Utilizzando Multi-fluorurati biliari acidi e

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare gli acidi biliari con fluoro non radioattivo, presente in natura, al fine di misurarne la concentrazione nella cistifellea mediante risonanza magnetica (MRI), per valutare il trasporto degli acidi biliari in animali vivi. Questo approccio ha un potenziale nell'identificare individui con diarrea cronica che dovrebbero essere trattati per malassorbimento degli acidi biliari. I principali vantaggi di questo metodo sono l'assenza di esposizione a radiazioni ionizzanti e il notevole potenziale traslazionale sia per la ricerca clinica sia per la pratica clinica.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo capito che negli Stati Uniti non esistono test clinici pratici per rilevare un trasporto intestinale alterato degli acidi biliari. Iniziare riempiendo una siringa da un millilitro con il volume appropriato di soluzione madre di acido biliare marcato con fluoro e applicando un ago curvo per gavaggio gastrico con punta a bulbo, calibro 20, lunghezza 1,5 pollici. Successivamente, utilizzare pollice e indice per afferrare saldamente il topo dalla pelle molle sulla nuca e le restanti dita per afferrare la pelle sulla parte bassa della schiena e sulla coda.

Tenendo l'animale in posizione verticale, inserire l'ago per la gavaggio lungo il lato e il tetto della bocca, quindi nell'esofago e fino allo stomaco. Al termine sperimentale previsto, praticare un'incisione cutanea mediana addominale dal pube allo xifoidi, seguita da un'incisione corrispondente attraverso la tonaca peritoneale per esporre gli organi addominali senza perforare il diaframma. Successivamente, utilizzare una pinza da cinque pollici per sollevare il processo xifoidi, esponendo così la cavità addominale superiore.

Utilizzando pinze e uno strumento smussato, dissezionare e spostare il fegato per esporre la colecisti. Quindi posizionare una pinza lunga quattro pollici sul dotto biliare comune e recidere il legamento che collega il polo superiore della colecisti al diaframma, permettendo così di spostare la colecisti sul lato destro dell'addome. Prestare attenzione e applicare la pinza sul dotto biliare comune il più presto possibile dopo la laparotomia per evitare lesioni epatiche o lo svuotamento accidentale della colecisti.

Dopo l'esanguinamento, trasferire il sangue raccolto in un tubo eparinizzato da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Precipitare il plasma con quattro parti di acetonitrile e centrifugare nuovamente il campione di sangue. Successivamente, analizzare il surnatante mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.

Per liberare la colecisti, dissezionare in modo ottuso i tessuti circostanti, quindi eseguire la sezione del dotto biliare comune al di sotto della pinza. Pesare la colecisti raccolta, quindi collocare il tessuto in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri ed asportare il fegato. Per estrarre i tessuti, aggiungere acetonitrile al 75% e acqua al 25% ed omogeneizzare circa 100 milligrammi di fegato e l'intera colecisti in omogeneizzatori tissutali in vetro da 21, di dimensioni individuali, su ghiaccio.

Trasferire i campioni in una provetta Eppendorf da 1,5 mL e centrifugare. Successivamente, diluire gli estratti in modo appropriato e quantificare il contenuto di acidi biliari mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa. Al termine sperimentale appropriato, pulire la parte interna della coscia sinistra del topo anestetizzato e inserire sottocute attraverso la coscia, nella cavità addominale, un catetere con ago da 24 gauge per 0,75 pollici.

Rimuovere l'ago, lasciando il catetere intraperitoneale al suo posto. Trasferire il topo sul lettino dell'apparecchio di risonanza magnetica e collegare un tappetino termico con controllo della temperatura. Collegare il catetere a un tratto di tubo sterile lungo 72 pollici e collegare il tubo a una siringa sterile da 1 millilitro per mantenere l'anestesia per tutta la durata della procedura.

Dopo aver verificato che non ci siano metalli nelle vicinanze dello scanner, utilizzare una bobina MRI volumetrica lineare a doppia risonanza per protoni e fluoro per trasmettere e ricevere i segnali a radiofrequenza. Quindi, utilizzare una sequenza fast low angle shot per ottenere immagini del cuoio capelluto su tre sezioni al fine di calibrare il sistema e verificare la posizione dell'animale. Per iniziare l'esperimento, fare clic sul pulsante del semaforo per acquisire immagini magnetiche di risonanza protonica su più sezioni utilizzando la sequenza di acquisizione rapida con rilassamento e potenziamento nella vista trasversale del campione.

Infine, fare clic sul pulsante GOP nella finestra dello strumento di controllo dello spettrometro per acquisire immagini del fluoro utilizzando una seconda sequenza rapida a basso angolo nello stesso campo. Utilizzando questo metodo, è possibile misurare una concentrazione altamente selettiva di acido biliare multifluorurato, o MFBA, nella colecisti che risulta mille volte superiore rispetto ai livelli osservati nel fegato o nel plasma, valori non compatibili con concentrazioni fisiologiche di acidi biliari. Come previsto dalla fisiologia del circolo enteroepatico degli acidi biliari, le concentrazioni massime di MFBA nella colecisti risultano evidenti da quattro a sette ore dopo la somministrazione orale.

In effetti, due ore e mezza e quattro ore dopo la somministrazione orale di MFBA, si osservano segnali fluorinati provenienti da ciò che appare essere il dotto biliare comune e un segnale più intenso proveniente dalla colecisti. Tra le sette e le otto ore e mezza, il segnale del dotto biliare comune non viene più rilevato e il segnale fluorinato della colecisti aumenta fino a raggiungere la stessa intensità del segnale proveniente dal fantoccio MFBA adiacente. Nei topi privi del trasportatore biliare acido-dipendente sodio-apicale, che mostrano un ridotto assorbimento intestinale di acidi biliari, si verifica una riduzione di circa 22 volte nella concentrazione di MFBA rispetto agli animali controlli di tipo selvatico.

In effetti, mentre un segnale fluorinico robusto viene rilevato nelle colecisti di topi wild-type, non vi è alcun segnale fluorinico corrispondente negli animali carenti del trasportatore apicale dipendente dal sodio per gli acidi biliari, confermando sia che gli MFBA vengono gestiti in modo simile agli acidi biliari fisiologici, sia che la risonanza magnetica con MFBA può essere utilizzata per rilevare un assorbimento intestinale alterato degli acidi biliari. Una volta acquisita padronanza e eseguita correttamente, la laparotomia, il prelievo di sangue e l'incisione di colecisti e fegato possono essere completate entro 20 minuti. L'acquisizione del segnale durante la risonanza magnetica richiederà da un'ora e mezza a due ore.

Dopo il suo sviluppo e la commercializzazione, questa tecnica potrebbe aprire la strada all'esplorazione del ruolo del trasporto degli acidi biliari intestinali nella fisiologia e nelle malattie, sia in piccoli animali che nell'uomo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come somministrare acidi biliari marcati con sostanze estranee a piccoli animali e di come misurare il loro assorbimento nel fegato e nella cistifellea mediante risonanza magnetica o incisione degli organi.