
Se l'estrazione ha avuto successo, il fango granulare aerobico verrà solubilizzato dopo il passaggio di estrazione alcalina e verrà ottenuto un pellet dopo l'acidificazione e la centrifugazione dell'EPS estratto. Se l'EPS estratto è costituito da EPS strutturali e ha la capacità di formare idrogeli con ioni calcio, si formeranno perle di gel quando l'EPS estratto viene gocciolato nella soluzione di calcio. Se invece vengono estratti EPS privi di questa capacità di formare gel, la soluzione di EPS si disperderà nella soluzione di calcio.
Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe essere in grado di eseguire l'estrazione di EPS strutturali dal fango granulare aerobico. Inoltre, si dovrebbe essere in grado di verificare la capacità gelificante degli EPS ottenuti in presenza di ioni calcio. Abbiamo scelto di mostrare questa metodologia di estrazione per illustrare l'impatto della tecnica di estrazione sugli EPS ottenuti dal fango granulare aerobico.
Inoltre, volevamo dimostrare che nessuna tecnica di estrazione dell'EPS è universalmente applicabile.
Panoramica
Questo protocollo descrive una metodologia per l'estrazione di polimeri extracellulari simili all'alginato (ALE) dal fango granulare aerobico. Il processo di estrazione è progettato per migliorare la comprensione della composizione e delle proprietà delle sostanze polimeriche extracellulari (EPS).
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biotecnologia
- Scienze ambientali
Sfondo
- Le sostanze polimeriche extracellulari (EPS) svolgono un ruolo fondamentale nella formazione e nella stabilità dei biofilm.
- Il fango granulare aerobico è una tecnologia promettente per il trattamento delle acque reflue.
- Comprendere la composizione delle EPS può fornire informazioni sul processo di granulazione.
- La valutazione delle proprietà gelificanti delle EPS può avere implicazioni per diverse applicazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare una metodologia affidabile per l'estrazione dell'EPS dal fango granulare aerobico.
- Analizzare le proprietà strutturali dell'EPS estratto.
- Valutare la capacità di formazione di gel dell'EPS estratto in presenza di ioni calcio.
Metodi Utilizzati
- Centrifugazione del fango granulare per separare il soprannatante e il pellet.
- Estrazione alcalina mediante carbonato di sodio per solubilizzare l’EPS.
- Dialisi per purificare l’EPS estratto.
- Regolazione del pH per ottenere forme di EPS simili all’alginato.
Risultati principali
- Estrazione riuscita di pellet di consistenza gelatinosa indicanti la presenza di ALE.
- Dimostrazione delle proprietà gelificanti quando l'EPS viene mescolato con cloruro di calcio.
- Valutazione della stabilità dei microgel in diverse condizioni.
- Informazioni sull'impatto della tecnica di estrazione sulle proprietà dell'EPS.
Conclusioni
- La metodologia sviluppata estrae in modo efficace l'EPS dal fango granulare aerobico.
- Comprendere le proprietà dell'EPS può orientare future ricerche nel trattamento delle acque reflue.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare l'applicabilità di questa tecnica di estrazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'estrazione e la caratterizzazione delle sostanze polimeriche extracellulari (EPS) strutturali dal fango granulare aerobico permette un'analisi precisa dei componenti della matrice del biofilm rilevanti per i processi biotecnologici e la biotecnologia ambientale. La capacità di isolare polimeri simili all'alginato in grado di formare gel (ALE) supporta una riduzione meccanicistica dei rischi nei flussi di lavoro in cui la composizione dell'EPS influisce sulla stabilità del processo e sulle proprietà dei materiali. Questa metodologia fornisce indicazioni per la validazione iniziale degli obiettivi e per la standardizzazione nello sviluppo di saggi successivi nei processi biotecnologici industriali e biotecnologici farmaceutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della composizione dell'EPS per chiarire i percorsi strutturali del biofilm.
- Supporta la validazione funzionale dei polimeri formatori di gel fondamentali per l'integrità del biofilm.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione di protocolli di estrazione per matrici biologiche complesse.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce estratti di EPS standardizzati per saggi riproducibili successivi.
- Permette la valutazione quantitativa della capacità di formazione di gel mediante la formazione di perle indotta da calcio.
- Supporta la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma definendo i parametri di estrazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli output dell'estrazione a modelli di biofilm pertinenti alla malattia o al processo, quando applicabile.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo una caratterizzazione consistente dell'EPS.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica negli interventi mirati ai biofilm.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di estrazione colloca l'isolamento degli EPS all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo di saggi, sostenendo flussi di lavoro dalla verifica delle ipotesi alla validazione di modelli preclinici.
- Biologia della scoperta: chiarisce il ruolo dell'EPS strutturale nella formazione e stabilità del biofilm.
- Screening: fornisce letture quantitative riproducibili di formazione del gel per analisi comparative.
- Analisi: offre risultati misurabili come la stabilità delle perle e le soglie di solubilizzazione.
- Ricerca traslazionale: consente di allineare l'estrazione dell'EPS con modelli pertinenti di biofilm o materiali.
- Riutilizzo aziendale: stabilisce una capacità standardizzata di estrazione per diverse applicazioni di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità negli studi sui biofilm relativi alla EPS.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra i flussi di lavoro di estrazione e saggio.
- Valore strategico: Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di processi mirati ai biofilm.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio di iniziative di ricerca e sviluppo focalizzate su biofilm ed EPS.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia dei biofilm e tecniche di estrazione di polimeri.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per centrifugazione, controllo del pH e dialisi.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di estrazione e di test di stabilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi sistemi di fango o biofilm in base alla composizione della matrice.
- L'efficacia dell'estrazione e la valutazione della formazione di gel dipendono dal metodo e non sono universalmente trasferibili.
