Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test
17 settembre 2016
Descriviamo un protocollo per la rilevazione colorimetrica di E. coli utilizzando una cartina di tornasole modificata che sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA, l'ureasi e le perle magnetiche.
L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare un semplice test della cartina tornasole modificato per la rilevazione batterica. Questo metodo descrive come un'enzima DNA che taglia l'RNA attivata da E.coli possa essere abbinata a una piattaforma di trasduzione del segnale basata sulla ureasi per generare un cambiamento di colore in risposta a E.coli. I due principali vantaggi di questa tecnica sono la semplicità del test e la sua applicabilità ad altri enzimi DNA che tagliano l'RNA e che rispondono a diversi analiti.
La procedura sarà dimostrata da Seperh Manchehry e Dingran Chang, studenti laureati del laboratorio del dottor Yingfu Li presso la McMaster University. Dopo aver preparato reagenti e tamponi secondo il protocollo indicato nel testo, preparare una soluzione madre di succinimidil 4-cicloesano-1-carbossilato, o SMCC, sciogliendo un milligrammo di SMCC in 676 microlitri di DMSO. Vortexare e mantenere sul ghiaccio fino all'uso.
Sciogliere un milligrammo di ureasi in un millilitro di PBS 1x e mantenere la soluzione sul ghiaccio fino all'uso. Per sintetizzare il DNA dell'ureasi, o UrDNA, aggiungere 10 microlitri di LD1 100 micromolare in un tubo microcentrifuga da 2,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 140 microlitri di acqua bidistillata e 40 microlitri di PBS 10x e vortexare.
Successivamente, aggiungere 80,5 microlitri di soluzione madre di SMCC e 159,5 microlitri di DMSO. Quindi, vortexare nuovamente e utilizzare una centrifuga da banco per una breve centrifugazione. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius in un incubatore o in un blocco termico per 60 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere al tubo 200 microlitri di PBS 1x, 60 microlitri di acetato di sodio tre molare e 1,5 millilitri di etanolo freddo al 100%. Mescolare mediante vortex e incubare la reazione a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la soluzione a 20.000 × g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi, rimuovere il soprannatante e asciugare il pellet sotto vuoto. Al pellet essiccato, aggiungere 400 microlitri di soluzione stock di ureasi e incubare a temperatura ambiente per 5 ore. Trasferire 200 microlitri di coniugato grezzo in una colonna filtrante centrifuga prelavata con cutoff di peso molecolare di 100.000.
Centrifugare la colonna a 14.000 × g per cinque minuti. Trasferire i restanti 200 microlitri di coniugato grezzo sulla colonna e centrifugare a 14.000 × g per cinque minuti. Successivamente, rimuovere la colonna e posizionarla capovolta in un nuovo tubo di raccolta microcentrifuga da due millilitri.
Centrifugare la colonna capovolta e il tubo a 1.000 ×g per due minuti. Dopo aver rimosso il tubo di raccolta, aggiungere 30 microlitri di PBS 1x sulla colonna centrifuga per lavare la membrana e recuperare ulteriormente i coniugati. Capovolgere nuovamente la colonna e riposizionarla nel tubo di raccolta.
Centrifugare la colonna a 1.000 ×g per due minuti. Rimuovere e smaltire la colonna. Conservare l'UrDNA a quattro gradi Celsius fino all'uso.
Per assemblare un DNAzima attivato da E.coli, o EC1, e l'UrDNA su microsferette magnetiche, agitare bene la soluzione madre di microsferette e trasferire 100 microlitri di sospensione di microsferette in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, posizionare la provetta su un supporto per rack magnetico per isolare le microsferette. Rimuovere il sopranatante mediante pipetta e aggiungere 150 microlitri di buffer di legame, o BB, alla provetta.
Rimuovere il tubo dal supporto e battere delicatamente sul tubo per ri-sospendere le perle in una soluzione omogenea. Dopo aver ripetuto il lavaggio con BB altre due volte con le perle in sospensione in BB, aggiungere 10 microlitri di EC1 a 10 micromolare. Mescolare con cura battendo sul tubo.
Incubare la soluzione con agitazione delicata per 30 minuti. Per evitare l'aggregazione delle perle, battere leggermente sul tubo ogni due o tre minuti. Successivamente, posizionare nuovamente il tubo microcentrifuga sul supporto magnetico per isolare le perle ed eliminare il soprannatante mediante pipettaggio.
Quindi, utilizzare 150 microlitri di BB per lavare le perle per tre volte. Al termine del lavaggio, sospendere le perle in un volume totale di 150 microlitri di BB. A questa soluzione, aggiungere 15 microlitri di UrDNA e riscaldare il campione a 45 gradi Celsius per due minuti, quindi raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e incubare per due ore. Posizionare nuovamente la provetta microcentrifuga sul supporto magnetico per isolare le perle ed eliminare il soprannatante mediante pipettaggio.
Aggiungere 100 microlitri di buffer di reazione, o RB, quindi rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere delicatamente le perle. Dopo aver preparato le cellule di E.coli secondo il protocollo indicato nel testo, prerisciacquare un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri aggiungendo e vortexando 100 microlitri di RB. Successivamente, scartare il buffer. Aggiungere 15 microlitri di EC1 assemblato al tubo lavato, quindi posizionare il tubo sul supporto magnetico ed aspirare il sopranatante.
Rimuovere il tubo dal portatubo, aggiungere 100 microlitri di RB e risospendere attentamente le perle magnetiche. Dopo aver lavato le perle con RB per altre due volte e aver rimosso l'RB, aggiungere 10 microlitri del campione di E.coli al tubo e mescolare delicatamente il contenuto battendo leggermente sul tubo. Quindi, incubare la reazione a temperatura ambiente per un'ora.
Dopo l'incubazione, aggiungere 90 microlitri di acqua bidistillata e posizionare la provetta sul supporto magnetico. Dopo circa tre minuti di separazione magnetica, trasferire con attenzione 85 microlitri del sopranatante in una provetta microcentrifuga da 0,5 millilitri. È molto importante prelevare la soluzione con attenzione, evitando di aspirare le perle magnetiche.
Queste perle sono caricate con ureasi e produrranno un segnale falso positivo. Aggiungere 15 microlitri di rosso fenolo 0,04% e 100 microlitri di soluzione substrato. Successivamente, scattare fotografie a intervalli di tempo specifici per registrare il cambiamento di colore.
Il colore iniziale del test della cartina tornasole deve essere giallo, a indicare un pH della soluzione inferiore a 5,5. Se necessario, il pH iniziale del test della cartina tornasole può essere regolato con un tampone debole, come un tampone di acetato di sodio uno millimolare a pH cinque. Questa figura mostra i risultati del test della cartina tornasole batterico, in cui è stato utilizzato come DNAzima EC1, un DNAzima che taglia l'RNA attivato da E.coli, e come indicatore di pH è stato utilizzato il rosso di fenolo.
Come mostrato dall'assenza di cambiamento di colore in mancanza di E.coli, EC1 è altamente specifico e mostra un'attività minima verso altri batteri. L'intensità del cambiamento di colore dipende sia dal numero di cellule di E.coli utilizzate nel passaggio di attivazione del DNAzyme sia dal tempo concesso per il passaggio di idrolisi dell'urea. Un numero maggiore di cellule di E.coli determina un cambiamento di colore più intenso, mentre un tempo più lungo per l'idrolisi dell'urea consente la rilevazione di un numero minore di cellule.
Questo grafico mostra la variazione del pH monitorata mediante un pHmetro portatile. La presenza di 10 alla settima cellule di E.coli ha determinato un aumento graduale del pH di tre unità entro 10 minuti. Al contrario, l'assenza di E.coli non ha causato variazioni di pH rilevabili nelle stesse condizioni.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'ureasi è molto attiva e che un lavaggio inadeguato o una contaminazione porteranno a un falso positivo. Dopo aver seguito questa procedura, questo metodo può essere utilizzato per testare la presenza di E.coli in condizioni più rilevanti, come nel controllo della qualità dell'acqua ambientale.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come sfruttare un semplice test della cartina tornasole per la rilevazione di E.coli. Non dimenticare che questo test può essere utilizzato per individuare E.coli patogeni, che è estremamente pericoloso. È necessario seguire una formazione sulla sicurezza biologica prima di eseguire qualsiasi test su batteri patogeni.
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Panoramica
Questo articolo presenta un semplice test litmus modificato per la rilevazione dei batteri E. coli. Il metodo utilizza un DNAzima in grado di tagliare l'RNA specifico per E. coli, abbinato a una piattaforma di trasduzione del segnale basata sull'ureasi, al fine di generare un cambiamento di colore visibile in risposta alla presenza del batterio bersaglio. L'approccio è stato progettato per essere facile da usare, rapido e adattabile per applicazioni in condizioni di cura diretta o in campo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Diagnostica molecolare
- Microbiologia
- Test diagnostici al punto di cura
Sfondo
- Esiste un'esigenza crescente di metodi semplici ed efficaci per il rilevamento di patogeni, adatti a utilizzatori non specializzati e all'impiego sul campo.
- I tradizionali test con cartina tornasole forniscono una lettura colorimetrica semplice dei cambiamenti di pH.
- I DNAzimi con attività di scissione dell'RNA possono essere progettati per ottenere un'elevata specificità verso particolari batteri bersaglio.
- L'ureasi catalizza l'idrolisi dell'urea, producendo ammoniaca e aumentando il pH della soluzione, fenomeno rilevabile attraverso un cambiamento di colore.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio di rilevamento batterico rapido e di facile utilizzo basato su una prova del litmus modificata.
- Dimostrare la specificità e la sensibilità di un DNAzima attivato da E. coli che taglia l'RNA in questa piattaforma.
- Fornire un metodo che può essere adattato per altri DNAzimi sensibili a diversi analiti.
Metodi Utilizzati
- Sintesi di un coniugato DNAzima-ureasi (UrDNA) mediante l'uso di reazioni di cross-linking chimico e passaggi di purificazione.
- Immobilizzazione del coniugato DNAzima-ureasi e della DNAzima specifica per E. coli (EC1) su microsfera magnetiche.
- Incubazione del complesso su microsfera con campioni da analizzare contenenti E. coli per attivare la DNAzima e rilasciare l'ureasi.
- Trasferimento dell'ureasi rilasciata in una soluzione di prova contenente urea e un indicatore di pH (rosso fenolo), seguito dal monitoraggio del cambiamento di colore e della variazione di pH.
Risultati principali
- Il saggio produce un cambiamento di colore visibile (da giallo a rosso) in presenza di E. coli, corrispondente a un aumento del pH.
- Nessun cambiamento di colore viene osservato in assenza di E. coli o in presenza di batteri non bersaglio, dimostrando un'elevata specificità.
- L'entità del cambiamento di colore è correlata al numero di cellule di E. coli e alla durata del passaggio di idrolisi dell'urea.
- È possibile rilevare anche sole 107 cellule di E. coli entro 10 minuti, con un aumento del pH fino a tre unità.
Conclusioni
- Questo test litmus modificato fornisce un metodo semplice, rapido e specifico per il rilevamento di E. coli.
- La piattaforma è adattabile ad altri biosensori basati su DNAzima che mirano a patogeni diversi.
- Un'adeguata rimozione e manipolazione sono fondamentali per evitare falsi positivi dovuti alla contaminazione da ureasi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento rapido e semplice da usare dei patogeni è una necessità fondamentale nella ricerca traslazionale e nei flussi di lavoro biotecnologici sul campo. Il test colorimetrico basato su DNAzimi con attività di scissione dell'RNA e sulla trasduzione del segnale mediante ureasi consente un rilevamento specifico e visivo di batteri come E.coli, supportando la selezione precoce e il monitoraggio ambientale. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva e l'efficienza operativa in punti critici della pipeline di scoperta e sviluppo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'interrogazione diretta della presenza di batteri mediante DNAzimi sensibili all'analita per la validazione funzionale della sequenza bersaglio.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo un'elevata specificità per E.coli rispetto a batteri non bersaglio.
- Facilita decisioni rapide di tipo sì/no nel prelievo di campioni ambientali e preclinici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara saggi colorimetrici quantitativi validati per la valutazione di composti o campioni successivi.
- Fornisce risultati standardizzati e riproducibili attraverso un cambiamento di colore visibile dipendente dal pH.
- Consente piattaforme di screening scalabili e utilizzabili sul campo per il rilevamento di patogeni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle esigenze di rilevamento pertinenti alle malattie nella qualità dell'acqua e nella biosorveglianza ambientale.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo una valutazione rapida e in loco dei patogeni.
- Riduce il rischio di ambiguità biologiche in fasi avanzate grazie a meccanismi di rilevamento robusti e specifici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la rilevazione di agenti patogeni basata su ipotesi e supportando la prontezza del saggio per l'uso in campo e in laboratorio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi grazie alla specificità dei DNAzimi nei confronti di bersagli batterici.
- Screening: Fornisce output colorimetrici quantitativi e riproducibili per il triage rapido dei campioni.
- Analisi: Offre variazioni misurabili del pH e letture visive per confrontare le condizioni dei campioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i flussi di lavoro di laboratorio e di campo per l'analisi di campioni ambientali e clinici.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare adattabile ad altre esigenze di rilevamento di patogeni basate su DNAzimi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella rilevazione dei patogeni.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione, la riproducibilità e il rapido impiego in diversi contesti.
- Valore strategico: Permette decisioni efficienti di avanzamento o interruzione e riduce il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Sostiene la priorizzazione e lo sviluppo di piattaforme di rilevamento adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chimica degli acidi nucleici e nell'assemblaggio di saggi enzimatici.
- Necessita dell'accesso a strumentazioni di base di biologia molecolare e a strumenti per letture colorimetriche.
- Richiede protocolli rigorosi di lavaggio e manipolazione per prevenire falsi positivi dovuti a contaminazione da ureasi.
- È adattabile a diversi bersagli di DNAzima per varie specie batteriche.
- I limiti pratici includono le soglie di sensibilità e la necessità di formazione in sicurezza biologica per campioni patogeni.
