Un In Vitro Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della neuroimmunologia, come ad esempio in che modo l'interazione diretta tra le cellule T e le cellule endoteliali influisce sull'integrità e sulla permeabilità della barriera emato-encefalica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una valutazione automatizzata e in tempo reale della funzione di barriera in seguito a una modulazione mirata dell'interazione tra cellule T e cellule endoteliali.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei disturbi autoimmuni del SNC, perché fornisce informazioni sulla rottura della barriera emato-encefalica mediata dalle cellule T, un passo cruciale nella patogenesi di tali malattie. Questo metodo si concentra sulle proprietà della barriera emato-encefalica marina durante l'EAE. Ma può anche essere applicato a modelli di barriera emato-encefalica rossa o umana, nonché a studi su altri disturbi autoimmuni del SNC.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa di possibili difficoltà con la tempistica ottimale della coltura combinata di cellule endoteliali primarie e dell'attivazione delle cellule T. Abbiamo sviluppato questo metodo per la prima volta quando abbiamo iniziato a studiare gli effetti di diversi livelli di attivazione delle cellule T sulle proprietà della barriera emato-encefalica durante l'EAE, un modello animale di sclerosi multipla. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'impostazione di co-colture di cellule T e cellule endoteliali è difficile da apprendere, perché le variazioni iniziali di T tra i pozzetti potrebbero richiedere successive travisamenti dei risultati.

Per iniziare questa procedura, il quinto giorno dopo l'isolamento MBMEC, prerivestire gli inserti permeabili con 80 microlitri di soluzione di rivestimento MBMEC per inserto. Incubarli a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre ore. Dopo aver rimosso la soluzione di rivestimento MBMEC dagli inserti, lavare gli MBMEC aggiungendo due millilitri di PBS a temperatura ambiente in ciascun pozzetto e aspirandolo dopo un minuto, quindi ripetere questa procedura ancora una volta.

Successivamente, aggiungere lo 0,05% di tripsina EDTA a 300 microlitri per pozzetto e incubarlo per cinque-dieci minuti. Successivamente, aggiungere due millilitri di terreno MBMEC a ciascun pozzetto per fermare la tripsinizzazione. Quindi, trasferire le cellule raccolte in una provetta da centrifugazione da 15 millilitri e centrifugare il campione a 700 volte g per otto minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo otto minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di terreno MBMEC senza puromicina. Per contare le cellule, mescolare 90 microlitri di blu di tripano allo 0,04%. Con 10 microlitri di sospensione cellulare, pipettare 10 microlitri della miscela tra il coperchio di vetro e l'emocitometro.

Quindi, cedi due volte 10 alla quarta cella per inserto. Aggiungere 810 microlitri di terreno MBMEC nello scomparto inferiore di ciascun pozzetto e posizionare la piastra con gli inserti nell'incubatore fino al momento di procedere con la misurazione TEER. Per stimolare le cellule T CD4 positive, prerivestire una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo con anticorpo CD3 anti-topo purificato alla concentrazione finale desiderata per tre ore a 37 gradi Celsius.

Dopo aver isolato le cellule T, lavare due volte la piastra prerivestita con PBS. Successivamente, aggiungere l'anticorpo anti-CD28 purificato alle cellule T isolate alla concentrazione finale desiderata e mescolare bene. Quindi, cedi le cellule T e lasciale a 37 gradi Celsius per due o tre giorni.

Per impostare la misura TEER, posizionare il modulo a 24 pozzetti dello strumento TEER nella cappa a flusso laminare. Rimuovere i coperchi e posizionare gli inserti con MBMEC nello strumento, utilizzando una pinza. Quindi, pipettare 810 microlitri di terreno fresco nello scomparto inferiore dei pozzetti del modulo, aggiungendo con cura tra l'inserto e la parete del pozzetto del modulo.

Successivamente, chiudere i coperchi e posizionare lo strumento nell'incubatrice. Collegare lo strumento al computer. Quindi, accendere il controller dello strumento e aprire il software.

Nella finestra pop-up, seleziona le caselle "Seleziona mostra TER" e mostra Ccl". Quindi, premi start. Dopo aver completato la prima misurazione, selezionare controlla tutti i pozzetti" nella scheda Risultati per vedere tutti i valori TEER e Ccl.

Quindi, salva il file. Successivamente, scegliere il punto temporale per la co-coltura di MBMEC con cellule T quando Ccl è stabile e inferiore a un microfarad per centimetro quadrato e il TEER ha raggiunto il suo livello massimo. Ispezionare attentamente i valori assoluti di TEER e Ccl ed escludere i pozzi in cui gli MBMEC non hanno sviluppato abbastanza monostrati confluenti deselezionando tali pozzi.

Raggruppa il resto dei pozzetti facendo clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti e selezionando aggiungi pozzo al nuovo pozzo medio"Assegnagli un nome nella finestra pop-up e fai lo stesso per tutti i singoli pozzetti da raggruppare. Quindi controlla tutti i pozzetti medi per confermare che tutti abbiano le stesse condizioni iniziali prima della co-coltura. Nella scheda dell'esperimento, premi pausa.

Scollegare lo strumento ed estrarlo dall'incubatrice. Quindi, rimuovere i coperchi nella cappa a flusso laminare. Successivamente, rimuovere parte del fluido dall'inserto nello scomparto superiore del pozzetto.

Aggiungere le cellule T agli MBMEC pipettando accuratamente 150 microlitri di terreno. Quindi, ricollegare lo strumento e premere riprendi misurazione. Dopo 24 ore, premere stop nella scheda dell'esperimento e salvare il file.

Qui è mostrata la morfologia a forma di fuso nella colorazione immunofluorescente di PECAM-1 e Cldn-5 cinque giorni dopo l'isolamento di MBMEC. Di seguito sono riportati i valori TEER e Ccl prima e dopo il raggruppamento dei singoli pozzetti prima dell'aggiunta delle cellule T. La curva blu non viene utilizzata per l'esperimento poiché gli MBMEC in questo pozzo non hanno sviluppato un TEER così alto come in altri pozzi.

In questo esperimento, da 35 a 55 cellule T CD4 positive specifiche sono state stimolate in modo antigene-specifico per cinque giorni. Le cellule T naive e le citochine proinfiammatorie, l'interferone gamma e il TNF-alfa sono serviti rispettivamente come controllo negativo e positivo. Qui, le cellule T sono state stimolate dalla stessa quantità di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 e quelle coltivate per tre giorni hanno mostrato una maggiore propensione alla rottura della barriera rispetto alle cellule T coltivate per soli due giorni.

I risultati mostrano che le cellule T stimolate, ma non i loro surnatanti, hanno causato un danno sostanziale agli MBMEC, indicando che il contatto diretto tra le cellule T e gli MBMEC è fondamentale per la rottura della barriera. D'altra parte, l'aggiunta dell'inibitore del granzima b due alla coltura di cellule T ha ripristinato l'integrità dell'MBMEC in misura maggiore, indicando la molecola citolitica come un attore importante nel causare danni all'MBMEC e la conseguente diminuzione del TEER Una volta padroneggiato, questo esperimento può essere eseguito in 12 giorni se viene eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di scegliere il momento corretto per impostare la co-coltura di cellule T e cellule endoteliali.

Seguendo questa procedura possono essere utilizzati altri saggi, come la microscopia a immunofluorescenza, la citometria a flusso e i saggi di probabilità. Al fine di rispondere a ulteriori domande, come ad esempio in che modo questa interazione influisce sulla permeabilità dell'espressione delle molecole a giunzione stretta e sull'entità della trasmigrazione delle cellule T? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroimmunologia per esplorare i disturbi autoimmuni del SNC nei topi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come valutare gli effetti diretti tra le cellule T attivate e le cellule endoteliali per quanto riguarda l'integrità e la permeabilità della barriera emato-encefalica.