Name: Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri un test al tornasole modificato per rilevare E. coli utilizzando un DNAzima specifico e una piattaforma di trasduzione del segnale a base di urease. Questo metodo semplice e rapido offre un cambiamento di colore visibile per applicazioni diagnostiche point-of-care.

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Il finanziamento per questo progetto di ricerca è stato fornito dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) tramite una sovvenzione per la scoperta a YL.

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<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
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<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La definizione dell&#39;azione dell&#39;attività RNA clivaggio di un DNAzyme batterio sensibile ad un banco di prova è reso possibile attraverso l&#39;uso di ureasi e separazione magnetica, come illustrato nella figura 1. Sebbene la dimostrazione della cartina tornasole modificati per rivelare batterica è fatto con una E. coli-dipendente RNA-scissione DNAzyme, 5,19,20 il design può essere generalmente esteso per qualsiasi DNAzyme RNA-scissione. Data la grande disponibilità di DNAzimi...

I patogeni batterici sono una delle principali cause di morbilità e mortalità globale. Focolai di infezioni nosocomiali, agenti patogeni di origine alimentare e contaminanti batterici nell'ambiente rappresentano una minaccia seria e continua per la salute e la sicurezza pubblica. Per prevenire questi focolai, sono necessari strumenti efficaci che consentano di rilevare gli agenti patogeni in modo tempestivo in una varietà di contesti. Test semplici ma comunque efficaci, portatili ed economici sono molto ambiti, soprattutto nelle regioni che sono suscettibili alle epidemie ma non possono permettersi costose strutture di test. 1-3 Sebbene esistano una moltitudine di metodi per rilevare i batteri, molti di essi non sono adatti come strumenti di screening o di test in loco perché richiedono lunghi tempi di analisi, strumenti costosi e procedure di analisi complicate. 
I test colorimetrici sono particolarmente interessanti per le applicazioni point-of-care o sul campo, poiché i cambiamenti di colore possono essere facilmente rilevati ad occhio nudo. La cartina di tornasole per il pH è semplice, rapida ed efficace. Sebbene sia una tecnologia molto antica, è ancora oggi ampiamente utilizzata per la sua semplicità ed efficacia. Sorprendentemente, questo semplice test non era mai stato modificato per ottenere la rilevazione di altri analiti prima che avessimo recentemente sviluppato un approccio per modificare questo test per il test di E. coli. 4
La cartina di tornasole estesa per E. coli impiega tre componenti aggiuntivi: un DNAzima (EC1) attivato da E. coli, 5 ureasi e perline magnetiche. I DNAzimi si riferiscono a molecole di DNA sintetiche a singolo filamento con attività catalitica. 6 Possono essere isolati da pool di DNA a sequenza casuale utilizzando la selezione in vitro. 7,8 Sono altamente stabili e possono essere prodotti in modo economico utilizzando la sintesi automatizzata del DNA ad alta efficienza. 9 Per questi motivi, i DNAzimi, in particolare i DNAzimi che scindono l'RNA, sono stati ampiamente esaminati per applicazioni di biorilevamento. I sensori DNAzyme 6,10,11 che decidono l'RNA sono stati sviluppati per rilevare ioni metallici,12-16 piccole molecole,17,18 patogeni batterici5,19-21 e cellule tumorali. 22 Data la grande disponibilità di DNAzimi che scindono l'RNA indotti dal bersaglio, qualsiasi test che utilizza un DNAzima può essere potenzialmente ampliato per rilevare una vasta gamma di analiti.
L'ureasi è stata scelta per la sua capacità di idrolizzare l'urea in ammoniaca,23,24 con conseguente aumento del pH. L'ureasi è anche altamente efficiente, stabile e suscettibile di coniugazione con altre biomolecole. Pertanto, abbiamo ipotizzato che un coniugato di un DNAzima di scissione dell'RNA con ureasi consentirebbe l'uso della cartina di tornasole per la rilevazione di altri bersagli. 5
L'azione del DNAzima che scinde l'RNA è trasmessa all'aumento del pH mediato dall'ureasi attraverso l'uso di perle magnetiche che vengono immobilizzate con il coniugato DNAzyme-ureasi. Poiché l'attività del DNAzima in esame è strettamente dipendente da E. coli, la presenza di questo batterio nella soluzione di prova comporterà il rilascio di ureasi dalle perle magnetiche alla soluzione, che viene poi prelevata e utilizzata per idrolizzare l'urea in una soluzione reporter che contiene un colorante sensibile al pH. Il risultato finale di questa procedura è un cambiamento di colore che può essere convenientemente segnalato dalla carta colorante o pH.

<table><tbody><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Pellet di idrossido di sodio (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilammide/bisacrilammide (29:1) soluzione</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xilencianolo FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% sodio dodecil solfato</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (II) esaidrato</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina Trifospatica (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametileneetilendiammina (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% Persolfato di ammonio (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>ureasi</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04% Rosso fenolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone di reazione della polinucleotide chinasi T4</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone di reazione della DNA ligasi T4</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi (5 U/&#956; l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Brodo</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotide chinasi (10 U/&#956; l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Lastre di vetro</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>distanziatori spessore 0,75 mm</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>pettine a 12 pozzetti</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lampada UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A Piastra</td><td></td></tr><tr><td>metallica</td><td>CBS scientifico</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO filtri centrifughi</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack di separazione magnetica</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfughe,</td><td>Sarstedt</td><td>72,69</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa (0,22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per coltura da 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Lavaggio ad ultrasuoni</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

colorimetrico rilevamento di batteri uso tornasole test

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Ci sono crescenti richieste di metodi semplici ma comunque efficaci che possono essere utilizzati per rilevare agenti patogeni specifici per applicazioni point-of-care o sul campo. Tali metodi devono essere facili da usare e produrre risultati affidabili che possano essere facilmente interpretati sia dagli specialisti che dai non professionisti. La cartina di tornasole per il pH è semplice, rapida ed efficace in quanto riporta il pH di un campione di prova tramite un semplice cambiamento di colore. Abbiamo sviluppato un approccio per sfruttare la cartina di tornasole per la rilevazione batterica. Il metodo sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA specifico del batterio per ottenere due funzioni: riconoscere un batterio di interesse e fornire un meccanismo per controllare l'attività dell'ureasi. Attraverso l'uso di perle magnetiche immobilizzate con un coniugato DNAzima-ureasi, la presenza di batteri in un campione di prova viene trasmessa al rilascio di ureasi dalle perle alla soluzione. L'ureasi rilasciata viene trasferita in una soluzione di prova per idrolizzare l'urea in ammoniaca, determinando un aumento del pH che può essere visualizzato utilizzando la classica cartina di tornasole.

Il principio della prova del nove batterica è spiegato in Figura 1 Il test utilizza tre materiali principali:. Un DNAzyme RNA-scissione che viene attivato da un batterio specifico, ureasi e perline magnetiche. Il DNAzyme viene utilizzato come elemento di riconoscimento molecolare per ottenere un rilevamento altamente specifica di un batterio di interesse. Ureasi e sfere magnetiche sono utilizzati per ottenere trasduzione del segnale delle attività RNA-scissione del DNAzy...

Descriviamo un protocollo per la rilevazione colorimetrica di E. coli utilizzando una cartina di tornasole modificata che sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA, l'ureasi e le perle magnetiche.

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare un semplice test della cartina tornasole modificato per la rilevazione batterica. Questo metodo descrive come un'enzima DNA che taglia l'RNA attivata da E.coli possa essere abbinata a una piattaforma di trasduzione del segnale basata sulla ureasi per generare un cambiamento di colore in risposta a E.coli. I due principali vantaggi di questa tecnica sono la semplicità del test e la sua applicabilità ad altri enzimi DNA che tagliano l'RNA e che rispondono a diversi analiti.La procedura sarà dimostrata da Seperh Manchehry e Dingran Chang, studenti laureati del laboratorio del dottor Yingfu Li presso la McMaster University. Dopo aver preparato reagenti e tamponi secondo il protocollo indicato nel testo, preparare una soluzione madre di succinimidil 4-cicloesano-1-carbossilato, o SMCC, sciogliendo un milligrammo di SMCC in 676 microlitri di DMSO. Vortexare e mantenere sul ghiaccio fino all'uso.Sciogliere un milligrammo di ureasi in un millilitro di PBS 1x e mantenere la soluzione sul ghiaccio fino all'uso. Per sintetizzare il DNA dell'ureasi, o UrDNA, aggiungere 10 microlitri di LD1 100 micromolare in un tubo microcentrifuga da 2,5

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

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Un metodo semplice per l'identificazione di batteri patogeni priorità è quella di utilizzare fago giornalista geneticamente modificato. Queste fago reporter, che sono specifici per la loro specie ospite particolare, sono in grado di trasduzione rapidamente una risposta bioluminescente segnale alle cellule ospite. Qui, descriviamo l'uso del fago giornalista per la rilevazione...

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Questo video descrive un test colorimetrico per la misurazione del lattato nei lisati cellulari utilizzando l'enzima lattato deidrogenasi. Questo enzima converte il lattato in piruvato, insieme alla conversione del NAD in NADH che reagisce con i coloranti tetrazolio e fornisce un prodotto colorato che può essere misurato spettrofotometricamente per quantificare il lattato.

Saggio colorimetrico per la quantificazione del lattato nei campioni di prova

Questo video mostra un metodo di rilevamento colorimetrico di E. coli, che coinvolge un biomarcatore di E. coli che attiva un DNAzima, portando alla scissione del legame RNA e al distacco di un coniugato DNAzima-ureasi. Un successivo test colorimetrico rileva il biomarcatore di E. coli attraverso le variazioni di pH indotte dall'ammoniaca.

Rilevamento colorimetrico di un biomarcatore batterico mediante una cartina di tornasole modificata

Questo video mostra la rilevazione quantitativa multiplex di batteri utilizzando microsfere di polistirene magnetico carbossilato colorate in set distinti. La procedura comprende la formazione di complessi perline-batteri, la separazione magnetica e l'analisi basata sul flusso, consentendo una quantificazione precisa e simultanea di più batteri nello stesso pozzetto di reazione.

Rilevazione quantitativa multiplexata di batteri mediante microsfere magnetiche marcate con colorante

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti.

Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

A differenza di quanto osservato per eucarioti, c'è una scarsità di studi che dettaglio depolarizzazione della membrana e concentrazione di ioni cambiamenti nei batteri, principalmente come loro piccole dimensioni lo metodi convenzionali di misura difficile. Qui, i protocolli di dettaglio per il monitoraggio di tali eventi nel significativa Gram-positivi patogeno Streptococcus pneumoniae utilizzando tecniche di fluorescenza.

Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo di tinture fluorescenti

Viene presentato qui un protocollo che coinvolge la concentrazione integrata, l'arricchimento e il rilevamento colorimetrico end-point di agenti patogeni di origine alimentare in grandi volumi di acqua agricola.  L'acqua viene filtrata attraverso tamponi di Moore modificati (MMS), arricchiti con terreni selettivi o non selettivi, e il rilevamento viene eseguito utilizzando dispositivi analitici a base di carta (μPAD) incorporati con substrati colorimetrici indicativi dei batteri.

Colorimetrico carta a base di rilevamento di<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp., E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Da grandi volumi di acqua agricolo

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la motilità batterica basata su una reazione di colore. I principali vantaggi di questo metodo sono che è facile da valutare e più accurato e non richiede attrezzature specializzate.

Visualizzazione della motilità batterica basata su una reazione cromatica

Scopri un test al tornasole modificato per rilevare E. coli utilizzando un DNAzima specifico e una piattaforma di trasduzione del segnale a base di urease. Questo metodo semplice e rapido offre un cambiamento di colore visibile per applicazioni diagnostiche point-of-care.

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

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