Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la registrazione del patch clamp a cellula intera dai neuroni retinici interni nella preparazione della retina del topo a montaggio piatto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia retinica come la diversità dei neuroni, le loro connessioni sinaptiche in condizioni normali e patologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che vengono preservate sia le connessioni verticali che quelle laterali, consentendo di studiare i circuiti della retina con componenti laterali di grandi dimensioni.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la retina è un tessuto sottile e delicato che deve essere maneggiato con grande cura e pazienza. La pratica, tuttavia, è il modo migliore per padroneggiarla. Per iniziare questa procedura, arrotolare i bulbi oculari del mouse in un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il sangue.

Quindi, immergili nella soluzione Ringer di mammifero carbogenato. Quindi, fai un buco sul limbus con un ago calibro 23 e taglia in due i bulbi oculari tagliando lungo il limbus con micro forbici. Quindi, rimuovere la cornea e il cristallino utilizzando una pinza fine.

Per la retina a montaggio intero, staccare delicatamente l'intera retina dall'epitelio pigmentato con una pinza fine ed eseguire quattro tagli ortogonali da 1,5 a due millimetri dal bordo verso la testa del nervo ottico. Successivamente, immergere una membrana di nitrocellulosa perforata nel piatto e trascinare delicatamente la retina su di essa con il lato GCL rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare la testa del nervo ottico nel foro centrale quando si prepara una retina a montaggio intero.

Successivamente, trasferire la membrana con la retina in un altro piatto pulito. Appiattire delicatamente la retina a croce di Malta con un pennello fine e stendere tutti e quattro i bordi sui fori. Tamponare la membrana di nitrocellulosa con un pezzo di carta da filtro asciutta e rimuovere il vetroso e la membrana limitante interna con una pinza e un pennello.

Assicurarsi che tutti i bordi retinici siano completamente attaccati alla membrana prima di trasferire il gruppo nella camera di registrazione con un vetrino di copertura sigillato nella parte inferiore. Fissare la membrana al vetrino coprioggetti con grasso sottovuoto e reidratare la retina con la soluzione esterna. Fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto il gruppo.

Quindi, posizionare la camera sul tavolino di un microscopio verticale. Immergere la camera con una soluzione esterna carbogenata a 34 gradi Celsius a una velocità di circa tre millilitri al minuto. Esamina prima la retina con una lente soggettiva 10x.

Quindi, utilizzare una lente a immersione in acqua 60x per vedere i neuroni GCL e INL in DIC e l'impostazione epifluorescente. Per visualizzare tdTomato che esprime SAC, utilizzare una sorgente luminosa a LED bianca in combinazione con un filtro di eccitazione di 554 nanometri e un filtro di emissione di 581 nanometri. In questa procedura, filtrare la soluzione interna attraverso un filtro a siringa nel filamento di riempimento personalizzato.

Quindi, inserire il filamento in una micropipetta appena tirata ed erogare la soluzione interna vicino alla punta fino a quando la soluzione copre il filo dell'elettrodo d'argento per più di cinque millimetri. Successivamente, fissare la micropipetta su un portaelettrodo con una trazione di aspirazione attraverso la quale è possibile regolare la pressione all'interno dell'elettrodo spingendo o tirando lo stantuffo di una siringa di plastica da 10 millilitri collegata a un tubo. Quindi, individuare la pipetta sotto l'obiettivo e portarla a circa 100 micrometri sopra la retina.

In modalità inseguitore di corrente, utilizzare l'offset CC per azzerare il segnale di tensione CC permanente. Misurare la resistenza della pipetta in modalità pinza amperometrica iniettando correnti a onda quadra di ampiezza fissa attraverso la pipetta mentre si trova nella vasca da bagno. Neutralizzare la differenza ruotando la manopola Raccess e utilizzare la lettura su di essa per calcolare la resistenza della pipetta.

Dopodiché, portare lentamente l'elettrodo a circa 10 micrometri sopra la retina. Applicare una pressione positiva all'elettrodo. Quindi, osservare il cambiamento del riflesso vicino alla punta della pipetta mentre si avvicina alla retina.

Rapidamente ma delicatamente, forzare la pipetta nel GCL e ridurre immediatamente la pressione positiva. Spostare la pipetta verso un neurone marcato ed evitare il contatto con altri neuroni, vasi sanguigni e piedi terminali delle cellule di Muller. Applicare una maggiore pressione positiva, se necessario, per evitare l'intasamento degli elettrodi.

Quindi, posizionare la punta della pipetta vicino al neurone marcato fino a quando non è visibile una fossetta. Quindi, rilasciare la pressione positiva e lasciare che la membrana plasmatica rimbalzi sul puntale della pipetta. Applicare correnti negative da 20 a 120 picoamps alla pipetta per favorire la formazione di una tenuta gigaohm.

Consentire alla membrana cellulare di rimbalzare dopo aver rilasciato la pressione positiva è importante perché un'eccellente tenuta formata naturalmente tra la membrana e l'apertura della pipetta è importante per preservare la morfologia cellulare dopo la registrazione. Se necessario, aspirare delicatamente per tirare la membrana plasmatica nella pipetta. Attendere cinque minuti dopo la formazione del sigillo per rompere la membrana cellulare in modo da consentire la fuoriuscita della soluzione interna versata per superfusione.

Dopo che la membrana è stata rotta e mentre si è in modalità pinza amperometrica, accendere il bilanciamento del ponte e regolarlo utilizzando la manopola Raccess. Registrare le correnti postsinaptiche eccitatorie e inibitorie in modalità voltage clamp mantenendo la cella ai potenziali di inversione. Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dal soma.

Trasferire il gruppo dalla camera a un piatto pulito. Quindi, staccare e riattaccare la retina su un'altra membrana di nitrocellulosa appiattita senza praticare fori per garantire la piattezza della retina durante la fissazione. Il tessuto è ora pronto per la colorazione.

Queste immagini mostrano che le cellule colinergiche sia in GCL che in INL possono essere identificate in modo affidabile mediante fluorescenza tdTomato e mirate per la registrazione di patch clamp su cellule intere sotto DIC. L'oscillazione dei loro potenziali di membrana può essere rivelata dalla registrazione del morsetto di corrente e l'oscillazione guidata dalle correnti sinaptiche inibitorie ed eccitatorie viene rivelata mantenendo le celle rispettivamente a zero millivolt e a 75 millivolt negativi nelle condizioni di clamp di tensione. Qui, la caratterizzazione istologica post hoke delle cellule registrate indica la tipica morfologia dendritica SAC e i livelli di stratificazione nell'IPL.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di fissare il gruppo della membrana retinica nella camera di registrazione e reidratarlo senza intrappolare bolle d'aria sottostanti in modo stretto e delicato per fornire un campione registrabile. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come le registrazioni con morsetto a doppia patch, al fine di rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se le oscillazioni delle cellule multiple bersaglio sono guidate dagli stessi meccanismi sinaptici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia retinica per esplorare la sincronicità dell'oscillazione tra i neuroni retinici vicini nelle retine degenerate dei fotorecettori.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rimuovere l'umor vitreo e preparare un montaggio piatto retinico per la registrazione mirata di patch clamp su scala intera dai neuroni retinici interni.