Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica A e proteine ​​G perline

L'obiettivo generale di questo metodo è etichettare anticorpi con coloranti fluorescenti a partire da campioni purificati o direttamente dal mezzo cellulare, utilizzando perle magnetiche di proteina A o G. Questo metodo può essere impiegato per ottimizzare la chimica di etichettatura anche di piccole quantità di anticorpi presenti nel mezzo cellulare, consentendo un migliore utilizzo successivo degli anticorpi in applicazioni a valle.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che gli anticorpi non richiedono purificazione, possono essere utilizzate chimiche amminiche o a base di tioli, e il metodo può essere automatizzato o eseguito manualmente. Iniziare risospendendo uniformemente le perle con un leggero movimento di agitazione. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di perle in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitro.

Quindi, posizionare il tubo su un supporto magnetico. Dopo 10 secondi, sostituire con attenzione il buffer di conservazione con 250 microlitri di buffer di legame per l'anticorpo e mescolare bene le perle. Dopo altri 10 secondi, sostituire con attenzione il buffer di legame con un millilitro dell'anticorpo di interesse.

E mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, riposizionare i tubi sul magnete ed eliminare il soprannatante quando le perle si saranno spostate ai lati del tubo. Successivamente, risciacquare la miscela di perle e anticorpo con due lavaggi di 10 secondi ciascuno, utilizzando 250 microlitri di buffer di lavaggio per il legame dell'anticorpo per ogni lavaggio.

Per etichettare gli anticorpi utilizzando la chimica amminica, dopo il secondo lavaggio, sostituire il buffer di lavaggio con 100 microlitri di buffer di coniugazione amminico e aggiungere 2,5 microlitri di colorante reattivo verso le ammine, appena preparato, per ogni 100 microgrammi di anticorpo. Vortexare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente per mantenere le microsfere in sospensione durante l'etichettatura. Successivamente, riposizionare il tubo sul magnete per 10 secondi ed eliminare il sopranatante.

Lavare le perle due volte con il buffer di lavaggio per il legame degli anticorpi, come appena dimostrato. Quindi, sostituire il buffer di lavaggio con 50 microlitri di buffer di eluizione e mescolare le perle per cinque minuti. Rimettere il tubo sul magnete per 10 secondi e trasferire l'anticorpo eluito in un nuovo tubo microcentrifuga contenente cinque microlitri di buffer di neutralizzazione.

Eluire nuovamente l'anticorpo, come appena dimostrato, raccogliendo i campioni eluiti. Quindi, misurare l'assorbanza del coniugato anticorpo-colorante a 280 nanometri e alla lambda max del colorante. Per etichettare gli anticorpi mediante chimica dei tioli, dopo il secondo lavaggio, sostituire il tampone di lavaggio con 250 microlitri di tampone per la coniugazione dei tioli e mescolare le perle con pipettaggio delicato.

Dopo 10 secondi, lavare le perle due volte con il tampone di lavaggio per il legame dell'anticorpo. Quindi, sostituire il tampone di lavaggio con 100 microlitri di tampone per la coniugazione dei tioli e aggiungere DTT fino a una concentrazione finale di 2,5 millimolare. Mescolare le perle per altri 60 minuti.

Quindi, riportare le perle sul magnete per 10 secondi e scartare il tampone. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di tampone per la coniugazione con tiolo alle perle, mescolando delicatamente. Dopo 10 secondi, lavare le perle due volte con il tampone di lavaggio per il legame dell'anticorpo, sostituendo il secondo lavaggio con 100 microlitri di tampone per la coniugazione con tiolo fresco.

Ora, aggiungere 2,5 µL di colorante reattivo ai tioli appena preparato per ogni 100 µg di anticorpo e mescolare le microsfere per 60 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, riposizionare il tubo sul magnete per 10 secondi. Sostituire quindi il soprannatante con 250 µL di buffer fresco per la coniugazione tiolica, mescolando delicatamente.

Dopo 10 secondi, lavare le perle due volte. Quindi, sostituire il buffer di lavaggio con 50 microlitri di buffer di eluizione ed eluire l'anticorpo coniugato due volte, come appena dimostrato. Successivamente, misurare l'assorbanza del coniugato anticorpo-colorante a 280 nanometri e a lambda max per il colorante.

L'elevata affinità tra gli anticorpi e la Proteina G, l'elevata affinità del magnete per le microsfere e l'ottimizzazione del metodo prima della purificazione delle microsfere determinano una perdita nominalmente trascurabile di anticorpo durante la reazione di marcatura, come dimostrato dall'efficiente recupero di tre diversi isotipi di anticorpi murini dopo la marcatura fluorescente doppia rispetto alla semplice purificazione. Questo recupero è evidente anche nei gel di Coomassie, dove le basse proprietà di legame non specifico delle microsfere magnetiche di Proteina G determinano la presenza di catene pesanti e leggere altamente purificate e marcate con doppia fluorescenza. La marcatura in fase solida con microsfere magnetiche di Proteina A è inoltre compatibile con diversi coloranti fluorescenti, consentendo un elevato recupero e buoni rapporti tra colorante e anticorpo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due o tre ore, se eseguita correttamente. Permette di gestire manualmente più campioni o di utilizzare una piattaforma automatizzata per un rendimento migliore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre in sospensione le perle magnetiche.

Scegliere il volume appropriato di microsferette magnetiche per il campione. Ottimizzare la quantità di colorante fluorescente per l'anticorpo di interesse. Dopo questa procedura, gli anticorpi marcati devono essere testati per determinarne la funzionalità mediante saggi biologici pertinenti, come ELISA, facts o saggi basati su cellule.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come etichettare anticorpi purificati e non purificati con marcatori fluorescenti o altre molecole piccole, come la biotina o farmaci citotossici, utilizzando microsferette magnetiche di Proteina A o G.