Name: Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri un test al tornasole modificato per rilevare E. coli utilizzando un DNAzima specifico e una piattaforma di trasduzione del segnale a base di urease. Questo metodo semplice e rapido offre un cambiamento di colore visibile per applicazioni diagnostiche point-of-care.

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Il finanziamento per questo progetto di ricerca è stato fornito dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) tramite una sovvenzione per la scoperta a YL.

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
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<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
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<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La definizione dell&#39;azione dell&#39;attività RNA clivaggio di un DNAzyme batterio sensibile ad un banco di prova è reso possibile attraverso l&#39;uso di ureasi e separazione magnetica, come illustrato nella figura 1. Sebbene la dimostrazione della cartina tornasole modificati per rivelare batterica è fatto con una E. coli-dipendente RNA-scissione DNAzyme, 5,19,20 il design può essere generalmente esteso per qualsiasi DNAzyme RNA-scissione. Data la grande disponibilità di DNAzimi...

I patogeni batterici sono una delle principali cause di morbilità e mortalità globale. Focolai di infezioni nosocomiali, agenti patogeni di origine alimentare e contaminanti batterici nell'ambiente rappresentano una minaccia seria e continua per la salute e la sicurezza pubblica. Per prevenire questi focolai, sono necessari strumenti efficaci che consentano di rilevare gli agenti patogeni in modo tempestivo in una varietà di contesti. Test semplici ma comunque efficaci, portatili ed economici sono molto ambiti, soprattutto nelle regioni che sono suscettibili alle epidemie ma non possono permettersi costose strutture di test. 1-3 Sebbene esistano una moltitudine di metodi per rilevare i batteri, molti di essi non sono adatti come strumenti di screening o di test in loco perché richiedono lunghi tempi di analisi, strumenti costosi e procedure di analisi complicate. 
I test colorimetrici sono particolarmente interessanti per le applicazioni point-of-care o sul campo, poiché i cambiamenti di colore possono essere facilmente rilevati ad occhio nudo. La cartina di tornasole per il pH è semplice, rapida ed efficace. Sebbene sia una tecnologia molto antica, è ancora oggi ampiamente utilizzata per la sua semplicità ed efficacia. Sorprendentemente, questo semplice test non era mai stato modificato per ottenere la rilevazione di altri analiti prima che avessimo recentemente sviluppato un approccio per modificare questo test per il test di E. coli. 4
La cartina di tornasole estesa per E. coli impiega tre componenti aggiuntivi: un DNAzima (EC1) attivato da E. coli, 5 ureasi e perline magnetiche. I DNAzimi si riferiscono a molecole di DNA sintetiche a singolo filamento con attività catalitica. 6 Possono essere isolati da pool di DNA a sequenza casuale utilizzando la selezione in vitro. 7,8 Sono altamente stabili e possono essere prodotti in modo economico utilizzando la sintesi automatizzata del DNA ad alta efficienza. 9 Per questi motivi, i DNAzimi, in particolare i DNAzimi che scindono l'RNA, sono stati ampiamente esaminati per applicazioni di biorilevamento. I sensori DNAzyme 6,10,11 che decidono l'RNA sono stati sviluppati per rilevare ioni metallici,12-16 piccole molecole,17,18 patogeni batterici5,19-21 e cellule tumorali. 22 Data la grande disponibilità di DNAzimi che scindono l'RNA indotti dal bersaglio, qualsiasi test che utilizza un DNAzima può essere potenzialmente ampliato per rilevare una vasta gamma di analiti.
L'ureasi è stata scelta per la sua capacità di idrolizzare l'urea in ammoniaca,23,24 con conseguente aumento del pH. L'ureasi è anche altamente efficiente, stabile e suscettibile di coniugazione con altre biomolecole. Pertanto, abbiamo ipotizzato che un coniugato di un DNAzima di scissione dell'RNA con ureasi consentirebbe l'uso della cartina di tornasole per la rilevazione di altri bersagli. 5
L'azione del DNAzima che scinde l'RNA è trasmessa all'aumento del pH mediato dall'ureasi attraverso l'uso di perle magnetiche che vengono immobilizzate con il coniugato DNAzyme-ureasi. Poiché l'attività del DNAzima in esame è strettamente dipendente da E. coli, la presenza di questo batterio nella soluzione di prova comporterà il rilascio di ureasi dalle perle magnetiche alla soluzione, che viene poi prelevata e utilizzata per idrolizzare l'urea in una soluzione reporter che contiene un colorante sensibile al pH. Il risultato finale di questa procedura è un cambiamento di colore che può essere convenientemente segnalato dalla carta colorante o pH.

<table><tbody><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Pellet di idrossido di sodio (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilammide/bisacrilammide (29:1) soluzione</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xilencianolo FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% sodio dodecil solfato</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (II) esaidrato</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina Trifospatica (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametileneetilendiammina (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% Persolfato di ammonio (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>ureasi</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04% Rosso fenolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone di reazione della polinucleotide chinasi T4</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone di reazione della DNA ligasi T4</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi (5 U/&#956; l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Brodo</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotide chinasi (10 U/&#956; l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Lastre di vetro</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>distanziatori spessore 0,75 mm</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>pettine a 12 pozzetti</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lampada UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A Piastra</td><td></td></tr><tr><td>metallica</td><td>CBS scientifico</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO filtri centrifughi</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack di separazione magnetica</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfughe,</td><td>Sarstedt</td><td>72,69</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa (0,22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per coltura da 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Lavaggio ad ultrasuoni</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

colorimetrico rilevamento di batteri uso tornasole test

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Ci sono crescenti richieste di metodi semplici ma comunque efficaci che possono essere utilizzati per rilevare agenti patogeni specifici per applicazioni point-of-care o sul campo. Tali metodi devono essere facili da usare e produrre risultati affidabili che possano essere facilmente interpretati sia dagli specialisti che dai non professionisti. La cartina di tornasole per il pH è semplice, rapida ed efficace in quanto riporta il pH di un campione di prova tramite un semplice cambiamento di colore. Abbiamo sviluppato un approccio per sfruttare la cartina di tornasole per la rilevazione batterica. Il metodo sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA specifico del batterio per ottenere due funzioni: riconoscere un batterio di interesse e fornire un meccanismo per controllare l'attività dell'ureasi. Attraverso l'uso di perle magnetiche immobilizzate con un coniugato DNAzima-ureasi, la presenza di batteri in un campione di prova viene trasmessa al rilascio di ureasi dalle perle alla soluzione. L'ureasi rilasciata viene trasferita in una soluzione di prova per idrolizzare l'urea in ammoniaca, determinando un aumento del pH che può essere visualizzato utilizzando la classica cartina di tornasole.

Il principio della prova del nove batterica è spiegato in Figura 1 Il test utilizza tre materiali principali:. Un DNAzyme RNA-scissione che viene attivato da un batterio specifico, ureasi e perline magnetiche. Il DNAzyme viene utilizzato come elemento di riconoscimento molecolare per ottenere un rilevamento altamente specifica di un batterio di interesse. Ureasi e sfere magnetiche sono utilizzati per ottenere trasduzione del segnale delle attività RNA-scissione del DNAzy...

Descriviamo un protocollo per la rilevazione colorimetrica di E. coli utilizzando una cartina di tornasole modificata che sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA, l'ureasi e le perle magnetiche.

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare un semplice test della cartina tornasole modificato per la rilevazione batterica. Questo metodo descrive come un'enzima DNA che taglia l'RNA attivata da E.coli possa essere abbinata a una piattaforma di trasduzione del segnale basata sulla ureasi per generare un cambiamento di colore in risposta a E.coli. I due principali vantaggi di questa tecnica sono la semplicità del test e la sua applicabilità ad altri enzimi DNA che tagliano l'RNA e che rispondono a diversi analiti.La procedura sarà dimostrata da Seperh Manchehry e Dingran Chang, studenti laureati del laboratorio del dottor Yingfu Li presso la McMaster University. Dopo aver preparato reagenti e tamponi secondo il protocollo indicato nel testo, preparare una soluzione madre di succinimidil 4-cicloesano-1-carbossilato, o SMCC, sciogliendo un milligrammo di SMCC in 676 microlitri di DMSO. Vortexare e mantenere sul ghiaccio fino all'uso.Sciogliere un milligrammo di ureasi in un millilitro di PBS 1x e mantenere la soluzione sul ghiaccio fino all'uso. Per sintetizzare il DNA dell'ureasi, o UrDNA, aggiungere 10 microlitri di LD1 100 micromolare in un tubo microcentrifuga da 2,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 140 microlitri di acqua bidistillata e 40 microlitri di PBS 10x e vortexare.Successivamente, aggiungere 80,5 microlitri di soluzione madre di SMCC e 159,5 microlitri di DMSO. Quindi, vortexare nuovamente e utilizzare una centrifuga da banco per una breve centrifugazione. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius in un incubatore o in un blocco termico per 60 minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere al tubo 200 microlitri di PBS 1x, 60 microlitri di acetato di sodio tre molare e 1,5 millilitri di etanolo freddo al 100%. Mescolare mediante vortex e incubare la reazione a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la soluzione a 20.000 × g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Quindi, rimuovere il soprannatante e asciugare il pellet sotto vuoto. Al pellet essiccato, aggiungere 400 microlitri di soluzione stock di ureasi e incubare a temperatura ambiente per 5 ore. Trasferire 200 microlitri di coniugato grezzo in una colonna filtrante centrifuga prelavata con cutoff di peso molecolare di 100.000.Centrifugare la colonna a 14.000 × g per cinque minuti. Trasferire i restanti 200 microlitri di coniugato grezzo sulla colonna e centrifugare a 14.000 × g per cinque minuti. Successivamente, rimuovere la colonna e posizionarla capovolta in un nuovo tubo di raccolta microcentrifuga da due millilitri.Centrifugare la colonna capovolta e il tubo a 1.000 ×g per due minuti. Dopo aver rimosso il tubo di raccolta, aggiungere 30 microlitri di PBS 1x sulla colonna centrifuga per lavare la membrana e recuperare ulteriormente i coniugati. Capovolgere nuovamente la colonna e riposizionarla nel tubo di raccolta.Centrifugare la colonna a 1.000 ×g per due minuti. Rimuovere e smaltire la colonna. Conservare l'UrDNA a quattro gradi Celsius fino all'uso.Per assemblare un DNAzima attivato da E.coli, o EC1, e l'UrDNA su microsferette magnetiche, agitare bene la soluzione madre di microsferette e trasferire 100 microlitri di sospensione di microsferette in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, posizionare la provetta su un supporto per rack magnetico per isolare le microsferette. Rimuovere il sopranatante mediante pipetta e aggiungere 150 microlitri di buffer di legame, o BB, alla provetta.Rimuovere il tubo dal supporto e battere delicatamente sul tubo per ri-sospendere le perle in una soluzione omogenea. Dopo aver ripetuto il lavaggio con BB altre due volte con le perle in sospensione in BB, aggiungere 10 microlitri di EC1 a 10 micromolare. Mescolare con cura battendo sul tubo.Incubare la soluzione con agitazione delicata per 30 minuti. Per evitare l'aggregazione delle perle, battere leggermente sul tubo ogni due o tre minuti. Successivamente, posizionare nuovamente il tubo microcentrifuga sul supporto magnetico per isolare le perle ed eliminare il soprannatante mediante pipettaggio.Quindi, utilizzare 150 microlitri di BB per lavare le perle per tre volte. Al termine del lavaggio, sospendere le perle in un volume totale di 150 microlitri di BB. A questa soluzione, aggiungere 15 microlitri di UrDNA e riscaldare il campione a 45 gradi Celsius per due minuti, quindi raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e incubare per due ore. Posizionare nuovamente la provetta microcentrifuga sul supporto magnetico per isolare le perle ed eliminare il soprannatante mediante pipettaggio.Aggiungere 100 microlitri di buffer di reazione, o RB, quindi rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere delicatamente le perle. Dopo aver preparato le cellule di E.coli secondo il protocollo indicato nel testo, prerisciacquare un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri aggiungendo e vortexando 100 microlitri di RB. Successivamente, scartare il buffer. Aggiungere 15 microlitri di EC1 assemblato al tubo lavato, quindi posizionare il tubo sul supporto magnetico ed aspirare il sopranatante.Rimuovere il tubo dal portatubo, aggiungere 100 microlitri di RB e risospendere attentamente le perle magnetiche. Dopo aver lavato le perle con RB per altre due volte e aver rimosso l'RB, aggiungere 10 microlitri del campione di E.coli al tubo e mescolare delicatamente il contenuto battendo leggermente sul tubo. Quindi, incubare la reazione a temperatura ambiente per un'ora.Dopo l'incubazione, aggiungere 90 microlitri di acqua bidistillata e posizionare la provetta sul supporto magnetico. Dopo circa tre minuti di separazione magnetica, trasferire con attenzione 85 microlitri del sopranatante in una provetta microcentrifuga da 0,5 millilitri. È molto importante prelevare la soluzione con attenzione, evitando di aspirare le perle magnetiche.Queste perle sono caricate con ureasi e produrranno un segnale falso positivo. Aggiungere 15 microlitri di rosso fenolo 0,04% e 100 microlitri di soluzione substrato. Successivamente, scattare fotografie a intervalli di tempo specifici per registrare il cambiamento di colore.Il colore iniziale del test della cartina tornasole deve essere giallo, a indicare un pH della soluzione inferiore a 5,5. Se necessario, il pH iniziale del test della cartina tornasole può essere regolato con un tampone debole, come un tampone di acetato di sodio uno millimolare a pH cinque. Questa figura mostra i risultati del test della cartina tornasole batterico, in cui è stato utilizzato come DNAzima EC1, un DNAzima che taglia l'RNA attivato da E.coli, e come indicatore di pH è stato utilizzato il rosso di fenolo.Come mostrato dall'assenza di cambiamento di colore in mancanza di E.coli, EC1 è altamente specifico e mostra un'attività minima verso altri batteri. L'intensità del cambiamento di colore dipende sia dal numero di cellule di E.coli utilizzate nel passaggio di attivazione del DNAzyme sia dal tempo concesso per il passaggio di idrolisi dell'urea. Un numero maggiore di cellule di E.coli determina un cambiamento di colore più intenso, mentre un tempo più lungo per l'idrolisi dell'urea consente la rilevazione di un numero minore di cellule.Questo grafico mostra la variazione del pH monitorata mediante un pHmetro portatile. La presenza di 10 alla settima cellule di E.coli ha determinato un aumento graduale del pH di tre unità entro 10 minuti. Al contrario, l'assenza di E.coli non ha causato variazioni di pH rilevabili nelle stesse condizioni.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'ureasi è molto attiva e che un lavaggio inadeguato o una contaminazione porteranno a un falso positivo. Dopo aver seguito questa procedura, questo metodo può essere utilizzato per testare la presenza di E.coli in condizioni più rilevanti, come nel controllo della qualità dell'acqua ambientale.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come sfruttare un semplice test della cartina tornasole per la rilevazione di E.coli. Non dimenticare che questo test può essere utilizzato per individuare E.coli patogeni, che è estremamente pericoloso. È necessario seguire una formazione sulla sicurezza biologica prima di eseguire qualsiasi test su batteri patogeni.

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