La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e riprogrammare le cellule del liquido amniotico murino utilizzando un sistema di trasposoni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da eseguire. In un contesto terapeutico, le cellule dei feti umani possono essere differenziate da cellule di interesse per test farmacologici o ingegneria tissutale, al fine di preparare in altro modo la terapia specifica del paziente prima del parto.

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave della programmazione. Il sistema di trasposoni è efficiente in diversi tipi di cellule. È più adatto per l'approccio clinico rispetto ai vettori virali e consente la produzione di cellule IPS prive di ossino.

Per iniziare l'isolamento, pulire la parete addominale della diga utilizzando il 70% di etanolo. Usando le forbici, eseguire una laparotomia della linea mediana, incidendo la lunghezza della parete addominale per accedere alla cavità addominale. Usa una pinza per esporre l'utero e poi asportalo usando le forbici.

Trasferire l'utero in una capsula da 100 millimetri riempita con 1xPBS sterile e tenere in ghiaccio. Posizionare la capsula sotto uno stereomicroscopio a 10X e tenere l'utero con una pinza mentre si rimuove la parete uterina con le forbici, facendo attenzione a non danneggiare le membrane fetali. Raccogli i feti in un piatto da 100 millimetri riempito con 1XPBS sterile e mettili sul ghiaccio.

Afferrare la placenta di un feto con la pinza a punta fine e spostarla in un piatto pulito da 100 millimetri. Qui, rimuovi con cautela il sacco vitellino. Interrompere l'amnio usando la pinza e usando una siringa da insulina, raccogliere 30 microlitri di liquido amniotico.

Trasferire il fluido in una fiala conica da 15 millilitri. Ripetere questo processo per ogni feto, raccogliendo ogni volta il fluido nella stessa fiala. Successivamente, lavare ogni feto con 1XPBS sterile integrato con l'uno per cento di siero fetale bovino e raccoglierlo nel tubo conico da 15 millilitri insieme al liquido amniotico.

Centrifugare la provetta a 145 volte G per cinque minuti e poi, sotto una cappa a flusso laminare, rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule pellettate in due millilitri di terreno di coltura di liquido amniotico. Prendi una piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina zero virgola uno per cento contenente fibroblasti embrionali di topo trattati con miomicina-C o MEF e poi semina due millilitri di cellule sulla piastra.

Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica, cambiando il mezzo a giorni alterni. Continuare la coltura per sette giorni fino a quando le cellule sono pronte per la trasfezione. Per iniziare la trasfezione, in una provetta da microcentrifuga da uno virgola cinque millimetri, mescolare un microgrammo di plasmide trasposone con zero virgola cinque microgrammi di plasmide di espressione della trasposasi e zero virgola cinque microgrammi di plasmide transattivatore della tetraciclina inversa.

Diluire a 100 microlitri utilizzando d-man. Aggiungere otto microlitri di reagente di trasfezione nella provetta per microcentrifuga contenente il DNA. Incubare questa miscela per 15 minuti a temperatura ambiente.

Prendendo la piastra a sei pozzetti con cellule AF di topo, aggiungere goccia a goccia 100 microlitri della miscela di DNA dell'agente di trasfezione per pozzetto, distribuendo mediante roteazione delicata con un volume finale di due millilitri per pozzetto. Lasciare le celle per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque percento. Il giorno seguente, rimuovere il terreno di coltura e quindi alimentare ogni pozzetto di cellule con due millilitri di terreno iPS AF fresco integrato con un virgola cinque microgrammi per millilitro di doxiciclina per indurre l'espressione dei fattori di Yamanaka.

Nutrire le cellule ogni giorno con terreno fresco contenente dox senza passaggio da questo punto in poi. Osservare le cellule al microscopio a fiorescenza entro 24 ore dal primo trattamento con doxicilcina per cercare qualsiasi espressione di mCherry e da questo momento in poi ogni giorno per la formazione di colonie. Una volta osservata la formazione di colonie, raccogliere le singole colonie in 50 microlitri di terreno di coltura cellulare.

Successivamente, trasferirli in sequenza in pozzetti separati di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con MEF trattato con mitomicina c. Il giorno seguente, aggiungere 50 microlitri di tripsina a ciascun pozzetto e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius per dissociare le colonie in singole cellule. Dopo l'incubazione, pipettare il liquido su e giù per disaggregare ulteriormente le colonie.

Trasferire 50 microlitri della miscela di cellule di tripsina in un nuovo pozzetto contenente MEF inattivato e quindi rimettere le cellule nell'incubatore. Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, dividerle in un nuovo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e quindi continuare l'incubazione a temperatura ambiente. Una volta che queste cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, capovolgere le cellule una o due in due pozzetti, uno contenente doxiciclina e uno senza per verificare che le colonie cresceranno anche in assenza di doxiciclina.

Continuare a mantenere le colonie IPS AF e il terreno indipendente dalla doxiciclina su MEF inattivato a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque percento. Cambia il terreno ogni giorno fino a quando le cellule non sono pronte per la colorazione, l'imaging e l'estrazione dell'RNA. Qui, le cellule pleuriotiche GFP positive di topo amniotiche indotte da doxiciclina indipendenti dalla doxiciclina stabile esprimono i marcatori di pleuripotenza necessari per confermare il successo della riprogrammazione.

L'analisi RTPCR utilizzando cellule ES R1 come controllo ha mostrato l'espressione dei marcatori di pleuripotenza indotta in presenza o assenza di doxiciclina. L'espressione del gene housekeeping, la beta due microglobulina, è stata osservata anche in tutti e tre i tipi di cellule. I teratomi isolati da topi iniettati con le cellule pleuropotenti indotte sono stati immunocolorati.

Il rilevamento della proteina alfa fetale, dell'actina alfa della muscolatura liscia e della beta tre tubulina nelle masse conferma la differenziazione cellulare in tutti e tre gli strati germinali, ectoderma, mesoderma ed endoderma. Inoltre, l'analisi RTPCR di corpi embrioidi in vitro e cellule di teratoma in vivo conferma l'espressione di geni marcatori specifici dello strato germinale per il mesoderma, l'endoderma e l'ectoderma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e riprogrammare le cellule del liquido amniotico murino.

Si tratta di una procedura semplice e sicura che può essere applicata anche alle cellule del liquido amniotico umano da un campione ottenuto da diagnosi di routine o tagli cesarei.