Name: Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine magnetica A e proteine G perline (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Impara a etichettare anticorpi con coloranti fluorescenti utilizzando perline magnetiche con proteine A o G direttamente dal mezzo cellulare. Questo metodo ottimizza la chimica di etichettatura senza necessità di purificazione.

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1. anticorpo di cattura su Perle G ad alta capacità di proteine ​​magnetica A o proteine ​​magnetica <ol><li> Uniformemente ri-sospendere sfere magnetiche di agitando delicatamente. Mantenere la divisa di sospensione quando si dispensa perle. </li><li> Aggiungere 50 ml di perline liquami in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il buffer di stoccaggio. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone vincolante. </li><li> Mescolare e posizionare nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il tampone di legame. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di campione contenente 50-100 mg di anticorpi ai talloni. I campioni possono essere purificati anticorpi o anticorpi in supporti delle cellule. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone vincolante / lavaggio. Ripetere questo sTEP per un totale di due lavaggi. </li><li> Procedere alla sezione 2 di anticorpi di etichette che utilizzano la chimica ammina o alla Sezione 3 per gli anticorpi etichetta con tiolo chimica. </li></ol> 2. Anticorpo Labeling Utilizzando Amine Chimica <ol><li> Coniugato anticorpo <ol><li> Aggiungere 100 ml di tampone ammina coniugazione ai talloni. </li><li> Sciogliere i coloranti fluorescenti ammina reattiva (AlexaFluor 532-SE): 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO) a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di tintura amminico reattivo per 100 mg di anticorpo. Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in suspension. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere e gettare tampone di legame / lavaggio. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi. </li></ol></li><li> anticorpo di recupero <ol><li> Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni. </li><li> Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di tampone di neutralizzazione. </li><li> Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti. </li><li> Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4. </li></ol></li></ol> 3. Anticorpo etichettatura Utilizzando Thiol Chimica <ol><li> anticorpo Riduzione <ol><li> Aggiungere 250 microlitridi tampone coniugazione tiolo e mix. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo. </li><li> Aggiungere ditiotreitolo (DTT) ad una concentrazione finale di 2,5 mM. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e scartare il buffer. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo. </li></ol></li><li> Coniugato anticorpo <ol><li> Sciogliere il colorante tiolo reattivo a 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di DMSO a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di tintura tiolo reattivo per 100 mg di anti-corpo. Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi. </li><li> Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Posizionare nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi. </li></ol></li><li> Elute anticorpo <ol><li> Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni. </li><li> Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione. </li><li> Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di neutBuffer ralization. </li><li> Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti. </li><li> Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4. </li></ol></li></ol> Rapporto 4. Calcolare Dye-to-anticorpo <ol><li> Misurare l&#39;assorbanza del coniugato anticorpo-dye a 280 nm (A280) e alla λmax per il colorante (Amax). </li><li> Calcolare la concentrazione di anticorpi: Anticorpo Concentrazione (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1.4 dove CF = fattore di correzione del colorante (fornita dal produttore). </li><li> Calcolare il rapporto dye-to-anticorpi: Dye-to-anticorpo Ratio (DAR) = (A max × 150.000) / Ab Concentrazione (mg / ml) × ε colorante dove, tintura ε = coefficiente di estinzione del colorante al massimo assorbimento e il peso molecolare di anticorpo = 150.000 Da. </li></ol>

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<li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li>
<li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding%2C+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li>
</ol>

Gli autori sono dipendenti di Promega Corporation.

L&#39;obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo per etichettare anticorpi, presenti nei mezzi di cella a basse concentrazioni, con una varietà di piccole molecole. Tale metodo permette un gran numero di anticorpi, durante le prime fasi di scoperta di anticorpi, etichettato con piccole molecole e schermati con un saggio biologicamente rilevante. Uno di questi test è il test degli anticorpi internalizzazione mediata dai recettori in cui internalizzazione può variare tra gli anticorpi anche con affinità simili...

Gli anticorpi marcati con piccole molecole sono forse i reagenti più utilizzati in biologia 1,2. Anticorpi marcati con coloranti fluorescenti e biotina sono ampiamente utilizzati nella diagnostica per immagini, immunodosaggi, citometria a flusso, Western blot e immunoprecipitazione tra le altre applicazioni 3-6. Anticorpi radiomarcati 3,7 trovano ampio utilizzo nella diagnostica per immagini e la terapia, gli anticorpi marcati con farmaci citotossici (ADC) stanno offrendo nuove opzioni per il trattamento dei tumori, e due ADC sono già stati approvati per uso terapeutico 8. Nonostante il loro ampio uso, le modalità di etichettatura anticorpi sono rimasti sorprendentemente invariate e di solito sono molteplici reazioni e dissalazione passi 9-12. metodi di soluzione funzionano molto bene nei casi in cui deve essere etichettato solo pochi anticorpi e sono disponibili in forma altamente purificata ad alta concentrazione e in volumi sufficienti. Tuttavia, per le applicazioni più recenti come ADC, vi è unnecessario etichettare anticorpi nella fase ibridoma presto in modo che possano essere sottoposti a screening per proprietà biologicamente rilevanti, ad esempio, recettore-mediata anticorpo internalizzazione 13-16. Nella fase ibridoma, volumi di campione sono limitati, gli anticorpi sono espressi a basse concentrazioni e un numero di campioni sono grandi, quindi metodi di etichettatura di soluzioni basate non sono adatti. Al fine di semplificare e migliorare il throughput dei tradizionali metodi di etichettatura degli anticorpi, alcuni approcci alternativi sono stati proposti 17,18. Un approccio consiste nell&#39;utilizzare Protein amagnetico A perline affinità confezionati in piccole colonne di catturare anticorpi seguita dalla reazione di marcatura ed eluizione di proteina marcata e purificata. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare anticorpi direttamente dal supporto cellulare, tuttavia, l&#39;uso di colonne può essere laborioso. Un metodo basato branello magnetico è stato recentemente riportato 19 che elimina l&#39;uso di colonne e produttività ma a causa miglioraall&#39;anticorpo limitata capacità delle perline vincolante, solo nanogrammo a basse quantità microgrammi di anticorpi potrebbe essere etichettato. Recentemente abbiamo sviluppato e usato ad alta capacità magnetica Proteina A e Proteine ​​perline G (&gt; 20 mg di IgG umana / ml di perline stanziali) di etichettare gli anticorpi presenti nei mezzi di cella con piccole molecole 20. L&#39;elevata capacità delle perle permette decine a centinaia di microgrammi di anticorpo da etichettare convenientemente e la risposta magnetica rapida delle perline semplifica la gestione e il trattamento di un gran numero di campioni in parallelo. Utilizzando coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, si dimostra che il metodo è compatibile con ammina e tiolo etichettatura chimica e offre alti recuperi di anticorpi marcati e molto puri. Questo protocollo e il video di accompagnamento descrivono l&#39;etichettatura on-tallone di anticorpi di topo presenti nei mezzi di comunicazione cellulari che utilizzano proteine ​​magnetica A e G proteina perline. Il protocollo èsuddiviso in quattro sezioni: Sezione 1 descrive la cattura di anticorpi sul tallone da campioni biologici. Dopo la cattura, l&#39;etichettatura di anticorpi con colorante fluorescente che utilizzano la chimica ammina o che utilizzano la chimica tiolo è descritta nelle sezioni 2 e la sezione 3, rispettivamente. Infine, la sezione 4 descrive il metodo per il calcolo della concentrazione di anticorpo e il colorante rapporto anticorpo.

<table><tbody><tr><td>Magne Protein A Perline Promega</td><td>Corporation</td><td> G8781</td><td></td></tr><tr><td>Magne Protein G Beads</td><td>Promega Corporation&nbsp;</td><td>&nbsp; G7471</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-SE (Estere succinimidilico)</td><td>Life Technologies</td><td>A20001</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td><td>Life Technologies</td><td>A10255</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-ME (Maleimmide)</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina-ME (Maleimmide)</td><td>Life Technologies</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Promega</td><td>Z5332</td><td></td></tr></tbody></table>

anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica a e proteine ​​g perline

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Anticorpi marcati con piccole molecole come coloranti fluorescenti, farmaci citotossici, e traccianti radioattivi sono strumenti essenziali nella ricerca biomedica, immunodiagnostica e più recentemente come agenti terapeutici. I metodi tradizionali per gli anticorpi di etichettatura con piccole molecole richiedono anticorpi purificati in concentrazione relativamente alta, coinvolgono più passaggi dialisi ed hanno limitato il throughput. Tuttavia, diverse applicazioni, tra cui il campo di anticorpi coniugati farmaco (ADC), potranno beneficiare di nuovi metodi che consentano l&#39;etichettatura di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Tali metodi possono consentire anticorpi proiettati in saggi biologicamente rilevanti, ad esempio, il dosaggio degli anticorpi internalizzazione mediata da recettori nel caso di ADC. Qui, descriviamo un (metodo on-tallone) metodo che consente l&#39;etichettatura di piccole quantità di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Questo approccio utilizza ad alta capacità magnetica proteina A e la proteina G perline affinità per catturare gli anticorpidal supporto di cellule seguita da marcatura con piccole molecole utilizzando sia ammina o chimica tiolo e successiva eluizione degli anticorpi marcati. Prendendo coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, dimostriamo l&#39;etichettatura on-tallone di tre diversi anticorpi di topo direttamente dal supporto di cellule utilizzando sia ammina e tiolo chimica etichettatura. L&#39;elevata affinità di legame di anticorpi anti proteine ​​A e proteine ​​G garantisce elevati recuperi, nonché di elevata purezza degli anticorpi marcati. Inoltre, l&#39;uso di sfere magnetiche consente a più campioni vengano maneggiati manualmente, migliorando così significativamente il throughput di etichettatura.

Uno schema per l&#39;etichettatura anticorpi con piccole molecole con elevata capacità Protein magnetico A e proteina G perline è mostrato in Figura 1. Anticorpi catturato sulla proteina magnetica perline G possono essere etichettati con piccole molecole, per coloranti fluorescenti esempio, utilizzando la chimica ammina quali etichette ammine primarie degli acidi lisina amminoacidi o utilizzando la chimica tiolo che le etichette ai tioli ridotti nella regione cerniera de...

Il metodo on-tallone per etichettare anticorpi con piccole molecole permette l&#39;etichettatura di una piccola quantità di anticorpi direttamente dal supporto cellulare. Questo metodo è compatibile con ammina e chimica tiolo, e può gestire campioni multipli in parallelo, manualmente o utilizzando piattaforme automatizzate.

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica A e proteine ​​G perline

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

L'obiettivo generale di questo metodo è etichettare anticorpi con coloranti fluorescenti a partire da campioni purificati o direttamente dal mezzo cellulare, utilizzando perle magnetiche di proteina A o G. Questo metodo può essere impiegato per ottimizzare la chimica di etichettatura anche di piccole quantità di anticorpi presenti nel mezzo cellulare, consentendo un migliore utilizzo successivo degli anticorpi in applicazioni a valle.I principali vantaggi di questa tecnica sono che gli anticorpi non richiedono purificazione, possono essere utilizzate chimiche amminiche o a base di tioli, e il metodo può essere automatizzato o eseguito manualmente. Iniziare risospendendo uniformemente le perle con un leggero movimento di agitazione. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di perle in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitro.Quindi, posizionare il tubo su un supporto magnetico. Dopo 10 secondi, sostituire con attenzione il buffer di conservazione con 250 microlitri di buffer di legame per l'anticorpo e mescolare bene le perle. Dopo altri 10 secondi, sostituire con attenzione il buffer di legame con un millilitro dell'anticorpo di interesse.E mescolare il campione per 60 minuti a t

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Questo video mostra un metodo per rilevare i ceppi cianobatterici in un campione ambientale utilizzando un chip di microarray di anticorpi. I campioni che trasportano vari batteri interagiscono con gli anticorpi stampati e l'immunocolorazione con anticorpi anti-ceppo cianobatterico marcati con fluorofori rivela la presenza di specifici ceppi cianobatterici attraverso la fluorescenza in punti distinti.

Una tecnica per rilevare i ceppi cianobatterici utilizzando un chip di microarray di anticorpi

Questo video mostra la rilevazione quantitativa multiplex di batteri utilizzando microsfere di polistirene magnetico carbossilato colorate in set distinti. La procedura comprende la formazione di complessi perline-batteri, la separazione magnetica e l'analisi basata sul flusso, consentendo una quantificazione precisa e simultanea di più batteri nello stesso pozzetto di reazione.

Rilevazione quantitativa multiplexata di batteri mediante microsfere magnetiche marcate con colorante

Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l'anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l'incubazione.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Qui, presentiamo un protocollo per introdurre sonde chimiche sito-specifiche in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide, e successivamente accoppiando l'azide con una sonda chimica mediante cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo (SPAAC).

Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

La traduzione della purificazione dell'affinità dei ribosomi (TRAP) consente un isolamento rapido ed efficiente dell'mRNA di traslazione specifico del tipo di cellula. Qui, dimostriamo un metodo che combina l'iniezione idrodinamica della vena della coda in un modello murino di ripopolamento e del trap per esaminare il profilo di espressione degli epatociti ripopolamento.

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Questo protocollo descrive la marcatura a singolo anticorpo (SAL) per risolvere l'organizzazione spaziale su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica. Sfruttando le interazioni cumulative anticorpo-epitopo a livello di singola molecola, il SAL di membrana (mSAL) mappa le distribuzioni locali degli epitopi catturando contemporaneamente il comportamento di legame degli anticorpi nell'ambiente cellulare nativo.

Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l'Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l'espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l'individuazione specifica di replicare l'HIV nelle cellule viventi attraverso l'espressione di GFP.

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Impara a etichettare anticorpi con coloranti fluorescenti utilizzando perline magnetiche con proteine A o G direttamente dal mezzo cellulare. Questo metodo ottimizza la chimica di etichettatura senza necessità di purificazione.

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica A e proteine ​​G perline

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