Name: Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Scopri l'estrazione di polimeri extracellulari strutturali da fanghi granulari aerobici. Questo metodo permette di isolare EPS e testarne le proprietà gelificanti con ioni calcio per applicazioni nel trattamento delle acque reflue.

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Questa ricerca è stata finanziata dal SIAM Gravitation Grant 024.002.002, dall'Organizzazione Olandese per la Ricerca Scientifica e dalla Dutch Technology Foundation (STW - Simon Stevin Meester 2013). Gli autori desiderano ringraziare Mario Pronk per aver fornito i campioni di fanghi granulari.

NOTA: AGS sono stati raccolti dal reattore pilota Nereda presso l&#39;impianto di trattamento delle acque reflue Utrecht, Paesi Bassi. Il reattore è stato alimentato con depurazione comunale. Il fango granulare aveva un indice di volume dei fanghi (SVI 5min) di 59,5 ml / g VSS. Il fango è stato campionato in aprile alla fine di un ciclo aerobico. Dopo il campionamento, il fango è stato immediatamente trasportato al laboratorio, setacciato e conservato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. 1. Estrazione EPS NOTA: fango granulare Centrifugare a 4.000 × g e 4 ° C per 20 minuti, e decantare il surnatante. Raccogliere granuli nel pellet per le estrazioni. I solidi totali (TS) e solidi volatili (VS) dei granuli sono state determinate mediante i metodi standard 23. Il fattore di conversione tra granuli peso umido - il peso dei granuli prelevati direttamente dal pellet - e TS è stato determinato prima della estrazione. Tutte le estrazioni sono stati fatti in triplicato. NOTA: 3 g g bagnatoranules sono stati utilizzati per ogni metodo di estrazione. I loro TS e valori VS (0,39 g TS e 0,34 g VS), misurato in triplicato, sono stati usati per calcolare il rendimento di estrazione. <ol><li> Estrazione centrifugazione 11 <ol><li> Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un tubo di centrifugazione e riempire il tubo di centrifugazione a 50 ml con acqua demineralizzata. </li><li> Un po &#39;scuotere il tubo di centrifugazione a mano. </li><li> Centrifugare il tubo di centrifugazione contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. </li><li> Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. </li></ol></li><li> Estrazione Sonicazione 10 <ol><li> Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un tubo di centrifugazione e riempire il tubo di centrifugazione a 50 ml con acqua demineralizzata. </li><li> Applicare sonicazione pulsata in ghiaccio per 2,5 min a 40 W alla miscela. </li><li> Centrifugare la centrifugazioneprovetta contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. </li><li> Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. </li></ol></li><li> L&#39;acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) di estrazione 11 <ol><li> Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in una bottiglia di vetro da 100 ml e riempire la bottiglia a 50 ml con 2% (w / v) di EDTA. </li><li> Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 3 ore. </li><li> Trasferire il composto in un tubo di centrifugazione 50 ml. </li><li> Centrifugare il tubo di centrifugazione contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. </li><li> Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. </li></ol></li><li> Formamide - Estrazione di idrossido di sodio (NaOH) 13 <ol><li> Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un 100bottiglia di vetro ml e riempire la bottiglia a 50 ml con acqua demineralizzata. </li><li> Aggiungere 0,3 ml 99% formammide. </li><li> Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Aggiungere 20 ml di 1 M NaOH alla sospensione granuli. </li><li> Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 3 ore. </li><li> Trasferire il composto in modo uniforme in due da 50 ml tubo di centrifugazione. </li><li> Centrifugare le provette centrifugazione contenenti la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. </li><li> Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. </li></ol></li><li> Estrazione di NaOH 11 - Formaldeide <ol><li> Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in una bottiglia di vetro da 100 ml e riempire la bottiglia a 50 ml con acqua demineralizzata. </li><li> Aggiungere 0,3 ml di 37% di formaldeide. </li><li> Un po &#39;agitare la bottiglia a mano e negozioin frigorifero a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Aggiungere 20 ml di 1 M NaOH alla sospensione granuli. </li><li> Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 3 ore. </li><li> Trasferire il composto in modo uniforme in due da 50 ml tubo di centrifugazione. </li><li> Centrifugare le provette centrifugazione contenenti la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. </li><li> Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. </li></ol></li><li> Alta temperatura - estrazione di carbonato di sodio (Na 2 CO 3) 9,22,24 <ol><li> Preriscaldamento 150 ml acqua di rubinetto in un bicchiere di vetro 1000 ml su un agitatore magnetico a 80 ° C. </li><li> Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un pallone da 250 ml sconcertato e riempire il pallone a 50 ml con acqua demineralizzata. </li><li> Aggiungere 0,25 g di Na 2 CO 3 anidro o 0,67 g di Na 2 CO 3 • 10H <sub&gt; 2 O nel pallone per ottenere un 0.5% (w / v) Na 2 CO 3 concentrazione. </li><li> Mettere il pallone contenente la miscela nella vasca d&#39;acqua. Coprire il pallone e il vetro becher separatamente con foglio di alluminio per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Mescolare la miscela per 35 min a 400 rpm a 80 ° C. </li><li> Trasferire il composto in un tubo di centrifugazione 50 ml. </li><li> Centrifugare il tubo di centrifugazione contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. </li><li> Raccogliere il surnatante e scartare il pellet. </li></ol></li><li> TS e VS misura di tutti gli estratti secondo i metodi standard 23. <ol><li> Prendere il surnatante e dializzare per 24 ore contro le 1.000 ml di acqua ultrapura (sacchetto di dialisi con peso molecolare 3.500 Da tagliare (MWCO)) 11,12. Cambiare l&#39;acqua di dialisi dopo 12 ore per aumentare l&#39;effetto della dialisi. </li><li> Trasferire una frazione ragionevole (circa 1/3) del surnatante dializzato perun piatto di alluminio per TS e VS di misura 23. NOTA: Asciugare il campione durante la notte a 105 ° C. La differenza di peso della capsula di alluminio vuota e il piatto di alluminio contenente il campione essiccato è il contenuto TS. Poi bruciare lo stesso piatto di alluminio contenente il campione a 550 ° C per 2 ore. La differenza di peso tra il piatto di alluminio vuota e il piatto di alluminio contenente il campione bruciato è il contenuto di ceneri. La differenza tra il contenuto di TS e cenere è il contenuto VS. </li><li> Per ogni estratto, trasferire la frazione residua del surnatante dializzato di 10 bicchieri di vetro ml. Addensare il supernatante per 2 giorni a 60 ° C fino ad un volume finale di 1-2 ml per aumentare la concentrazione del polimero nel surnatante. </li></ol></li></ol> 2. alginato come extracellulare Polymer (ALE) Estrazione <ol><li> Dializzare l&#39;estratto ottenuto al punto 1.6.8 in base al punto 1.7.1. </li><li> Trasferire l&#39;estratto dializzato in un bicchiere di vetro da 250 ml. Lentoly mescolare l&#39;estrazione a 100 rpm e la temperatura ambiente. monitorare costantemente variazioni di pH con un elettrodo di pH, mentre l&#39;aggiunta di 1 M di acido cloridrico (HCl) ad un pH finale di 2,2 ± 0,05 per ottenere ALE in forma acida. </li><li> Dopo aver regolato il pH a 2,2, trasferire l&#39;estratto in un tubo da 50 ml centrifugazione e centrifugare a 4000 xg e 4 ° C per 20 min. </li><li> Eliminare il surnatante e raccogliere il pellet gel. Il pellet gel-like è ALE in forma acida. </li><li> Per ottenere il sodio (o potassio) forma di ALE, aggiungere lentamente 0,5 M NaOH (o 0,5 M di idrossido di potassio) per il gel ottenuto nello stadio 2.4, durante la miscelazione del gel lentamente con una bacchetta di vetro a mano fino a raggiungere pH 8,5. </li></ol> 3. ionica Hydrogel test Formazione NOTA: Al fine di verificare se l&#39;EPS estratti avevano ionici proprietà di formazione idrogel, un test di formazione tallone con ioni Ca 2+ è stato utilizzato 25. <ol><li> Dopo ispessimento della estratto nel passo 1.7.3 perun volume di 1-2 ml, mescolare lentamente la miscela con una bacchetta di vetro e regolare il pH a 8,5 con 0,5 M NaOH. </li><li> Prendere l&#39;estratto del punto 3.1 o ALE sodio passo 2.5 e gocciolare lentamente dell&#39;estratto con una pipetta Pasteur in 2,5% (w / v) di cloruro di calcio (CaCl 2) soluzione. NOTA: Se l&#39;EPS estratto ha gel idrogel ionica formando proprietà, a forma di goccia sarà formato (sferici) perline. Se l&#39;EPS estratto ha gel idrogel ionica formando proprietà, l&#39;estratto si disperderà nella soluzione di CaCl 2. </li></ol> 4. Prova di stabilità del ionica Hydrogel NOTA: Per comprendere meglio il ruolo dell&#39;idrogel EPS ionici nella formazione della struttura AGS, prove di stabilità sono state effettuate sulle perline idrogel ionici del Na 2 CO 3 estrazione, raccolti nel passaggio 3.2. <ol><li> Mantenere le perline idrogel per 30 minuti nella soluzione di CaCl 2. </li><li> Utilizzare un cucchiaio per togliere le perle di idrogel dal CaCl 2 </sub&gt; soluzione e dividere le perline in quattro frazioni uguali. </li><li> Conservare frazione 1 in 10 ml di acqua demineralizzata per 4 ore a 4 ° C. Le seguenti prove di stabilità sono state eseguite nello stesso modo come descritto nei metodi di estrazione 1.3 - 1.5. </li><li> frazione negozio 2 in 10 ml 2% (w / v) di EDTA per 3 ore a 4 ° C. </li><li> Conservare frazione 3 a 7,15 ml di acqua demineralizzata con 60 microlitri 99% formammide per 1 ora a 4 ° C. Quindi aggiungere 2,85 ml 1 M NaOH e frazione memoria 3 per 3 ore a 4 ° C. </li><li> Conservare frazione 4 in 7,15 ml di acqua demineralizzata con 60 microlitri 37% di formaldeide per 1 ora a 4 ° C. Quindi aggiungere 2,85 ml 1 M NaOH e frazione deposito 4 per 3 ore a 4 ° C. </li><li> Monitorare se c&#39;è disgregazione visibile delle perline durante la conservazione, nelle condizioni descritte ai punti 4.3 - 4.6 a valutare se le perline resistere alle condizioni di estrazione. </li></ol>

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<li>Guo, X., Liu, J., Xiao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+damage+of+cell+wall+and+cell+membrane+for+various+extracellular+polymeric+substance+extractions+of+activated+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge.</a> J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Osservazioni per la sezione protocollo L&#39;estrazione di EPS / ALE è descritto per un volume di 50 ml e 3 g di granuli. Questi valori sono da intendersi come linee guida. Estrazioni con concentrazioni più elevate di granuli possono diminuire la resa dei EPS estratti. Durante l&#39;estrazione ALE la temperatura deve essere mantenuta costante a 80 ° C per 30 min. Il tempo necessario per la miscela per riscaldare (circa 5 min) è incluso nel protocollo. Inoltre, l&#39;efficacia di estrazione viene migliorata utilizzando un ancoretta magnetica della stessa dimensione del diametro del fondo matraccio. Questo si tradurrà in buone proprietà di miscelazione e effetti di fresatura, promuovendo l&#39;estrazione di EPS. Più tardi, nella sezione del protocollo, TS e VS rendimenti di tutte le estrazioni (surnatante raccolti nei passaggi 1.1-1.6) sono determinati. Dialisi deve essere eseguita prima della TS e VS misura di diminuire possibili errori dovuti alla presenza di sostanze chimiche usate per estrazioni. UNMWCO di 3.500 Da consiglia di rimuovere queste sostanze chimiche, pur mantenendo le macromolecole EPS all&#39;interno del sacchetto di dialisi. La sacca di dialisi dovrebbe avere un volume maggiore del volume dell&#39;estratto. Ciò è necessario, in quanto il volume dell&#39;estratto aumenta durante la dialisi (ad esempio, per l&#39;estrazione EDTA fino a aumento di volume del 40%). Il grado di rimozione chimica mediante dialisi può essere determinata misurando il pH nel campione prima e dopo la dialisi. In alternativa, misure di conducibilità dell&#39;acqua di dialisi mostrano l&#39;estensione della rimozione di ioni. Per ottenere ALE dall importo totale estratto i EPS (punti 1.6 e 2) la fase di dialisi è facoltativo. Tuttavia, la dialisi ha tre vantaggi: riduce la quantità di HCl necessaria per la precipitazione, migliora il trasferimento di massa di acido nell&#39;estratto e diminuisce il contenuto di ceneri del ALE ottenuto. Per la precipitazione di ALE è consigliabile utilizzare un bicchiere di vetro con un volume molto maggiore della estrat. Na 2 CO 3 è normalmente overdose nell&#39;estrazione. Il HCl aggiunto sarà dapprima reagire con Na 2 CO 3 rimasti nell&#39;estratto, causando la formazione di biossido di carbonio e, se il campione non è stato dializzato prima, in schiuma. Durante l&#39;aggiunta di HCl, l&#39;estratto dovrebbe essere mescolato lentamente di ancoretta magnetica della stessa dimensione del fondo del bicchiere. Una barra di agitazione di queste dimensioni e lenta agitazione si tradurrà in una miscelazione uniforme senza rompere la struttura del precipitato. Se grumi gel acidi si formano nell&#39;estratto, il bicchiere deve essere agitato un po &#39;a mano. La precipitazione viene condotta con una concentrazione di acido di 1 M di evitare un forte aumento del volume dell&#39;estratto mentre ancora ottenere una distribuzione omogenea di acido nel campione. concentrazioni di acido più elevate possono comportare una diminuzione del pH regionale e ciuffi gel acidi formazione. Un pH inferiore a 2,0 diminuisce la quantità di ALE che può essere recuperato, probabilmente a causa di cambiamenti strutturalidei polimeri a pH inferiore. E &#39;quindi importante mantenere il pH finale a 2,20 ± 0,05. limitazioni Il metodo di estrazione ALE intende estrarre polimeri extracellulari strutturali delle EPS da AGS o biofilm in generale e non è inteso per estrarre tutti presenti EPS. Per estrarre tutti EPS, una combinazione di più di un metodo di estrazione è necessaria. Inoltre, come illustrato con l&#39;aumento della resa VS EPS applicando un&#39;estrazione doppie e quadruple, una singola estrazione sarà non estrarre tutti EPS strutturali. Estrazione ALE è un metodo di estrazione EPS dura, combinando costante miscelazione con condizioni di calore e alcaline. Per questo motivo è possibile che materiale intracellulare viene estratto insieme ai EPS. Anche se la lisi cellulare può essere causato da tecniche di estrazione fisica e chimica (sonicazione 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, CER 32, 32 e di calore ad alta taglio tassi di missaggio 19), la presenza di materiale intracellulare in EPS recuperati deve ancora essere verificata. La proprietà ionico gelificante delle EPS estratte è l&#39;obiettivo principale di questa ricerca, se l&#39;EPS recuperato contiene materiale intracellulare non è stato analizzato. La ricerca futura si concentrerà sull&#39;identificazione materiale intracellulare nelle EPS estratti. Solubilizzante la matrice idrogel di AGS è cruciale per estrarre EPS strutturali EPS forma una matrice idrogel densa e compatta in AGS. Sebbene EPS contiene varie classi di macromolecole organiche quali polisaccaridi, proteine, acidi nucleici, lipidi (fosfo), sostanze umiche e alcuni polimeri intercellulari 7,5,8, non tutti formare un gel. Solo quei polimeri gelificanti sono qui considerati come polimeri strutturali in EPS. Lo scopo di EPS estrazioni è per solubilizzare dapprima EPS e quindi raccogliere i EPS solubilizzate. Se l&#39;EPS strutturale (vale a dire, tha EPS formando un idrogel) è la porta di estrazione, la matrice di gel di AGS deve essere solubilizzati prima. Solo metodi che possono solubilizzare la matrice di gel sono in grado di estrarre EPS strutturali. In questa ricerca, più frequenti utilizzate EPS metodi di estrazione, come centrifugazione 10-15, sonicazione 10,14,15, EDTA 10 - 12,14,15, formaldeide + NaOH 10 - 15 e formammide + NaOH 13 non poteva isolare efficacemente l&#39;strutturale EPS. Ciò è dovuto al fatto che la matrice idrogel dei granuli aerobici non è stato solubilizzato con questi metodi. Per questo motivo, prove di stabilità nella sezione 4 sono stati eseguiti solo con le condizioni attuali in EDTA, formammide + NaOH e formaldeide + estrazione di NaOH. Questi tre estrazioni non erano in grado di isolare EPS strutturali, ma ancora ottenere il massimo rendimento VS EPS oltre il Na 2 CO 3 estrazione. condizioni Of Na 2 CO 3 estrazione non è applicata a questo metodo di estrazione chiaramente solubilizzati matrice AGS. Quindi le condizioni applicate durante la prova di stabilità sono state considerate rappresentative. Estrazione con resina a scambio cationico (CER), un altro metodo di estrazione EPS utilizzato di frequente, non è stato considerato per questo confronto, come gli studi precedenti sulla estrazione EPS con CER non danno i risultati migliori rispetto alle estrazioni chimici utilizzati qui. EPS gelificanti nei AGS EPS gelificanti sono considerati come i EPS strutturali nella matrice idrogel di AGS. Vale la pena notare che ci sono vari tipi di idrogel come gel ionici, gel di temperatura indotta e gel pH indotti. Questo studio si concentra solo su EPS che formano gel ionici. Per quanto riguarda la grande frazione di materiale gel strutturale estratto, questo è probabilmente i EPS strutturali dominanti. Ci sono certamente possibilità che altri tipi di EPSche formano diversi tipi di idrogel (per esempio, pH gel indotta 28) esiste nello stesso o altro tipo di granuli aerobici. Tuttavia, non importa che tipo di idrogel è rivolto, solubilizzanti la matrice EPS gel è il passo più importante per estrarre EPS gelificanti. Attualmente, poca ricerca è stata fatta su EPS strutturali del fango granulare. L&#39;estrazione ALE descritto in questo protocollo è in grado di estrarre EPS gelificanti da AGS e verrà utilizzato in studi futuri per caratterizzare EPS strutturali. Più ricerca deve essere fatto su AGS, EPS strutturali e non strutturali EPS per meglio comprendere il processo e la funzione di granulazione e EPS. In particolare i seguenti tre punti devono essere indagati: il motivo per cui i microrganismi producono una tale quantità di EPS, qual è l&#39;esatta composizione di EPS e di come è la composizione di EPS, modificate in funzione dei cambiamenti ambientali. Rilevamento e analisi di tutti i composti coinvolti e la loro interactions aiuterà a comprendere biofilm e come usarli a nostro vantaggio.

Negli ultimi anni il processo di fango granulare (AGS) aerobico è diventato un popolare processo di trattamento biologico delle acque reflue, applicato con successo in diverse su larga scala impianti di depurazione 1. In contrasto con il processo a fanghi attivi convenzionali, elaborano i AGS microrganismi formano granuli invece di fiocchi 2. Questi granuli hanno una migliore sedimentazione, sono in grado di resistere a più alti tassi di carico organico, e hanno una maggiore tolleranza alla tossicità di fiocchi fanghi attivi 3. A differenza di biofilm, AGS si forma spontaneamente senza il coinvolgimento di qualsiasi materiale di supporto 4. In AGS, come in biofilm, microorganismi producono una notevole quantità di sostanze polimeriche extracellulari altamente idratati (EPS) 5 per formare una matrice idrogel in cui sono auto-immobilizzato 4 - 6. EPS sono una miscela complessa, costituita da polisaccaridi, proteine, acidi nucleici, (phospHo) lipidi, sostanze umiche ed alcuni polimeri intercellulari 5,7,8. Queste sostanze polimeriche interagiscono tra loro mediante forze elettrostatiche, legami idrogeno, forze ioniche attraenti e / o reazioni biochimiche, ecc 5, formando una struttura di rete terziaria densa e compatta. I polimeri in EPS che sono in grado di formare idrogeli 4,9 e contribuire alla formazione della struttura di rete terziaria sono a questo riguardo considerato EPS strutturali, un sottoinsieme del totale EPS. EPS sono responsabili della struttura chimica e proprietà fisiche dei granuli 5. E &#39;quindi fondamentale per capire la funzione di ogni composto EPS. Vari approcci sono applicati per estrarre EPS 10 - 15. Tuttavia, a causa della loro estrema complessità, è quasi impossibile estrarre tutti i componenti EPS da un unico metodo. Ad oggi, non vi è &quot;one size fits all&quot; metodo di estrazione EPS. La scelta del metodo di estrazione influenza non solo la quantità totale, ma anche la composizione dei polimeri recuperati 13,16 - 20. A seconda del tipo di fanghi e le EPS di interesse metodi differenti sono necessari. Estrazione polimeri gelificanti, caratterizzano le loro proprietà e indagare le loro interazioni con l&#39;altro e con EPS non-gelificanti contribuirà a rivelare il ruolo di EPS in formazione di fango aerobico granulare. Inoltre, i polimeri gelificanti sono anche biopolimeri utili in applicazioni industriali. Una possibile applicazione è stato già dimostrato utilizzando polimeri gelificanti da AGS come materiale di rivestimento per aumentare la resistenza all&#39;acqua di carta 21. Pertanto, sono necessari metodi di estrazione, specifici per EPS gelificanti. Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una metodologia per estrarre EPS gelificanti da AGS. Sei metodi di estrazione 10 - 15,22, che sono spesso utilizzati in letteratura, sono stati selezionati per estrarre EPS da AGS. L&#39;importo totale e la struttura gelificante dell&#39;EPS estratti sono stati confrontati per ciascuna metodologia.

<table><tbody><tr><td>Pallone deflettore da 250 ml</td><td>Kimble</td><td>25630-250</td><td></td></tr><tr><td>Becher in vetro da 1.000 ml</td><td>VWR</td><td>213-1128</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic, agitatore magnetico con termometro</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>carbonato di sodio decaidrato</td><td>Merck KGaA</td><td>1063911000</td><td></td></tr><tr><td>provette da centrifugazione da 50 ml</td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1 S-R, centrifuga</td><td>Heraeus/Thermo</td> <td>Scientific-acido</td><td></td></tr> <tr><td>cloridrico, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L-GL-D</td><td></td></tr><tr><td>250 ml becher di vetro</td><td>VWR</td><td>213-1124</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio diidrato</td><td>Merck KGaA</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pasteur Pipetta</td><td>Copan</td><td>201C</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Per valutare e sviluppare metodologie per l'estrazione di sostanze polimeriche extracellulari gelificanti (EPS), l'EPS da fanghi granulari aerobici (AGS) è stato estratto utilizzando sei diversi metodi (centrifugazione, sonicazione, acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), formamide con idrossido di sodio (NaOH), formaldeide con NaOH e carbonato di sodio (Na2CO3) con calore e miscelazione costante). L'AGS è stato raccolto da un reattore pilota per il trattamento delle acque reflue. La proprietà di formazione di gel ionico dell'EPS estratto dai sei diversi metodi di estrazione è stata testata con ioni calcio (Ca2+). Dei sei metodi di estrazione utilizzati, solo l'estrazione di Na2CO3 è stata in grado di solubilizzare la matrice di idrogel di AGS. I polimeri extracellulari simili all'alginato (ALE) recuperati con questo metodo hanno formato perle di gel ionico con Ca2+. Le perle di Ca2+-ALE erano stabili in EDTA, formamide con NaOH e formaldeide con NaOH, indicando che gli ALE sono una parte dei polimeri strutturali in EPS. Si consiglia di utilizzare un metodo di estrazione che combini il trattamento fisico e chimico per solubilizzare l'AGS ed estrarre l'EPS strutturale.

estrazione EPS La comparsa dei granuli dopo l&#39;applicazione di differenti procedure di estrazione EPS è mostrato in Figura 1. La struttura forma e gel di granuli era intatto dopo centrifugazione (Figura 1a) ed estrazione EDTA (figura 1c). Granuli erano rotte in frammenti di dimensioni diverse per sonicazione. La torbidità in fase liquida potrebbe essere dovuto alla sospensione di piccoli frammenti (Figura 1b) come torbidità altamente diminuita dopo centrifugazione. Formammide e formaldeide da sola non ha avuto alcun impatto sul cambiando la forma del granulo e la sua struttura gel (dati non mostrati). Dopo l&#39;aggiunta di NaOH, la fase liquida attivata giallastro. Alcuni materiali soffici stato staccato dalla superficie dei granuli e formò un livello sopra granuli costante (Figura 1D e 1E). Tuttavia, la forma delgranuli non è stato modificato. L&#39;aggiunta di NaOH apparentemente migliorata EPS solubilizzazione, ma non potrebbe danneggiare la struttura della matrice di gel. In confronto, granuli completamente scomparse dopo Na 2 CO 3 di estrazione (Figura 1F). Invece sono formate una miscela di particelle gelatinose liquidi e minuscole sol-like, che mostra la matrice di gel di granuli era effettivamente solubilizzati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig1.jpg" /> Figura 1. aerobici fango granulare EPS estrazioni. Per una migliore visualizzazione dell&#39;impatto di ciascun metodo di estrazione sui granuli, esperimenti sono stati condotti in 25 ml bottiglie di vetro. Dopo la procedura di estrazione, gli estratti sono stati conservati per 1 ora a temperatura ambiente per permettere la materia sospesa sedimenti. (A) estrazione di centrifugazione, (b) estrazione sonicazione, (c) estrazione EDTA, (d) Formamide - NaOH supplementarection, (e) Formaldeide - estrazione di NaOH, (f) ad alta temperatura -. Na 2 CO 3 estrazione <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54534/54534fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> EPS resa rispetto alla frazione VS per ogni metodo è illustrato nella figura 2. La resa è presentato in mg VS EPS per g iniziale VS granuli. La quantità di EPS ottenuti con formaldeide + NaOH, formammide + NaOH e Na 2 CO 3 + calore + miscelazione sia superiore a quella di centrifugazione, sonicazione ed estrazione EDTA. Risultati simili a queste tecniche di estrazione sono stati mostrati anche da studi precedenti 11 - 13,15 indicano che le condizioni alcaline migliorare EPS solubilità 26,27. La quantità di EPS recuperato Na 2 CO 3<html> era il più alto, più di 20 volte di quello ottenuto soltanto per centrifugazione. Inoltre, la resa EPS totale di Na 2 CO 3 estrazione può essere ulteriormente migliorata da più estrazioni. A seconda estrazione utilizzando il pellet scartati in fase 1.6.8 (sezione protocollo) della prima dell&#39;estrazione aumentata la resa totale del 28%, estrazione quadrupla anche aumentato il rendimento complessivo del 46%. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig2.jpg" /> Figura 2. I risultati di tutti i metodi di estrazione rispetto al VS resa e contenuto di ceneri. Per ogni estrazione la prima barra rappresenta la resa VS in mg VS EPS per g iniziale VS granuli. La seconda barra rappresenta la percentuale in peso di cenere nella ST estratti. Le barre di errore illustrano la deviazione standard dei tre estratti ottenuti per ogni tecnica di estrazione.&quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Alginato-like polimero extracellulare (ALE) di estrazione Dopo il pH delle EPS estratti con Na 2 CO 3 estrazione è stata regolata a 2,2, 63% del totale VS è stato precipitato. Il precipitato è ALE acida 25. La frazione residua é EPS che possono essere solubilizzata nelle condizioni di estrazione, ma non può formare un precipitato a pH 2.2. Test di formazione ionica idrogel granuli aerobici sono stati descritti come simile ad un idrogel. Il processo di granulazione è stato considerato come un fenomeno gelificante con glicosidi come agente gelificante 4,9,25,28. Normalmente, Ca 2+ è uno dei cationi più comuni nelle acque reflue. Inoltre, si lega facilmente con polisaccaridi acidi (ad esempio,alginati e acido poli-galatturonico), presumibilmente come una contro-ioni a mediare gelificazione 29. Così risultante in un idrogel ionicamente reticolato. È stato osservato che l&#39;aggiunta di ioni Ca 2+ può accelerare fanghi aerobici granulazione 30. Pertanto, Ca 2+ ENV (idrogel ionici) potrebbe svolgere un ruolo importante nella costruzione della struttura a matrice gel in fango granulare aerobico. A questo proposito, se i EPS estratti forma un idrogel ionico con ioni Ca 2+ potrebbe essere utilizzato come un test per verificare se l&#39;EPS estratto è un polimero strutturale contribuendo alla formazione della matrice gel in fango granulare aerobico 9. In questa ricerca, per l&#39;EPS estratti da AGS (Figura 3a) con vari metodi, solo le EPS estratti con Na 2 CO 3 svolgono la forma di una goccia in 2.5% (w / v) CaCl soluzione 2 e ha formato stabili perline idrogel ionici .Inoltre, l&#39;ALE sodio ottenuto da questa EPS da operazioni aggiuntive (ALE estrazione polimero, figura 3b) visualizzata la stessa proprietà pure. Il colore e la morfologia delle Ca 2+ perline gel -ALE (Figura 3c) sono simili a fango granulare aerobico (Figura 3a). Apparentemente, l&#39;EPS estratti con il metodo Na 2 CO 3 contribuisce alla formazione della matrice gel in fango granulare aerobico. ALE, che è un componente principale di questa EPS sono polimeri strutturali, in grado di formare un idrogel ionici. Test di stabilità dell&#39;idrogel ionica È stato osservato che durante l&#39;estrazione EPS, granuli aerobici mantenuto la loro forma sferica in EDTA, formaldeide + NaOH e formamide + NaOH (Figura 1). Per capire se i polimeri strutturali estratti svolgono un ruolo nella stabilità dei granuli, Ca 2+ -ALE perline eranotrattati esattamente come granuli aerobici durante l&#39;estrazione. È interessante notare che, Ca 2+ perline -ALE visualizzate le stabilità simile a quello di AGS (Figura 3d - 3F), vale a dire, Ca 2+ -ALE perline erano estremamente stabile in EDTA. C&#39;era poca quantità di ALE staccato dalla superficie di Ca 2+ perline -ALE (minuscolo fiocco marrone nella figura 3e e 3f), quando il Ca 2+ -ALE perline erano stati immersi in formaldeide + NaOH e formammide + NaOH per tre ore rispettivamente. Questa somiglianza in termini di stabilità tra Ca 2+ perline -ALE e granuli aerobici indica che ALE sono una parte degli importanti polimeri strutturali che formano la matrice di gel AGS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig3.jpg" /> Figura 3. granuli aerobici e ALE estratto. (A) granuli di pr acqua demineralizzataEstrazione ior. (B) ALE acido (estratto secondo i paragrafi 1.6 e 2) dopo centrifugazione a 4.000 xg e 4 ° C per 20 min. Risultati del test di stabilità dell&#39;idrogel ionica. (C) Ca 2+ -ALE-perline conservati in acqua demineralizzata per 4 ore a 4 ° C. (D) Ca 2+ -ALE-perline memorizzati nel 2% EDTA, per 3 ore a 4 ° C. (E) Ca 2+ -ALE-perline memorizzati nel formammide + NaOH per 4 ore a 4 ° C. (F) Ca 2+ -ALE-perline memorizzati nella formaldeide + NaOH per 4 ore a 4 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54534/54534fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Il protocollo prevede una metodologia per solubilizzare fango granulare aerobico per estrarre polimeri extracellulari alginato-like (ALE).

Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è illustrare una metodologia di estrazione per ottenere sostanze polimeriche extracellulari strutturali, o EPS, dai biofilm schiumosi, in particolare dal fango granulare aerobico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del fango granulare, come comprendere il processo di granulazione e analizzare la composizione delle EPS.Il vantaggio principale di questa tecnica è che la presenza di polimeri gelificanti nei EPS può essere testata in breve tempo. Centrifugare il fango granulare a 4.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti e decantare il soprannatante. Raccogliere i granuli nel pellet per l'estrazione.Riscaldare 150 millilitri di acqua di rubinetto in un becher di vetro da 1.000 millilitri su un agitatore magnetico fino a 80 gradi Celsius. Trasferire tre grammi di granuli in un matraccio baffato da 250 millilitri e portare il volume a 50 millilitri con acqua demineralizzata. Aggiungere 0,67 grammi di carbonato di sodio decaidrato nel matraccio per ottenere una concentrazione di carbonato di sodio dello 0,5% peso/volume.Posizionare il matraccio contenente la miscela nel bagno d'acqua. Coprire separatamente il matraccio e il bicchiere con carta d'alluminio, per prevenire l'evaporazione. Mescolare la miscela per 35 minuti a 400 giri al minuto e 80 gradi Celsius.Trasferire la miscela in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare il tubo contenente la miscela a 4.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Raccogliere il soprannatante e scartare il pellet.Il passaggio di dialisi è facoltativo per ottenere EPS strutturali dal fango granulare aerobico. Tuttavia, presenta diversi vantaggi descritti nel protocollo. Pipettare il surnatante in un sacchetto da dialisi con cutoff di peso molecolare di 3.500 dalton e dializzare per 24 ore contro 1000 ml di acqua ultrapura.Cambiare l'acqua della dialisi dopo 12 ore per potenziare l'effetto della dialisi stessa. Trasferire l'estratto dializzato in un becher di vetro da 250 ml e mescolare lentamente l'estrazione a 100 giri/min e a temperatura ambiente. Monitorare costantemente le variazioni di pH mediante un elettrodo per pH, aggiungendo contemporaneamente acido cloridrico 1 molare fino a raggiungere un pH finale di 2,2 ± 0,5 per ottenere l'ale in forma acida.Dopo aver regolato il pH a 2,2, trasferire l'estratto in un tubo da centrifuga da 50 ml e centrifugare a 4000 ×g e quattro gradi Celsius per venti minuti. Eliminare il soprannatante e raccogliere il pellet di aspetto gelatinoso. Il pellet gelatinoso è l'acido nella sua forma acida.Per ottenere la forma sodica dell'ale, aggiungere lentamente 0,5 moli di idrossido di sodio al gel, mescolando il gel lentamente con un bastoncino di vetro a mano fino a quando non si raggiunge un pH di 8,5. Utilizzando una pipetta di Pasteur, far cadere goccia a goccia l'estratto di ale sodico in una soluzione di cloruro di calcio. Se l’EPS estratto possiede proprietà gelificanti di idrogel ionico, si formeranno delle perle di forma sferica a goccia.In alternativa, se l’EPS estratto non possiede proprietà di formazione di idrogel ionici, l’estratto si disperderà nella soluzione di cloruro di calcio. Mantenere le perle di idrogel e la soluzione di cloruro di calcio per 30 minuti. Utilizzare un cucchiaio per rimuovere le perle di idrogel dalla soluzione di cloruro di calcio e trasferirle in una soluzione di EDTA.Conservare le microsfere di idrogel in 10 ml di soluzione di EDTA per tre ore a quattro gradi Celsius. Questo test illustra un esempio dei test di stabilità descritti nel protocollo. Monitorare la presenza di disintegrazione visibile delle microsfere durante la conservazione, per valutare se queste ultime possono resistere a tali condizioni.Se l'estrazione ha avuto successo, il fango granulare aerobico verrà solubilizzato dopo il passaggio di estrazione alcalina e verrà ottenuto un pellet dopo l'acidificazione e la centrifugazione dell'EPS estratto. Se l'EPS estratto è costituito da EPS strutturali e ha la capacità di formare idrogeli con ioni calcio, si formeranno perle di gel quando l'EPS estratto viene gocciolato nella soluzione di calcio. Se invece vengono estratti EPS privi di questa capacità di formare gel, la soluzione di EPS si disperderà nella soluzione di calcio.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe essere in grado di eseguire l'estrazione di EPS strutturali dal fango granulare aerobico. Inoltre, si dovrebbe essere in grado di verificare la capacità gelificante degli EPS ottenuti in presenza di ioni calcio. Abbiamo scelto di mostrare questa metodologia di estrazione per illustrare l'impatto della tecnica di estrazione sugli EPS ottenuti dal fango granulare aerobico.Inoltre, volevamo dimostrare che nessuna tecnica di estrazione dell'EPS è universalmente applicabile.

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Presentiamo un metodo modulare automatizzato ad alto rendimento per l'identificazione e la caratterizzazione di esopolisaccaridi microbici su piccola scala. Questo metodo combina una rapida preselezione per analizzare la quantità totale di polisaccaridi secreti con un'impronta digitale dettagliata dei carboidrati per consentire lo screening rapido di ceppi batterici appena isolati o di intere collezioni di ceppi.

Automatizzata Modular High Throughput Screening esopolisaccaride piattaforma Accoppiato con altamente sensibile Analisi Carboidrati impronte digitali

Viene presentato un nuovo progetto di reattore, denominato bioreattore ad alta densità (HDBR), per la coltivazione e lo studio di comunità microbiche ad alta densità. Qui, l'HDBR viene applicato con successo in una configurazione di fotobioreattore (PBR) per lo studio del metabolismo dell'azoto da parte di una comunità di alghe miste ad alta densità.

Un bioreattore Novel per l&#39;alta densità di coltivazione diverse comunità microbiche

Per ottenere informazioni di base sull'assorbimento e il riciclaggio dell'oro dai sistemi acquosi, è stata studiata l'interazione delle nanoparticelle Au(III) e Au(0) sulle proteine dello strato S. L'assorbimento dei polimeri proteici è stato studiato mediante ICP-MS e quello dei monostrati proteici mediante QCM-D. Il successivo AFM consente l'imaging delle nanostrutture.

Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS e AFM come strumenti di studi Biomolecule metallo

L'obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Qui, vengono descritti i protocolli per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati cianobatterici e l'isolamento dei loro esoproteomi. Entrambe le procedure incorporano i passaggi chiave per ottenere polimeri o proteine con gradi di elevata purezza che possono essere utilizzati per ulteriori analisi o applicazioni. Possono anche essere facilmente adattati in base alle esigenze specifiche dell'utente.

Guardando verso l'esterno: Isolamento dei polimeri e delle proteine di carboidrati rilasciati in cianobatteria

Viene descritto un protocollo per la preparazione di un semplice ecosistema modello che ricrea il gradiente di contrasto metano-ossigeno presente nell'habitat naturale dei batteri aerobi ossidanti il metano, consentendo lo studio della loro fisiologia in un contesto spazialmente risolto. Vengono inoltre descritte le modifiche ai comuni saggi biochimici per l'uso con l'ecosistema modello basato sull'agarosio.

Ecosistema modello basato sull'agarosio per la coltivazione di metanotrofi in un gradiente contatore metano-ossigeno

Questo protocollo presenta un metodo scalabile per convertire i rifiuti alimentari in bioplastiche biodegradabili di poliidrossialcanoato (PHA). Utilizza la digestione anaerobica arrestata per il pretrattamento dei rifiuti alimentari, la fermentazione microbica alofila per la biosintesi del PHA e un processo a valle privo di sostanze chimiche per il recupero del PHA.

Approccio scalabile passo dopo passo alla produzione sostenibile di bioplastica dai rifiuti alimentari

Scopri l'estrazione di polimeri extracellulari strutturali da fanghi granulari aerobici. Questo metodo permette di isolare EPS e testarne le proprietà gelificanti con ioni calcio per applicazioni nel trattamento delle acque reflue.

Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi

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