Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare una semplice cartina di tornasole modificata per la rilevazione batterica. Questo metodo descrive come un enzima DNA di scissione dell'RNA attivato da E.coli possa essere accoppiato con una piattaforma di trasduzione del segnale basata sull'ureasi per generare un cambiamento di colore in risposta a E.coli. I due principali vantaggi di questa tecnica sono la semplicità del test e la sua applicabilità ad altri enzimi del DNA che decidono l'RNA sensibili all'analita.

A dimostrare la procedura saranno Seperh Manchehry e Dingran Chang, studenti laureati del laboratorio del Dr.Yingfu Li presso la McMaster University. Dopo aver preparato i reagenti e i tamponi secondo il protocollo di testo, preparare una soluzione madre di succinimidil 4-cicloesano-1-carbossilato, o SMCC, sciogliendo un milligrammo di SMCC in 676 microlitri di DMSO. Vorticare e mettere sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Sciogliere un milligrammo di ureasi in millilitro di 1x PBS e metterlo anche sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Per sintetizzare il DNA ureasi, o UrDNA, aggiungere 10 microlitri di LD1 da 100 micromolari a un tubo microfugo da 2,5 millilitri. Quindi, aggiungere 140 microlitri di acqua bidistillata e 40 microlitri di 10x PBS e vortex.

Quindi, aggiungi 80,5 microlitri di brodo SMCC e 159,5 microlitri di DMSO. Quindi, vorticare di nuovo e utilizzare una centrifuga da banco per girare brevemente. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius in un incubatore o in un blocco termico per 60 minuti.

Dopo l'incubazione, aggiungere alla provetta 200 microlitri di 1x PBS, 60 microlitri di acetato di sodio a tre molari e 1,5 millilitri di etanolo freddo al 100%. Mescolare a vortice e incubare la reazione a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la soluzione a 20.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi, rimuovere il surnatante e asciugare il pellet sotto vuoto. Al pellet essiccato, aggiungere 400 microlitri di ureasi e incubare a temperatura ambiente per 5 ore. Trasferire 200 microlitri di coniugato grezzo in una colonna filtrante centrifuga prelavata con taglio a 100.000 pesi molecolari.

Centrifugare la colonna a 14.000 volte g per cinque minuti. Trasferire i restanti 200 microlitri di coniugato grezzo nella colonna e centrifugare a 14.000 volte g per cinque minuti. Quindi, rimuovere la colonna e posizionarla capovolta in una nuova provetta di raccolta microfuge da due millilitri.

Centrifugare la colonna capovolta e la provetta a 1.000 volte g per due minuti. Dopo aver rimosso la provetta di raccolta, aggiungere 30 microlitri di 1x PBS alla colonna centrifuga per lavare la membrana per un ulteriore recupero dei coniugati. Capovolgere nuovamente la colonna e riposizionarla nella provetta di raccolta.

Centrifugare la colonna a 1.000 volte g per due minuti. Rimuovere e smaltire la colonna. Conservare l'UrDNA a quattro gradi Celsius fino all'uso.

Per assemblare un DNAzima che scinde l'RNA attivato da E.coli, o EC1, e un UrDNA su perle magnetiche, mescolare bene il materiale di perline magnetiche e trasferire 100 microlitri di sospensione di perle in un tubo di microfuga da 1,5 millilitri. Quindi, posizionare la provetta su un supporto magnetico per isolare le perline. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio e aggiungere 150 microlitri di tampone legante, o BB, alla provetta.

Rimuovere il tubo dal supporto e picchiettare con cautela il tubo per risospendere le perline in una soluzione omogenea. Dopo aver ripetuto il BB wash altre due volte con le perle in sospensione con BB, aggiungere 10 microlitri di EC1 da 10 micromolari. Mescolare accuratamente picchiettando il tubo.

Incubare la soluzione agitando leggermente per 30 minuti. Per evitare l'aggregazione delle perline, picchiettare il tubo ogni due o tre minuti. Quindi, riposizionare la provetta per microfuge sulla rastrelliera magnetica per isolare le microsfere e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio.

Quindi, utilizzare 150 microlitri di BB per lavare le perline tre volte. Una volta completato il lavaggio, sospendere le perle in un totale di 150 microlitri di BB.To questa soluzione, aggiungere 15 microlitri di UrDNA e riscaldare il campione a 45 gradi Celsius per due minuti, quindi raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e incubare per due ore. Riposizionare la provetta per microfusibili sulla rastrelliera magnetica per isolare le microsfere e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio.

Aggiungere 100 microlitri di tampone di reazione, o RB, quindi rimuovere la provetta dal rack magnetico e risospendere con cura le perline. Dopo aver preparato le cellule di E.coli secondo il protocollo di testo, prelavare un tubo di microfuga da 1,5 millilitri aggiungendo e agitando 100 microlitri di RB. Quindi, eliminare il buffer. Aggiungere 15 microlitri di EC1 assemblato al tubo lavato, quindi posizionare il tubo sul rack magnetico e aspirare il surnatante.

Estrarre la provetta dal rack, aggiungere 100 microlitri di RB e risospendere con cura le perline magnetiche. Dopo aver usato l'RB per lavare le perle altre due volte e aver rimosso l'RB, aggiungere 10 microlitri del campione di E.coli alla provetta e mescolare delicatamente il contenuto picchiettando sulla provetta. Quindi, incubare la reazione a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo l'incubazione, aggiungere 90 microlitri di acqua bidistillata e posizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica. Dopo circa tre minuti di separazione magnetica, trasferire con cura 85 microlitri di surnatante in una provetta per microfuge da 0,5 millilitri. È molto importante pipettare accuratamente la soluzione senza assorbire nessuna delle perle magnetiche.

Queste perle sono caricate con ureasi e genereranno un falso segnale positivo. Aggiungere 15 microlitri di rosso fenolo allo 0,04% e 100 microlitri di soluzione di substrato. Quindi, scatta fotografie a intervalli di tempo specifici per registrare un cambiamento di colore.

Il colore iniziale della cartina di tornasole deve essere il giallo, riflettendo un pH della soluzione inferiore a 5,5. Se necessario, il pH iniziale della cartina di tornasole può essere regolato con un tampone debole, come un tampone millimolare di acetato di sodio a pH cinque. Questa figura mostra i risultati della cartina di tornasole batterica, in cui il DNAzima EC1 attivato dall'RNA attivato da E.coli è stato utilizzato come DNAzima e il rosso fenolo è stato utilizzato come indicatore di pH.

Come dimostrato dall'assenza di viraggio di colore in assenza di E.coli, EC1 è altamente specifico e mostra un'attività minima nei confronti di altri batteri. La profondità del cambiamento di colore dipende sia dal numero di cellule di E.coli utilizzate nella fase di attivazione del DNAzima sia dal tempo concesso per la fase di idrolisi dell'urea. Un maggior numero di cellule di E.coli provoca un cambiamento di colore più forte e un tempo più lungo per l'idrolisi dell'urea consente il rilevamento di un numero inferiore di cellule.

Questo grafico mostra la variazione di pH monitorata utilizzando un pHmetro portatile. La presenza di 10-7 cellule di E.coli ha provocato un aumento graduale del pH di tre unità entro 10 minuti. Al contrario, l'assenza di E.coli non ha causato variazioni di pH rilevabili nelle stesse condizioni.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'ureasi è molto attiva e un lavaggio o una contaminazione scadenti porteranno a un falso positivo. Seguendo questa procedura, questo metodo può essere eseguito per testare l'E.coli in condizioni più rilevanti, come i test per la qualità dell'acqua ambientale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione per sfruttare una semplice cartina di tornasole per il test di E.coli. Non dimenticare che questo test può essere utilizzato per rilevare l'E.coli patogeno, che è estremamente pericoloso. È necessario seguire una formazione sulla biosicurezza prima di condurre qualsiasi test per i batteri patogeni.