Name: La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte da cellule del liquido amniotico murino utilizzando un sistema di trasposoni non virale. Questo metodo sicuro facilita terapie personalizzate prima della nascita.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione CARIPARO con il Grant numero 13/04 e dalla Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza con il numero 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin e Michela Pozzobon sono finanziate dalla Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin è finanziata dalla Fondazione CARIPARO con il Grant numero 13/04. Paolo De Coppi è finanziato dalla Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Tutte le procedure erano in conformità con la legge italiana. campioni murini AF sono state raccolte dai topi in gravidanza a 13,5 giorni dopo coitum (DPC) da C57BL / 6-Tg topi (UBC-GFP) 30Scha / J chiamato GFP. 1. Transposon Produzione NOTA: vettori di espressione trasposoni sono stati generati utilizzando le procedure di clonazione standard. Il DNA plasmidico per il mouse AF cellule trasfezione è stato preparato utilizzando kit commerciali. <ol><li> Mescolare 10 ng di DNA plasmidico con 50 ml di batteri DH5α in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare la provetta in ghiaccio per 20 min. </li><li> scossa di calore a 42 ° C per 40 sec. </li><li> Mettere provetta in ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 250 ml di brodo di pre-riscaldato (C 37 °) brodo lisogenia (LB). Agitare (300 rpm) a 37 ° C per 30 min. </li><li> Distribuire 30 ml di ogni trasformazione su piastre LB con 0,1 mg / ml di ampicillina. Lasciare le piastre a secco e incubare invertiti a 37 ° C overnight. </li><li> Il giorno dopo, nel pomeriggio, prendere 3 colonie, utilizzando sterili 200 microlitri punte, da ogni trasformazione e trasferimento su 0,1 mg / ml LB amp. </li><li> Agitare batteri (300 rpm) durante la notte a 37 ° C. </li><li> Per la depurazione plasmide utilizzare kit commerciali. plasmidi stock a -20 ° C. </li></ol> 2. embrionali di topo fibroblasti (MEF) Cultura <ol><li> Rivestimenti dei 6 pozzetti con 0,1% di gelatina <ol><li> piastre Coat sotto il cofano aggiungendo 1 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina a ciascuna delle sei pozzetti. Sia la gelatina polimerizzare sulla incubatore (37 ° C) per 1 ora. </li><li> Eliminare l&#39;eccesso, e asciugare le piastre per 1 ora. </li><li> Utilizzare parafilm per sigillare e piastre di conservare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> L&#39;inattivazione del MEF con Mitomicina C <ol><li> Scongelare una fiala di 4 x 10 6 cellule MEF utilizzando una C vasca 37 °. </li><li> Seme MEF nella cappa su una piastra di Petri (150 mm) con il mezzo MEF. </li><li> Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> (ATTENZIONE) Aggiungere mitomicina C (5 mg / ml) quando le cellule sono confluenti. </li><li> Cellule posto in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 3 ore. </li><li> Rimuovere media con cellule mitomicina C. Lavare tre volte con 1x tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Aggiungere 2 ml di cellule tripsina e luogo commerciale nel 37 ° C incubatore per 5 min. Dopo, aggiungere 18 ml di blocco mezzo per arrestare la reazione tripsina. </li><li> Contare le cellule utilizzando una camera di Burker secondo il protocollo del produttore. </li><li> cellule centrifugare a 145 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Seme 60.000 cellule / cm 2 di inattivato MEF su 0,1% piastre rivestite di gelatina. </li><li> Coltivare cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2, prima della semina AF e / o cellule iPS-AF. </li></ol></li></ol> L&#39;isolamento delle cellule 3. mouse AF <ol><li> Impostare accoppiamenti a tempo e verificare plu vaginalegs dopo 24 ore di co-housing. </li><li> Osservare fino a 13,5 DPC e sacrificare diga incinta attraverso dislocazione cervicale. </li><li> Pulire la parete addominale dell&#39;animale utilizzando il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzando le forbici, eseguire una laparotomia mediana incisione della lunghezza della parete addominale per accedere nella cavità addominale. </li><li> Esporre l&#39;utero con pinze. Rimuovere l&#39;utero con le forbici e il trasferimento in un piatto da 100 millimetri di Petri piena di sterile PBS 1x posto sul ghiaccio. </li><li> Utilizzare uno stereomicroscopio per raccogliere l&#39;AF a 10X di ingrandimento. </li><li> Tenere l&#39;utero con una pinza e rimuovere la parete uterina con le forbici. Fare attenzione a non danneggiare le membrane fetali e conseguente perdita di liquido amniotico. </li><li> Raccogliere feti in una capsula di Petri 100 millimetri pieno di sterili 1x PBS e disporli sul ghiaccio. </li><li> Afferrare la placenta di un feto con una pinza sottile punti e posto in un ambiente pulito 100 millimetri piastra Petri. </li><li> Rimuovere il sacco vitellino con pinze punta fine. </li><li&gt; disturbare la membrana amniotica con pinze punta fine e raccogliere 30 ml di AF per ogni feto utilizzando una siringa da insulina in un flacone da 15 ml conica. </li><li> Dopo la raccolta AF, lavare ogni feto con sterile 1x PBS integrato con siero fetale bovino 1% (FBS) e raccogliere nei tubo da 15 ml contenente l&#39;AF. </li><li> Centrifugare AF a 145 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante sotto il cofano e seminare le cellule AF pellet. </li></ol> 4. mouse AF Cell Culture <ol><li> Semina di cellule di topo AF <ol><li> Un giorno prima della semina, preparare un 6-pozzetti di gelatina rivestite 0,1% con mitomicina C trattati con MEF. </li><li> Dopo la raccolta AF, seminare le cellule ottenute da una amniocentesi (circa 1 x 10 7 cellule ottenute da feti 6) sul mitoticamente inattivato MEF utilizzando terreno di coltura AF. </li><li> Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2, cambiando il mezzo ogni altro giorno. </li><li> Dopo 7 giorni di coltura, transcellule fetto AF seguendo la procedura descritta di seguito. </li></ol></li></ol> 5. Transfection, iPS-AF cellulare Generation e cultura NOTA: cellule mouse AF sono state trasfettate con il plasmide trasposone PB-tetO2-IRES-OKMS, in combinazione con un plasmide di espressione trasposasi (mPBase) e con il transattivatore inverso tetraciclina trasposone plasmide (PB-CAG-rtTA). Tutti i plasmidi sono stati forniti dal professor Andras Nagy 33. <ol><li> Mescolare 1 mg di PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 mg di mPBase e 0,5 mg di PB-CAG-rtTA (DNA totale: 2 mg) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Diluire il DNA di 100 ml con terreno privo di siero (Dulbecco Modified Eagle Medium - DMEM). </li><li> Aggiungere 8 ml di reagente di trasfezione (ad esempio, Fugene) (nel rapporto di DNA plasmidico: agente trasfezione di 2 mg (DNA) all&#39;agente trasfezione 8 mL) nel DNA contenente 1,5 mL provetta. </li><li> Incubare trasfezione miscela reagente / DNA per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere goccia a goccia 100 ml della miscela di trasfezione reagente / DNA per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti con cellule di topo AF e distribuire delicatamente vorticoso, con un volume finale di 2 ml / pozzetto. Lasciare agire per 24 h. </li><li> Il giorno dopo, indurre l&#39;espressione di fattori della Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) alimentando le cellule con mezzo fresco iPS-AF integrato con 1,5 mg / ml di doxiciclina (2 ml di mezzi per ogni pozzetto). </li><li> Nutrire le cellule ogni giorno, senza passaggio, con il mezzo DOX contenente fresco (mantenere le cellule in mezzi integrato con doxiciclina fino punto 5.13). </li><li> Osservare le cellule entro 24 ore per l&#39;espressione mCherry e tutti i giorni per la formazione di colonie (colonie compaiono tipicamente tra i 20 e 30 giorni dopo la transfezione). </li><li> Un giorno prima colonia raccolta, preparare una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con mitomicina C trattati con MEF. </li><li> Scegliere singole colonie in 50 ml di volume di usinga 200 microlitri pipetta, e trasferire in sequenza in una piastra da 96 pozzetti in singoli pozzetti. </li><li> Il giorno dopo, dissociarsi ogni colonia in singole cellule aggiungendo 50 ml di tripsina commerciale e incubare per 5 min a 37 ° C. </li><li> Pipetta su e giù per disaggregare la colonia. </li><li> Trasferire 50 ml di tripsina contenente la colonia dissociato in un nuovo pozzo con inattivato MEF su una gelatina 0,1% rivestito 96 ben piatto pieno di 100 ml di fresca media IPS-AF integrato con doxiciclina. </li><li> Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, suddiviso in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Quando le cellule raggiungono 60-70% di confluenza, raggruppati 1: 2 a due pozzetti, uno con doxiciclina e l&#39;altro senza doxiciclina, per verificare se le colonie appaiono anche nella condizione senza doxiciclina. </li><li> Continuare a mantenere cloni iPS-AF, doxiciclina indipendenti, su inattivato MEF nel medio iPS-AF. </li><li> Coltivare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2, CHAnging media giornaliera. </li></ol> 6. fosfatasi alcalina Colorazione <ol><li> Eseguire alcalina colorazione fosfatasi seguendo il protocollo del produttore ogni volta che c&#39;è la comparsa di cellule iPS-AF doxiciclina indipendenti. </li></ol> 7. immunofluorescenza <ol><li> Ogni volta che c&#39;è l&#39;aspetto delle cellule iPS doxiciclina indipendenti-AF, semi di 150.000 cellule / cm 2 su un pozzo di un 24-pozzetti con inattivato MEF, e far crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> (ATTENZIONE) Fissare le cellule aggiungendo 300 pl per pozzetto del 4% paraformaldeide (PFA) per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 300 microlitri di 0.1% NP-40 per permeabilize cellule. </li><li> Risciacquare le cellule con 300 ml di 0,1% PBS-Tween 20. </li><li> Aggiungere 300 ml di tampone di bloccaggio (siero di cavallo 10% in PBS 1x) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare i seguenti anticorpi primari: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluire SSEA1 con 1% di siero albumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,3 M glicina in 0.1% PBS-Tween-20. Diluire tutti gli altri anticorpi con 10% di siero di cavallo in 1x PBS. </li><li> Incubare gli anticorpi notte a 4 ° C. </li><li> Risciacquare con 300 ml di 0,1% PBS-Tween-20. </li><li> Usare gli anticorpi secondari diluiti in 10% di siero di cavallo in 1x PBS: capra Alexa594 coniugato anti-topo IgG (1: 200), Alexa594 coniugato IgG pollo anti-capra (1: 200), Alexa594 coniugato pollo anti-IgG di coniglio (1: 200), capra Alexa568 coniugato anti-topo IgM (1: 200). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare con PBS 1x. </li><li> nuclei macchia con soluzione di Hoechst (1: 10.000) in PBS 1x. </li></ol> 8. In Vitro cellulare Differenziazione <ol><li> Per formare goccia d&#39;attaccatura corpi embrionali (EBS), coltivare singole gocce (2.000 cellule / ml 20) sul coperchio di piastre Petri, utilizzando il mezzo di differenziazione. </li><li> Incubare i piatti a 37 ° Ce 5% CO 2 per 4 giorni. </li><li> Trasferire EBs in 100 mm piatti batterica-grade in coltura in sospensione per 3 giorni in media di differenziazione. </li><li> EB piastra in 24 e piastre rivestite con matrice di membrana basale (diluito 1:10 in DMEM) per altri 14 giorni. </li><li> Per analisi immunofluorescenza, utilizzare anticorpi primari: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37. </li></ol> Formazione 9. In Vivo Teratoma <ol><li> Iniettare 100 ml di 1x PBS contenente 1 x 10 6 cellule iPS-AF nel muscolo della arti posteriori di RAG2 - / - γc - / - mice. </li><li> Sacrificio topi tramite dislocazione cervicale 6 settimane dopo l&#39;iniezione delle cellule. </li><li> Rimuovere le masse tumorali, che si distinguono per le loro dimensioni, dalla arti posteriori dei topi per le seguenti analisi. </li><li> Tagliare 7-10 micron di spessore sezioni trasversali del tumore isopentano congelato con un criostato. </li><li> Per Ematossilina und Eosin (HE) Stain: <ol><li> Macchia con SE di valutare la composizione del tessuto tumorale, seguendo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Per Stain dell&#39;immunoperossidasi: <ol><li> Fissare sezioni teratoma con 4% PFA per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilize con 0,1% Triton X-100. </li></ol></li><li> Incubare con i seguenti anticorpi: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) e αSMA (1: 100) diluito in 1% BSA in PBS 1x. Incubare per 1 ora a 37 ° C (per Tubb3) o per una notte a 4 ° C (per gli altri anticorpi). </li><li> perossidasi blocco utilizzando il 100% di metanolo per 20 minuti. </li><li> Incubare per 45 minuti a 37 ° C con l&#39;anticorpo secondario HRP-coniugato (1: 150) anti-topo. </li><li> Risciacquare con PBS 1x. </li><li> Incubare con perossidasi (HRP) substrato (vedi Materiali Tavolo) per 5 min. </li><li> Risciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti. </li><li> Macchia con ematossilina QS per 9 sec. </li><li> Risciacquare con acqua di rubinetto. </li></ol&gt; 10. RNA Estrazione da cellule <ol><li> Utilizzare un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo consigliato dal produttore. </li></ol> 11. RNA Estrazione da teratoma <ol><li> Omogeneizzare il teratoma con un pestello e mortaio e di azoto liquido per evitare lo scongelamento del campione. </li><li> Pesare 25 mg di tessuto. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente commerciale per l&#39;estrazione di RNA e 200 ml di cloroformio. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg e 4 ° C per 15 min. </li><li> Trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta. </li><li> Per purificare l&#39;RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 12. trascrizione inversa-polimerasi Analisi Reazione a catena <ol><li> Sintetizzare il primo filamento cDNA utilizzando una trascrittasi inversa per la trascrizione inversa (RT) reazione a catena -polymerase (PCR) e oligo Accor (dT)ding il protocollo del produttore, per ottenere 50 ng / ml di cDNA. Diluire cDNA con acqua priva di RNasi ad una concentrazione di 10 ng / ml. </li><li> Eseguire RT-PCR utilizzando la DNA polimerasi secondo il protocollo del produttore, utilizzando 1 ng / ml di cDNA. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo scelto per ottenere l&#39;induzione di pluripotenza è rilevante per la sicurezza clinica cellule rispetto al trapianto di lungo termine. Oggi, ci sono diversi metodi adatti per la riprogrammazione. Tra i metodi non-integrative, il virale (SeV) vettore Sendai è un virus a RNA in grado di produrre grandi quantità di proteine senza integrare nel nucleo delle cellule infette 40 e potrebbe essere una strategia per ottenere cellule iPS. vettori SEV potrebbe essere un candidato per la generazi...

La diagnosi prenatale è un importante strumento clinico per valutare le malattie genetiche (cioè aberrazioni cromosomiche, malattie monogeniche o poligeniche / multifattoriale) e malformazioni congenite (cioè ernia diaframmatica congenita, lesioni polmonari cistiche, onfalocele, gastroschisi). Il liquido amniotico (AF), le cellule sono semplici da ottenere dalle procedure di routine in programma durante il secondo trimestre di gravidanza (cioè l&#39;amniocentesi e amnioreduction) o parti cesarei 1, 2. La disponibilità di cellule da pazienti AF prenatale o neonatale fornisce la possibilità di utilizzare questa fonte per la medicina rigenerativa, e diversi ricercatori studiato la possibilità di trattare diversi danni tissutali o malattie utilizzando una popolazione di cellule staminali isolate da AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La possibilità di ottenere facilmente cellule AF di pazienti malati, in una finestra temporale in cui la malattia è spesso stazionario, apre la strada per l&#39;idea di utilizzare questa fonte di cellule per scopi di riprogrammazione. Infatti, staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule derivate da cellule AF potrebbero essere differenziate nelle cellule di interesse per i test in vitro di droga o per gli approcci di ingegneria dei tessuti, al fine di preparare una adeguata terapia specifica per il paziente prima del parto. Molti studi hanno già dimostrato la capacità delle cellule AF da riprogrammare e differenziato in una vasta gamma di tipi di cellule 13, 14, 15, 16, 17 &lt;/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Dal momento che la scoperta da Takahashi e Yamanaka 28 di riprogrammazione delle cellule somatiche attraverso l&#39;espressione forzata di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4), sono stati compiuti progressi nel campo della riprogrammazione. Considerando i diversi metodi, possiamo distinguere tra approcci virali e non virali. Il primo si aspetta l&#39;utilizzo di vettori virali (retrovirus e lentivirus), che hanno elevata efficienza, ma silenziamento solito incompleta del transgene retrovirale, sia con la conseguenza di una linea cellulare parzialmente riprogrammato e il rischio diinserzionale mutagenesi 29, 30, 31. Il metodo non virale utilizza diverse strategie: cioè plasmidi, vettori, mRNA, proteine, trasposoni. La derivazione di cellule iPS liberi di sequenze transgeniche ha lo scopo di aggirare gli effetti potenzialmente nocivi di espressione del transgene che perde e mutagenesi inserzionale. Tra tutte le strategie non virali di cui sopra, il piggyBac (PB) Sistema di trasposoni / trasposasi richiede solo le ripetizioni terminali invertite che fiancheggiano un transgene ed espressione transitoria dell&#39;enzima trasposasi di catalizzare l&#39;inserimento o escissione eventi 32. Il vantaggio nell&#39;uso trasposoni rispetto ad altri metodi per la generazione di cellule iPS è la possibilità di ottenere cellule iPS privo di vettore con un approccio vettore non virale che mostra la stessa efficienza di vettori retrovirali. Ciò è possibile mediante escissione traccia meno della codifica trasposone integrato per la reprogramming fattori a seguito di una nuova espressione transitoria del trasposasi nelle cellule iPS 33. Dato che PB è efficiente in diversi tipi cellulari 34, 35, 36, 37, è più adatto per un approccio clinico rispetto ai vettori virali, e consente la produzione di cellule iPS libera-xeno contrariamente a protocolli di produzione virali correnti che utilizzano xenobiotico condizioni, questo sistema viene utilizzato per ottenere cellule iPS da murino AF. Di seguito vi proponiamo un protocollo dettagliato seguenti lavori già pubblicati per mostrare la produzione di iPS pluripotenti cloni di cellule di topo AF (cellule iPS-AF) 38.

<table><tbody><tr><td>Piastre di Petri di grado batterico da 100 mm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Per in vitro differenziazione</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Per AF di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione</td></tr><tr><td>Alexa568 - capra coniugata anti-topo IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Anticorpo secondario (immunofluorescenza)</td></tr><tr><td>Alexa594-pollo coniugato anti-capra IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Anticorpo secondario (immunofluorescenza)</td></tr><tr><td>Alexa594-pollo coniugato anti-coniglio IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Anticorpo secondario (immunofluorescenza)</td></tr><tr><td>Alexa594-capra coniugata anti-topo IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Anticorpo secondario (immunofluorescenza)</td></tr><tr><td>Kit fosfatasi alcalina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Colorazione con fosfatasi alcalina</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Per la selezione batterica</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Per l'estrazione di RNA</td></tr><tr><td>Cellule DH5&alfa;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Batteri per procedura</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> di clonazione <tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>Per MEF, FA di topo, cellule iPS-AF e terreno</td></tr> <tr><td>di differenziazioneDoxiciclina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Per l'espressione di fattori esogeni</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga (1,5 ml)&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.706</td><td>Per la produzione di PB&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>Per FA di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione</td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>Per pinza a</td></tr><tr><td>punta fine</td> media <td>MEF F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>Isolamento AF</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Usato 0,1%, diluito in PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>Per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x</td></tr><tr><td>Ematossilina QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Rilevamento dei nuclei</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Analisi istologica del teratoma</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Siero di cavallo per il rilevamento dei nuclei</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Per soluzione bloccante</td></tr><tr><td>HRP-coniugato capra anti-topo IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Anticorpo secondario (immunoperossidasi)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Substrato di perossidasi</td></tr><tr><td>Siringa da insulina con ago (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Procedura di amniocentesi</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Coniglio policlonale IgG</td></tr><tr><td>L-glutammina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Per FA di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione</td></tr><tr><td>LB brodo (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Per la crescita batterica</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Per cellule AF e iPS-AF di topo medio</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Per in vitro differenziazione. Diluito 1:10 in DMEM</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Blocco della perossidasi</td></tr><tr><td>MULTIWELL Piastra a 24 pozzetti</td><td>BD</td><td>Falcon 353047</td><td>Per differenziazione in vitro</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti MULTIWELL</td> BD <td>Falcon</td><td>353046</td><td>Per colture cellulari MEF, AF di topo e iPS-AF</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>IgG policlonali di coniglio</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Per AF di topo, cellule iPS-AF e mezzo di differenziazione</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>Per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>Per permeabilizzazione cellulare. Diluito in PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> monoclonale di topo <tr><td>Oligo (dT)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>per RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (soluzione)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fissativo, diluito in PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, esente da Ca2+/Mg2+. Diluito con acqua sterile per ottenere PBS 1x</td></tr><tr><td>Penicillina - Streptomicina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Per MEF, AF di topo, cellule iPS-AF e terreno di derivazione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Per colture MEF, coltura tissutale</td></tr><tr><td>PiggyBac plasmide di espressione della trasposisi</td><td>Fornito dal professor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratory-mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmide trasposone</td><td>Fornito dal professor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>Per la purificazione dei plasmidi</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Per la purificazione</td></tr> <tr><td>dei plasmidiPlasmide del trasposone del transattivatore della tetraciclina inversa</td><td>Fornito dal professor Andras Nagy</td> <td>laboratory-rtTA</td><td></td></tr> <tr><td>RNeasy Mini Kit.</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Per l'estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>IgG policlonali di capra</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td> Trascrittasi inversa <td>IgM SuperScript II monoclonale di topo</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>per RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Coniglio policlonale IgG</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Passaggio per colture cellulari</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>Per permeabilizzazione cellulare, diluito in PBS 1x</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>Per estrazione</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> RNA <tr><td>Tubb3&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G712A</td><td>Monoclonale di topo IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Per permeabilizzazione cellulare, diluito in PBS 1x</td></tr><tr><td>&alfa; fp&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R& Sistemi D</td><td>MAB1368</td><td>IgG1 monoclonale di topo</td></tr><tr><td>&alpha;SMA&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td> Reagente di trasfezione <td>IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> monoclonale di topo <tr><td>(FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>Per la trasfezione delle cellule AF</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>Per eseguire l'amniocentesi&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu; l consigli</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td><td>Per raccogliere colonie di batteri</td></tr><tr><td>Forbice</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 inox 25U</td><td>Per eseguire l'amniocentesi&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>Per pulire la parete addominale della madre gravida</td></tr><tr><td>Piastra di Petri per coltura tissutale (150 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Per l'espansione MEF</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>Per l'inattivazione MEF</td></tr><tr><td>Piastra MULTIWELL 96 pozzetti</td><td>BD</td><td>Falcon 353071</td><td>Per coltura iPS-AF</td></tr></tbody></table>

la produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido utilizzando un sistema di trasposoni

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) sono generate da cellule somatiche di topo e umane mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione definiti utilizzando metodi diversi. Qui, abbiamo prodotto cellule iPS da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale. Tutte le linee cellulari iPS ottenute hanno mostrato le caratteristiche delle cellule pluripotenti, inclusa la capacità di differenziarsi verso derivati di tutti e tre gli strati germinali in vitro e in vivo. Questa strategia apre la possibilità di utilizzare cellule di feti malati per sviluppare nuove terapie per i difetti alla nascita.

Per valutare la capacità di riprogrammazione, le cellule del mouse AF sono stati raccolti da feti di topi GFP. Le cellule sono state trasfettate con il plasmide trasposoni circolare PB-tetO2-IRES-OKMS, che esprime i fattori di Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4) legati alla proteina fluorescente mCherry in maniera doxiciclina-inducibile, e invertire tetraciclina transactivator (PB CAG-rtTA) plasmidi insieme con il plasmide espressione trasposasi (mPBase). Cellule di topo AF sono state tra...

In questo studio, generiamo cellule staminali pluripotenti indotte da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale.

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e riprogrammare le cellule del liquido amniotico murino utilizzando un sistema di trasposoni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire. In un contesto terapeutico, le cellule dei feti umani possono essere differenziate da cellule di interesse per test farmacologici o ingegneria tissutale, al fine di preparare in altro modo la terapia specifica del paziente prima del parto.Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave della programmazione. Il sistema di trasposoni è efficiente in diversi tipi di cellule. È più adatto per l'approccio clinico rispetto ai vettori virali e consente la produzione di cellule IPS prive di ossino.Per iniziare l'isolamento, pulire la parete addominale della diga utilizzando il 70% di etanolo. Usando le forbici, eseguire una laparotomia della linea mediana, incidendo la lunghezza della parete addominale per accedere alla cavità addominale. Usa una pinza per esporre l'utero e poi asportalo usando le forbici.Trasferire l'utero in una capsula da 100 millimetri riempita con 1xPBS sterile e tenere in ghiaccio. Posizionare la capsula sotto uno stereomicroscopio a 10X e tenere l'utero con una pinza mentre si rimuove la parete uterina con le forbici, facendo attenzione a non danneggiare le membrane fetali. Raccogli i feti in un piatto da 100 millimetri riempito con 1XPBS sterile e mettili sul ghiaccio.Afferrare la placenta di un feto con la pinza a punta fine e spostarla in un piatto pulito da 100 millimetri. Qui, rimuovi con cautela il sacco vitellino. Interrompere l'amnio usando la pinza e usando una siringa da insulina, raccogliere 30 microlitri di liquido amniotico.Trasferire il fluido in una fiala conica da 15 millilitri. Ripetere questo processo per ogni feto, raccogliendo ogni volta il fluido nella stessa fiala. Successivamente, lavare ogni feto con 1XPBS sterile integrato con l'uno per cento di siero fetale bovino e raccoglierlo nel tubo conico da 15 millilitri insieme al liquido amniotico.Centrifugare la provetta a 145 volte G per cinque minuti e poi, sotto una cappa a flusso laminare, rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule pellettate in due millilitri di terreno di coltura di liquido amniotico. Prendi una piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina zero virgola uno per cento contenente fibroblasti embrionali di topo trattati con miomicina-C o MEF e poi semina due millilitri di cellule sulla piastra.Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica, cambiando il mezzo a giorni alterni. Continuare la coltura per sette giorni fino a quando le cellule sono pronte per la trasfezione. Per iniziare la trasfezione, in una provetta da microcentrifuga da uno virgola cinque millimetri, mescolare un microgrammo di plasmide trasposone con zero virgola cinque microgrammi di plasmide di espressione della trasposasi e zero virgola cinque microgrammi di plasmide transattivatore della tetraciclina inversa.Diluire a 100 microlitri utilizzando d-man. Aggiungere otto microlitri di reagente di trasfezione nella provetta per microcentrifuga contenente il DNA. Incubare questa miscela per 15 minuti a temperatura ambiente.Prendendo la piastra a sei pozzetti con cellule AF di topo, aggiungere goccia a goccia 100 microlitri della miscela di DNA dell'agente di trasfezione per pozzetto, distribuendo mediante roteazione delicata con un volume finale di due millilitri per pozzetto. Lasciare le celle per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque percento. Il giorno seguente, rimuovere il terreno di coltura e quindi alimentare ogni pozzetto di cellule con due millilitri di terreno iPS AF fresco integrato con un virgola cinque microgrammi per millilitro di doxiciclina per indurre l'espressione dei fattori di Yamanaka.Nutrire le cellule ogni giorno con terreno fresco contenente dox senza passaggio da questo punto in poi. Osservare le cellule al microscopio a fiorescenza entro 24 ore dal primo trattamento con doxicilcina per cercare qualsiasi espressione di mCherry e da questo momento in poi ogni giorno per la formazione di colonie. Una volta osservata la formazione di colonie, raccogliere le singole colonie in 50 microlitri di terreno di coltura cellulare.Successivamente, trasferirli in sequenza in pozzetti separati di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con MEF trattato con mitomicina c. Il giorno seguente, aggiungere 50 microlitri di tripsina a ciascun pozzetto e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius per dissociare le colonie in singole cellule. Dopo l'incubazione, pipettare il liquido su e giù per disaggregare ulteriormente le colonie.Trasferire 50 microlitri della miscela di cellule di tripsina in un nuovo pozzetto contenente MEF inattivato e quindi rimettere le cellule nell'incubatore. Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, dividerle in un nuovo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e quindi continuare l'incubazione a temperatura ambiente. Una volta che queste cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, capovolgere le cellule una o due in due pozzetti, uno contenente doxiciclina e uno senza per verificare che le colonie cresceranno anche in assenza di doxiciclina.Continuare a mantenere le colonie IPS AF e il terreno indipendente dalla doxiciclina su MEF inattivato a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque percento. Cambia il terreno ogni giorno fino a quando le cellule non sono pronte per la colorazione, l'imaging e l'estrazione dell'RNA. Qui, le cellule pleuriotiche GFP positive di topo amniotiche indotte da doxiciclina indipendenti dalla doxiciclina stabile esprimono i marcatori di pleuripotenza necessari per confermare il successo della riprogrammazione.L'analisi RTPCR utilizzando cellule ES R1 come controllo ha mostrato l'espressione dei marcatori di pleuripotenza indotta in presenza o assenza di doxiciclina. L'espressione del gene housekeeping, la beta due microglobulina, è stata osservata anche in tutti e tre i tipi di cellule. I teratomi isolati da topi iniettati con le cellule pleuropotenti indotte sono stati immunocolorati.Il rilevamento della proteina alfa fetale, dell'actina alfa della muscolatura liscia e della beta tre tubulina nelle masse conferma la differenziazione cellulare in tutti e tre gli strati germinali, ectoderma, mesoderma ed endoderma. Inoltre, l'analisi RTPCR di corpi embrioidi in vitro e cellule di teratoma in vivo conferma l'espressione di geni marcatori specifici dello strato germinale per il mesoderma, l'endoderma e l'ectoderma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e riprogrammare le cellule del liquido amniotico murino.Si tratta di una procedura semplice e sicura che può essere applicata anche alle cellule del liquido amniotico umano da un campione ottenuto da diagnosi di routine o tagli cesarei.

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Biologia dello sviluppo

Questo video mostra la procedura per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte con lentivirus inducibile che esprimono Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4.

Generare cellule iPS dal MEF attraverso l&#39;espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Il Stemgent inducibile Dox Mouse Set TF Lentivirus possibile riprogrammare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) per pluripotenti indotte staminali (iPS), cellule. Qui mostriamo il protocollo per DOX-inducibile espressione di fattori di trascrizione del mouse riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc di generare colonie iPS che esprimono i marcatori comune MES pluripotenza.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Il fibroblasto embrionale di topo può essere riprogrammato in cellule staminali pluripotenti indotte a bassa efficienza dall'espressione forzata dei fattori di trascrizione Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. I rari intermedi della reazione di riprogrammazione sono FACS isolati tramite marcatura con anticorpi contro i produttori di superficie cellulare Thy-1.2, Ssea-1 ed Epcam.

Marker cellulare superficiale Purificazione mediata di cellule iPS intermedi da un modello riprogrammabile mouse

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Questo protocollo descrive la riprogrammazione di primaria amniotico liquido e membrana di cellule staminali mesenchimali in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un approccio episomal non-integrazione in condizioni completamente chimicamente definite. Procedure di estrazione, cultura, riprogrammazione e caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte risultanti dai rigorosi metodi sono dettagliate.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Presentiamo qui un metodo che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte da cellule del liquido amniotico murino utilizzando un sistema di trasposoni non virale. Questo metodo sicuro facilita terapie personalizzate prima della nascita.

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

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