Name: A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Impara la microscopia intravitale a lungo termine nel polmone intatto utilizzando una finestra di imaging stabilizzata a vuoto. Questo metodo consente l'imaging a risoluzione cellulare per studiare le interazioni stroma-tumore nella metastasi.

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Questa ricerca è stata supportata dal NIH-CA100324, il P30CA013330 di sostegno al centro oncologico dell'Einstein National Cancer Institute, R01CA172451 a JWP e all'Integrated Imaging Program. Questa tecnologia è stata sviluppata nel Gruss-Lipper Biophotonics Center e nell'Integrated Imaging Program presso l'Albert Einstein College of Medicine. Riconosciamo il sostegno di questi Centri in questo lavoro. Gli autori ringraziano Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon e Anthony Leggiadro dell'officina meccanica Einstein per la loro abile e tempestiva maestria, il laboratorio di Matthew Krummel per aver generosamente condiviso i loro disegni di progettazione delle finestre, Kevin Elicieri e Jeremy Bredfeldt per la loro esperienza in microscopia e le loro raccomandazioni sugli amplificatori e Allison Harney e Bojana Gligorijevic per le discussioni informative.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ad alta risoluzione in vivo imaging ottico in combinazione con le etichette funzionali fluorescente come proteine e anticorpi ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della cascata metastatica. Ha permesso la visualizzazione diretta e la quantificazione di cella singola e parametri sub-cellulare nelle cellule tumorali, cellule ospiti e la loro microambiente. Questo l&#39;imaging all&#39;interno del tumore primario ha portato, ad esempio, alla scoperta di microambienti discreti, a sostegno di una invasio...

Imaging ad alta risoluzione ottica intravitale ha dimostrato di essere fondamentale per comprendere molti processi biologici, permettendo a cella singola e parametri sub-cellulari da misurare e quantificare. Nella ricerca cancro, l&#39;imaging intravitale delle cellule tumorali e stromali ha portato alla scoperta di molte interazioni microambientali 6-11 che sono presenti solo in animali intatti. Scoperte circa microambienti associati intravasation e la diffusione delle cellule tumorali nel cancro al seno con l&#39;imaging ottico risoluzione di singola cellula in vivo ha anche portato a nuovi marcatori per la prognosi e la risposta al trattamento in pazienti con cancro mammario 12-16. Le migliori tecnologie di imaging disponibili per la visualizzazione in profondità all&#39;interno intatti gli organi vitali interni sono le modalità clinici (risonanza magnetica, PET, CT), che offrono una vista eccellente di tutta organo e possono rivelare patologie ancor prima che essi producono sintomi clinici. Non sono in grado, however, per rivelare le prime fasi di metastasi e dei meccanismi cellulari di guida progressione del tumore a causa della loro mancanza di risoluzione di singola cellula. Per il momento in metastasi polmonari sono visibili in queste modalità, sono ben stabiliti e proliferare. Data la stima che il 90% delle cellule disseminate tumorali che arrivano al polmone o non sopravvivono 17 o inizialmente rimangono dormienti 18, e l&#39;osservazione che arrivano molto prima di quanto precedentemente previsto 19, l&#39;imaging le prime fasi di arrivo e la sopravvivenza diventa cruciale per la comprensione del processo di semina metastatico e la ricorrenza della crescita tumorale in siti distanti. L&#39;esecuzione di queste osservazioni nel polmone si è dimostrato estremamente difficile tuttavia; la stragrande maggioranza degli studi di imaging hanno utilizzato ex vivo o espianto preparati 20-23, che solo danno una visione nei polmoni in momenti singoli. Mentre questi preparativi forniscono informazioni utilirmazioni, non danno una comprensione completa delle interazioni, rapporti di causa ed effetto, e dinamiche che si verificano tra i vari componenti del microambiente. La mancanza di un adeguato sistema circolatorio (e squilibrio concomitante di omeostasi) e la disconnessione dal resto del sistema immunitario del corpo rende desideravano convalidare le conclusioni che queste preparazioni generano nel tessuto intatto in vivo. Molti gruppi hanno eseguito l&#39;imaging intravitale del polmone intatto 2,4,5,24-33 con Wearn e tedesco essere il primo a chirurgicamente esporre lo strato pleurico 24 e Terry il primo a utilizzare una finestra di imaging impiantabile 25. immagini ad alta risoluzione nel polmone è fortemente ostacolata dal movimento costante del polmone e diverse tecniche sono state sviluppate per superare questa limitazione. Wagner e Filley 27 hanno studiato il movimento naturale del polmone caninoe progettato loro protocollo chirurgico per localizzare loro finestra impiantato su una regione relativamente fisso mentre Wagner utilizzata vuoto nella sua finestra preparazione chirurgica per immobilizzare il tessuto 28. Da quel momento, una varietà di tecniche sono state utilizzate per l&#39;immagine polmone tra cui: bloccaggio bronchi, apnea sequenziale e di imaging gated, acquisizione sovracampionato, incollaggio del lobo polmonare e aspirazione 34. Ognuno di questi ha i suoi vantaggi e svantaggi e nessuno tecnica è emerso come superiore ad un altro 34. Ad esempio, bronchi bloccaggio e apnea sequenziale alterano il normale scambio di gas nei polmoni e possono causare atelettasia. l&#39;imaging Gated e l&#39;acquisizione sovracampionato non soffrono di questi svantaggi, ma richiedono ad alta velocità o di apparecchiature di imaging specializzata non ampiamente accessibile. Infine sia incollaggio del polmone e la tecnica del vuoto evitare entrambi gli inconvenienti sopra citati, ma che possono mostrare lesioni forza indotta taglio se cura non è takit. Negli ultimi anni, la finestra di vuoto è stato miniaturizzato e adattato per l&#39;uso nei topi utilizzando confocale e microscopia multifotonica 4,5,33 e eccellente imaging ad alta risoluzione è stato raggiunto 2. La tabella 1 riassume questa ricca storia ed esalta quelle carte che descrivono romanzo avanzamenti nella l&#39;uso di finestre di imaging polmonare intravitale. Questo protocollo descrive l&#39;uso di prolungato time-lapse multiphoton intravitale microscopia a immagine di metastasi nel vivo, polmone intatto con la massima risoluzione possibile subcellulare. Le immagini sono acquisite fino a 12 ore utilizzando un microscopio multifotone dotato di elevata apertura numerica della lente obiettivo e rivelatori tubo fotomoltiplicatore multipla (PMT). modelli di topi transgenici sono utilizzati per etichetta fluorescente macrofagi native con fluorescente ad alta destrano peso molecolare e proteine ​​transfettate cellule tumorali fluorescenti (per etichettare le cellule tumorali e sistema vascolare respectively). Anche se questa scelta di cellule fluorescente consente la visualizzazione delle interazioni cellula-macrofagi cellule endoteliali tumorali e le dinamiche, questo protocollo funziona per qualsiasi ceppo di topo fluorescenti o non fluorescente. Dopo l&#39;acquisizione, il movimento residuo di deriva (se presente) viene eliminata con un plug-in Fiji 35,36 e personalizzati macro tempo medio del canale vascolare per eliminare lampeggiante causata da cellule del sangue circolanti senza etichetta. Mentre questo protocollo concentra sull&#39;imaging metastasi, le tecniche sono applicabili a molti altri processi biologici osservabili con l&#39;imaging cella singola ad alta risoluzione nel polmone.

<table><tbody><tr><td>Regolatore di vuoto in ottone nichelato 1/8 NPT femmina, con manometro, 0 - 20" Hg Vuoto</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>Regolatore di vuoto</td></tr><tr><td>Adattatore per tubo spinato in ottone per tubo flessibile da 1/4" ID x 1/8" NPTF Tubo maschio</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Adattatore per tubo flessibile con regolatore di vuoto</td></tr><tr><td>Palloni filtranti di marca Pyrex con tubazione; Collo lavorato per tappo in gomma n. 4; Capacità: 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>Flacone sottovuoto</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti rotondi in vetro Spessore #1,5, 0,16 - 0,19 mm 10 mm di diametro.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Exel International Safelet monouso Cateteri per flebo; 22 g x 1 poll.</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>Catetere tracheale</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Suture di seta intrecciate nere, ETHICON LIGAPAK Bobina di erogazione Misura 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Stringa</td></tr><tr><td>liquida Super colla, trasparente, 0.14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Colla cianoacrilica</td></tr><tr><td>Isotiocianato di tetrametilrodamina Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD Destrano</td></tr><tr><td>da laboratorio Tubo in PVC Tygon trasparente, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Spessore parete, 25 piedi di lunghezza</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>Tubi sottili e Tubi per</td></tr><tr><td>tubi in polietilene resistente alle crepe Luer, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" spessore della parete, bianco, 50 piedi di lunghezza&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>Tubi spessi</td></tr><tr><td>Lozione depillatoria</td><td></td> <td>Nair-Micro</td><td></td></tr> <tr><td>Medical Tubing 95 Durometer LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Tubo per catetere della vena caudale</td></tr><tr><td>30 G x 1 poll. Ago BD PrecisionGlide Aghi</td><td>BD</td><td>305128</td><td>per catetere della vena caudale</td></tr><tr><td>Puritan Tamponi non sterili con punta in cotone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo per tubo spinato in policarbonato trasparente, riducente dritto per tubo da 3/32" x 1/16" ID</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Connettori tra tubi</td></tr><tr><td>Tappi in gomma monoforo Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-135F</td><td>Tappo per pallone da vuoto</td></tr><tr><td>Punte barriera di precisione SHARP, per P-100, 100 e micro; l</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>Punta per pipetta</td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Salute degli animali</td><td>008897</td><td>Unguento oftalmico</td></tr><tr><td>Kit per cauterizzazione Gemini</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>Penna per cauterizzazione 726067</td><td></td></tr><tr><td>pinza per micro dissezione; Seghettato; leggera curva; Larghezza della punta 0,8 mm; 4" di lunghezza</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>forcipe</td></tr><tr><td>Forbici da microdissezione extra fini 4" dritte affilate/affilate 24 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>Forbici affilate</td></tr><tr><td>Forbici da micro dissezione 4" Dritte smussate/smussate</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td><td>Salviette per forbici smussate</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>imbracatura</td></tr><tr><td>PhysioSuite System</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Vitals Monitor</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml, Tubercolina Slip Tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Siringa</td></tr><tr><td>Cianoacrilato</td><td>Graffe</td><td>LOC1647358</td><td>Cover Slip Adesivo</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td><td>Adattatore barriera all'acqua</td></tr><tr><td>Luer Cannulla 1,5 - 2,2 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>734118</td><td>Connettore per catetere</td></tr><tr><td>FisioSuite MouseSTAT Pulsossimetro</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Pulsossimetro</td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurano)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Valvola a sfera in PVC, Push to Connect, 1/4 di pollice</td><td>Grainger</td><td>3CGJ7</td><td>Ventilatore</td></tr> per piccoli animali con valvola a vuoto <tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>683</td><td>L'alternativa è disponibile da Kent Scientific: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Siero ridotto Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>026051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotone</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Alternativa al cannocchiale personalizzato</td></tr><tr><td>Involucro ambientale</td> Camera di <td>precisione in plastica</td><td>per FV1000</td><td>Alternativa all'involucro personalizzato</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di potenza laser</td> Campo <td>coerenteMaxIITOP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Testa del misuratore di potenza laser</td><td>Coerente</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Clover Vettore di proteine fluorescenti</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 Solfato Antibiotico selettivo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Fluorescente-Attiva Smistatore cellulare&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura da 60 mm</td><td>Piastra di coltura Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm</td><td>Piastra di coltura Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Laboratorio di Topo</td><td>Jackson</td><td>000664&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kim Salviette</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

a lungo termine ad alta risoluzione intravitale microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra imaging

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasi a siti secondari come il polmone, fegato e osso è un evento traumatico con un tasso di mortalità di circa il 90% 1. Di questi siti, il polmone è il più difficile da valutare utilizzando imaging ottico intravitale grazie alla sua posizione chiusa all&#39;interno del corpo, delicatezza e ruolo essenziale nel sostenere corretta fisiologia. Mentre le modalità cliniche (tomografia ad emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (CT)), sono in grado di fornire immagini non invasive di questo tessuto, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i primi eventi di semina, con un singolo pixel composto da quasi un migliaio di cellule. I modelli attuali di metastasi polmonari semina postulato che gli eventi subito dopo l&#39;arrivo di una cellula tumorale sono deterministico per la sopravvivenza e la successiva crescita. Ciò significa che in tempo reale strumenti di imaging intravitale con risoluzione singola cella 2 sono necessari per definire i fenotipi della cel seminaLS e testare questi modelli. Mentre l&#39;imaging ottico ad alta risoluzione del polmone è stato eseguito utilizzando vari ex vivo i preparativi, questi esperimenti sono in genere saggi di tempo a punto singolo e sono suscettibili di manufatti e le possibili conclusioni errate a causa dell&#39;ambiente drammaticamente alterato (temperatura, profusione, citochine, etc. ) risultante dalla rimozione dalla cavità toracica e sistema circolatorio 3. Studi recenti hanno dimostrato che il time-lapse imaging ottico intravitale del polmone intatto è possibile utilizzando un vuoto stabilizzato finestra di imaging 2,4,5 Tuttavia, i tempi tipici di imaging si sono limitati a circa 6 ore. Qui si descrive un protocollo per eseguire l&#39;imaging intravitale time-lapse a lungo termine del polmone utilizzando tale finestra su un periodo di 12 ore. Le sequenze di immagini time-lapse ottenuti con questo metodo consentono la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni cellula-cellula, la dinamica della membrana e perfusione vascolare nel polmone. Abbiamo inoltre dEscribe una tecnica di elaborazione di immagini che offre una visione senza precedenti chiara del microcircolo polmonare.

Per dimostrare il tipo di risultati che si possono ottenere con questo metodo, abbiamo iniettato cellule tumorali E0771-LG etichettati con il trifoglio proteina fluorescente nella vena della coda di topi MacBlue 44 a varie punti di tempo prima dell&#39;intervento chirurgico. Dopo l&#39;intervento chirurgico, 155 kD rodamina destrano marcato è stato iniettato IV per segnare è stata eseguita imaging vascolare e time-lapse. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

L'obiettivo generale di questo metodo è eseguire un'analisi a lungo termine, ad alta risoluzione e a livello di singola cellula del polmone intatto, utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro; ad esempio, quali interazioni si stabiliscono tra le cellule stromali e quelle tumorali durante le prime fasi della metastasi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il polmone vivo e intatto può essere teoricamente visualizzato a risoluzione di singola cellula per un periodo fino a 12 ore.Iniziare legando un tratto di 2-0 di sutura lungo tre pollici a un catetere tracheale, un quarto di pollice sopra il manicotto, con un nodo doppio. Applicare quindi un unguento oculare agli occhi di un topo anestetizzato e utilizzare una crema depilatoria per rimuovere il pelo dal lato sinistro dell'animale, dalla linea mediana del torace fino a un quarto della schiena e dall'ascella appena sotto la gabbia toracica. Rimuovere qualsiasi eccesso di crema e sterilizzare la cute esposta con etanolo al 70%.Successivamente, intubare l'animale. E legare il filo di sutura 2-0 attorno al muso, sotto i denti anteriori. Spostare l'animale nell'area chirurgica, avendo cura di non smuovere i cateteri, e accendere il ventilatore.Collegare il ventilatore al catetere tracheale. Quindi fissare il catetere con del nastro alla proboscide e alla zampa anteriore sinistra, assicurandola al catetere. Dopo aver verificato l'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi, utilizzare forbici affilate per rimuovere un centimetro quadrato di pelle sopra la parete toracica sinistra.Sollevare il cuscinetto adiposo mammario e cauterizzare eventuali vasi sanguigni esposti. Successivamente, resecare il cuscinetto adiposo e rimuovere lo strato muscolare fino alla gabbia toracica, avendo cura di non tagliare la vena ascellare alla base dell'arto anteriore. Utilizzare una pinza per sollevare la sesta costola.Quindi, tenendo le forbici affilate con un angolo leggermente inclinato di cinque gradi, tagliare la costola vicino al margine dell'apertura nella pelle. Rimuovere quattro costole consecutive per allargare l'apertura nella parete toracica, esponendo l'intero lobo polmonare. Successivamente, trasferire con attenzione il topo sul piano del microscopio per l'acquisizione delle immagini.Con il vuoto spento, riempire la camera interna della finestra a vuoto con PBS. Capovolgere il topo e posizionare il polmone esposto sopra la finestra del coprioggetto per imaging a vuoto. Accendere lentamente il vuoto.Posizionare un'imbragatura di contenimento, realizzata con carta da filtro piegata a metà due volte, sul torace del mouse e fissare l'imbragatura alla piastra dello stage con del nastro adesivo. Successivamente, applicare un pulsossimetro alla zampa dell'animale. Quindi, posizionare la camera ambientale sullo stage e accendere il riscaldamento per mantenere il mouse a una temperatura fisiologica.Quando l'animale è in posizione, avvicinare l'obiettivo numerico di apertura 25 per 95 al vetrino. In modalità epifluorescenza, osservare il canale fitzy e mettere a fuoco il tessuto polmonare. Successivamente, caricare una siringa sterile con 100 microlitri della sospensione di cellule tumorali, rimuovere la siringa di PBS dal catetere della vena della coda ed collegare la siringa contenente le cellule tumorali.Iniettare lentamente le cellule tumorali nella vena della coda. Quindi ricollegare la siringa contenente PBS al catetere della coda e localizzare le cellule tumorali attraverso il tessuto polmonare tramite l'oculare del microscopio. A questo punto sostituire la siringa con PBS con una siringa caricata con 100 microlitri di dextrano marcato con rodamina ed iniettare lentamente il dextrano nel topo attraverso il catetere della coda.Al termine dell'amministrazione della destrana, eseguire un'irrigazione con 50 microlitri di PBS sterile. Successivamente, acquisire immagini in ciascuna delle posizioni tumorali precedentemente identificate per visualizzare il flusso e l'integrità della vascolarizzazione. A 24 ore dall'iniezione, è possibile osservare singole cellule tumorali che interagiscono con macrofagi e monociti all'interno della vascolarizzazione.La stabilità dell'immagine è tale da permettere l'acquisizione di Z-stack sequenziali del campo e la generazione di una ricostruzione tridimensionale. Qui viene mostrato un mosaico di campi di imaging 5×5, che copre un campo visivo di 890 micron, ottenuto in 200 minuti e cinque minuti, a 15 micron sotto la superficie del polmone, in corrispondenza di una singola lesione metastatica, a 12 giorni dall'iniezione. Nonostante l'ampio campo visivo, l'elevata risoluzione dei fotogrammi sottostanti, che compongono il mosaico, consente di catturare eventi subcellulari, come la mitosi di una singola cellula, evidenziata dalla separazione dei cromosomi.L'iniezione intravascolare di una destrana fluorescente ad alto peso molecolare determina l'etichettatura della luce vascolare; tuttavia, gli eritrociti e i leucociti circolanti non etichettati possono ostruire la destrana. Nei piccoli capillari del polmone, tale ostruzione provoca un lampeggiamento del segnale della destrana e una perdita di definizione dei margini vascolari. L'elevata stabilità spaziale fornita da questo protocollo consente la media temporale del canale ematico senza sfocatura, ripristinando così le ostruzioni temporanee.I segnali provenienti dagli altri canali possono quindi essere sovrapposti alla vascolarizzazione per ottenere una visione chiara dei margini dei vasi. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in circa un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione a non recidere vasi sanguigni di grandi dimensioni senza prima cauterizzarli e di evitare qualsiasi contatto con il tessuto polmonare.Seguendo questa procedura, è possibile visualizzare le prime fasi della disseminazione e proliferazione delle cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging intravitale nel polmone integro mediante una finestra di imaging stabilizzata a vuoto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

In questo video, descriviamo l'imaging intravitale di un pancreas di topo attraverso una finestra stabilizzata per la visualizzazione a lungo termine delle dinamiche cellulari.

Imaging intravitale: un metodo per l'osservazione a livello cellulare del pancreas di topo attraverso una finestra di imaging stabilizzata

Questo protocollo descrive l'imaging videomicroscopia di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti cellula-specifico. Videomicroscopia imaging fornisce un metodo non invasivo per osservazioni ad alta risoluzione in animali vivi utilizzando windows impiantabili attraverso il quale è possibile la visualizzazione microscopica dei processi. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i processi longitudinali.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Qui presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica permanentemente a dimora per il torace murino, che consente l'imaging intravitale ad alta risoluzione del polmone. La permanenza della finestra la rende adatta allo studio dei processi cellulari dinamici nel polmone, in particolare quelli che si stanno lentamente evolvendo, come la progressione metastatica delle cellule tumorali disseminate.

Una finestra permanente per indagare sulle metastasi del cancro al polmone

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Questo protocollo descrive una nuova finestra di imaging mammario con un coperchio sostituibile (R.MIW). La microscopia intravitale dopo l'impianto del R.MIW consente l'imaging longitudinale e di più giorni della ghiandola mammaria sana e malata con una risoluzione cellulare durante le diverse fasi dello sviluppo.

Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile

La microscopia a fluorescenza intravitale può essere utilizzata per studiare le interazioni leucocita-endoteliali e la perfusione capillare in tempo reale. Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare e quantificare questi parametri nel microcircolo polmonare utilizzando un sistema di imaging polmonare stabilizzato nel vuoto.

Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale di Mycobacterium tuberculosis approvato BSL-2 attenuato. Ceppo nel polmone murino utilizzando una finestra polmonare permanente. Questo approccio consente un'analisi longitudinale a risoluzione monocellulare delle prime interazioni ospite-patogeno, inclusa localizzazione bacillare, dinamica vascolare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare.

Imaging intravitale dell'attenuazione dell'Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis nel polmone murino durante l'infezione intravascolare precoce

Impara la microscopia intravitale a lungo termine nel polmone intatto utilizzando una finestra di imaging stabilizzata a vuoto. Questo metodo consente l'imaging a risoluzione cellulare per studiare le interazioni stroma-tumore nella metastasi.

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

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