A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging
6 ottobre 2016
Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di eseguire l'imaging a lungo termine, ad alta risoluzione, di una singola cellula del polmone intatto utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro; Ad esempio, quali interazioni assicurano tra lo stroma e le cellule tumorali durante le prime fasi della metastasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il polmone vivo e intatto può essere visualizzato teoricamente con una risoluzione di una singola cellula per un massimo di 12 ore.
Inizia legando una sutura 2-0 lunga tre pollici a un catetere tracheale, un quarto di pollice sopra la boccola, con un doppio nodo. Quindi applicare un unguento per gli occhi sugli occhi di un topo anestetizzato e utilizzare una crema depilatoria per rimuovere i peli dal lato sinistro dell'animale dalla linea mediana del torace a un quarto della schiena e dall'ascella a appena sotto la gabbia toracica. Pulisci la lozione in eccesso e sterilizza la pelle esposta con etanolo al 70%.
Quindi, intuba l'animale. E lega la sutura 2-0 attorno al muso, sotto i denti anteriori. Spostare l'animale nell'area chirurgica, facendo attenzione a non spostare i cateteri, e accendere il ventilatore.
Collegare il ventilatore al catetere tracheale. Quindi fissare il catetere al muso e l'arto anteriore sinistro al catetere. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi, utilizzare le forbici affilate per rimuovere un centimetro quadrato di pelle sopra la parete toracica sinistra.
Sollevare il cuscinetto adiposo mammario e cauterizzare eventuali vasi sanguigni esposti. Quindi, seziona il cuscinetto adiposo e rimuovi lo strato muscolare fino alla gabbia toracica, facendo attenzione a non tagliare la vena ascellare alla base dell'arto anteriore. Usa il forcipe per sollevare la sesta costola.
Quindi, tenendo le forbici affilate a un angolo di cinque gradi poco profondo, taglia la costola vicino al bordo dell'apertura nella pelle. Rimuovere quattro costole consecutive per allargare l'apertura nella parete toracica, esponendo l'intero lobo polmonare. Quindi trasferire con cura il mouse sul tavolino di imaging del microscopio.
Con l'aspirapolvere spento, riempire la camera interna della finestra del vuoto con PBS. Capovolgere il mouse e posizionare il polmone esposto sopra la finestra del vetrino coprioggetti per immagini a vuoto. Lentamente, accendi l'aspirapolvere.
Posizionare un'imbracatura di contenimento, fatta di carta velina piegata a metà, due volte sul petto del topo e fissare l'imbracatura alla piastra del tavolino. Quindi attacca un pulsossimetro alla zampa dell'animale. Posizionare quindi la camera ambientale sul tavolino e accendere il fuoco per mantenere il mouse ad una temperatura fisiologica.
Quando l'animale è in posizione, avvicinare l'obiettivo ad apertura numerica 25 x 95 al vetrino coprioggetti. Nella modalità di epifluorescenza, visualizza il canale fitzy e metti a fuoco il tessuto polmonare. Quindi, caricare una siringa sterile con 100 microlitri di sospensione di cellule tumorali, rimuovere la siringa di PBS dal catetere della vena caudale e collegare la siringa delle cellule tumorali.
Iniettare lentamente le cellule tumorali nella vena caudale. Quindi ricollegare la siringa PBS al catetere della vena caudale e localizzare le cellule tumorali in tutto il tessuto polmonare tramite il microscopio oculare. Ora sostituisci la siringa PBS con una siringa caricata con 100 microlitri di destrano di rodamina e inietta lentamente il destrano nel topo tramite il catetere di coda.
Seguire la somministrazione del destrano con un lavaggio sterile PBS da 50 microlitri. Quindi ottenere immagini in ciascuna delle posizioni delle cellule tumorali precedentemente localizzate per visualizzare il flusso e l'integrità del sistema vascolare. Ventiquattro ore dopo l'iniezione, è possibile visualizzare singole cellule tumorali che interagiscono con macrofagi e monociti all'interno del sistema vascolare.
La stabilità dell'imaging è tale da consentire l'acquisizione di Z-stack sequenziali del campo e la generazione di una ricostruzione tridimensionale. Qui, viene mostrato un mosaico cinque per cinque di campi di imaging, che coprono un campo visivo di 890 micron, oltre 200 minuti e cinque minuti, a 15 micron sotto la superficie del polmone di una singola lesione metastatica, 12 giorni dopo l'iniezione. Nonostante l'ampio campo visivo, l'alta risoluzione dei fotogrammi sottostanti, che compongono il mosaico, consente la cattura di eventi subcellulari, come la mitosi di una singola cellula, come evidenziato dalla separazione cromosomica.
L'iniezione intravascolare di un destrano marcato in fluorescenza ad alto peso molecolare determina la marcatura del lume vascolare; Tuttavia, eritrociti e leucociti circolanti non marcati possono occludere il destrano. Nei piccoli capillari del polmone, questa occlusione provoca un lampeggiamento del segnale del destrano e una perdita di definizione nei confini vascolari. L'elevata stabilità spaziale, fornita da questo protocollo, consente la media temporale del canale sanguigno senza offuscamento, ripristinando così le occlusioni temporanee.
Gli altri canali del segnale possono quindi essere sovrapposti al sistema vascolare per fornire una visione chiara dei confini del vaso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione a non tagliare i grandi vasi sanguigni senza prima averli cauterizzati e di evitare di toccare del tutto il tessuto polmonare.
Seguendo questa procedura, è possibile visualizzare le prime fasi della disseminazione e della proliferazione delle cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging intravitale nel polmone intatto con una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto. Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso della microscopia a fotoni multipli per eseguire in tempo reale imaging cellulare singolo ad alta risoluzione e a lungo termine del polmone intatto, mediante una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sul cancro relative alle interazioni tra cellule stromali e tumorali durante la metastasi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ricerca sul cancro
Sfondo
- L'immagineggiatura a lungo termine di tessuti vivi è fondamentale per comprendere le interazioni cellulari.
- La microscopia a fotoni multipli consente un'immagineggiatura ad alta risoluzione.
- Questa tecnica può visualizzare il polmone integro a risoluzione cellulare singola.
- Comprendere la metastasi è essenziale per lo sviluppo di terapie antitumorali.
Scopo dello studio
- Visualizzare le interazioni tra cellule stromali e cellule tumorali.
- Migliorare la comprensione delle fasi iniziali della metastasi.
- Fornire un metodo per l'immagine a lungo termine del tessuto polmonare.
Metodi Utilizzati
- Microscopia a fotoni multipli per l'acquisizione di immagini.
- Utilizzo di una finestra di acquisizione stabilizzata sotto vuoto.
- Preparazione del modello murino per l'acquisizione di immagini.
- Somministrazione di anestetici e unguento oftalmico per il benessere dell'animale.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del polmone integro per un periodo fino a 12 ore.
- Acquisizione di immagini ad alta risoluzione di singole cellule.
- Approfondimenti sulle interazioni cellulari durante la metastasi.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo nell'imaging in vivo.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento potente per la ricerca sul cancro.
- L'imaging a lungo termine può rivelare processi biologici fondamentali.
- Ulteriori studi possono basarsi su questa tecnica per ottenere informazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'immagine intravitale a lungo termine del polmone integro consente l'osservazione diretta di eventi metastatici precoci con risoluzione a livello di singola cellula, colmando una lacuna critica nella ricerca preclinica sul cancro. Questa capacità supporta la riduzione del rischio meccanicistica attraverso la visualizzazione delle interazioni tra tumore e stroma e della dinamica vascolare in un contesto fisiologicamente rilevante. Tali informazioni migliorano la validazione degli obiettivi terapeutici e l'affidabilità predittiva nei percorsi di scoperta di farmaci oncologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra cellule tumorali e componenti stromali durante l'insorgenza della metastasi.
- Valore operativo: Fornisce una validazione funzionale di bersagli attraverso l'osservazione diretta dei fenotipi cellulari in tessuti integri.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando i principali fattori molecolari responsabili dell'insediamento metastatico precoce.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative delle interazioni cellula-cellula, della dinamica della membrana e della perfusione per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Stabilisce condizioni di imaging riproducibili per un periodo di 12 ore, consentendo una valutazione costante degli effetti dei composti.
- Scalabilità: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per flussi di lavoro di screening ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica mantenendo la rilevanza fisiologica durante l'osservazione longitudinale.
- Decisioni basate sul rischio: Guida i criteri di avanzamento attraverso la visualizzazione di eventi subcellulari come la mitosi e l'integrità vascolare.
- Allineamento dei biomarcatori: Permette la correlazione tra fenotipi ottenuti mediante imaging e potenziali biomarcatori traslazionali del potenziale metastatico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi all'identificazione del composto attivo fino alla validazione preclinica, fornendo dati dinamici e quantitativi sui processi metastatici.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica chiarificando le interazioni tra cellule stromali e tumorali che determinano la sopravvivenza e la crescita iniziali.
- Screening: Fornisce condizioni standardizzate e pronte all'uso con letture quantitative dei vasi e delle cellule per lo screening di composti.
- Analisi: Permette la media temporale e la ricostruzione tridimensionale per estrarre segnali vascolari stabili e dinamiche subcellulari destinate all'analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Mantiene l'integrità del sistema rilevante per la malattia dalla fase di scoperta fino alle fasi precliniche, supportando osservazioni allineate ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging intravitale riutilizzabile, applicabile in diversi progetti di oncologia che richiedono modelli di metastasi polmonari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di metastasi attraverso la visualizzazione diretta e a lungo termine delle interazioni cellulari.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione grazie a una finestra stabilizzata a vuoto e a controlli ambientali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo informazioni precoci e predittive sulla competenza metastatica.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati in base agli effetti anti-metastatici osservati in tessuti integri.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specialistiche in chirurgia intravitale, microscopia a due fotoni ed elaborazione delle immagini per la ricostruzione vascolare.
- È subordinato a strumentazione specializzata, tra cui finestra di imaging stabilizzata a vuoto, camera ambientale e obiettivi ad alta apertura numerica (NA).
- Necessita di una standardizzazione congiunta tra i team chirurgici, di imaging e di analisi per ottenere risultati coerenti.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si estenda ad altri modelli tumorali o contesti genetici.
- È limitato dalla complessità tecnica della chirurgia toracica e dalla necessità di un accesso vascolare preciso e di una stabilizzazione del polmone.
