Name: Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Impara la registrazione patch clamp su neuroni retinici in preparazione flat-mount di retina di topo. Questo metodo preserva le connessioni sinaptiche verticali e laterali per studiare la diversità neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Joung Jang e Xin Guan per l'assistenza tecnica. Ringraziamo il Dr. Rory McQuiston della Virginia Commonwealth University per aver installato il nostro primo patch clamp rig e per i consigli sulle procedure sperimentali. Ringraziamo il Dr. Samuel Wu per i suggerimenti sulla registrazione del morsetto di tensione. Il lavoro è supportato da sovvenzioni NIH EY013811, EY022228 e da una sovvenzione Vision Core EY002520. C-KC è la cattedra Alice R. McPherson Retina Research Foundation presso il Baylor College of Medicine.

l&#39;approvazione etica - procedure che coinvolgono soggetti animali sono state condotte in conformità con le norme ei regolamenti del National Institutes of linee guida sanitarie per gli animali di ricerca, come approvato dalla cura degli animali istituzionale e usare comitato di Baylor College of Medicine. 1. esterno e delle soluzioni interne <ol><li> Utilizzare la soluzione di Ringer mammiferi durante la dissezione retina e la soluzione esterna nella successiva registrazione elettrofisiologica. Preparare la soluzione di Ringer mammiferi da 10x soluzione madre (senza calcio) il giorno della registrazione, e aggiungere CaCl 2 goccia a goccia dopo 15 min di carbogenation (95% O 2 e il 5% di CO 2). La soluzione finale 1x contiene (in mM): 120 NaCl, KCl 5, 25 NaHCO 3, 0.8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 e 10 D-glucosio. </li><li> Utilizzare due soluzioni interne per caratterizzare oscillazioni SAC. Testl&#39;utilità di soluzioni preparate in cellule intere registrazioni di patch clamp prolungati sulla RGCs topo adulto e memorizzare i lotti verificati in 500 microlitri aliquote a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. <ol><li> Per la registrazione potenziale di membrana di oscillazione, utilizzare una soluzione interna a base di potassio contenente (in mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina (w / v). Regolare il pH a 7,3 con KOH. </li><li> Per la registrazione eccitatori e correnti postsinaptiche inibitorie, utilizzare una soluzione interna cesio base contenente (in mM): 100 Cs-metansolfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina ( w / v). Regolare il pH a 7,3 con CsOH. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione per il giorno di registrazione <ol><li> Per preparare una membrana di nitrocellulosa con fori aperti, punch manualmente la membrana con un perforatore personalizzato fatto da un smussata 16 G ago della siringa e appiattire la membrana tra due lastre di vetro pulite. Per un all&#39;in- grossomontare retina, fare un foro centrale di 0,2 mm di diametro e circondarla da 4 fori più grandi che sono 1-1,2 mm di diametro. </li><li> Per fare un filamento di riempimento personalizzato per caricare soluzione interna in elettrodi, sciogliere un puntale 10 microlitri nel mezzo e allungare delicatamente la parte fusa fino a quando si raffredda e si indurisce. Appena prima dell&#39;uso, utilizzare una lama di rasoio pulito per tagliare il filamento finché è leggermente più lungo le pipette di patch. </li><li> Tirare le pipette di patch in un estrattore programmabile da tubo di vetro borosilicato con un filamento interno. Fabbricazione le micropipette il giorno dell&#39;esperimento e utilizzarli immediatamente. NOTA: per ZSC registrazione, usiamo la seguente impostazione puller: calore: 484; tirare: 0; Velocità: 25; tempo di ritardo: 1; pressione: 400 e un valore di rampa 462. L&#39;OD e ID dei tubi borosilicato sono rispettivamente di 1,65 millimetri e 1,0 mm. La resistenza delle pipette è 10-14 MW. </li><li> Una h prima della raccolta dei tessuti, scongelare un tubo di soluzione interna per shaking su un vortex per&gt; 30 min. </li></ol> 3. Retina Dissection <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale del 4% isoflurano in ossigeno fino a quando l&#39;animale perde la reattività di un pizzico dito del piede. Sacrificare l&#39;animale da dislocazione cervicale. </li><li> Tagliare due bulbi oculari fuori i nervi ottici a distanza dalle teste del nervo ottico con Iris rette punte forbici 1-2 mm. </li><li> Lancia i bulbi oculari su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il sangue e poi immergerli in una soluzione carbogenated mammiferi di Ringer. Effettuare un foro sul limbus con un ago G 23 e bisect bulbi oculari tagliando lungo il limbus con micro-forbici. Rimuovere la cornea e la lente utilizzando una pinza sottile. <ol><li> Per retina tutto il montaggio, rimuovere delicatamente tutta la retina fuori dell&#39;epitelio pigmentato con una pinza sottile e fare tagli quattro 1,5-2 mm ortogonali dal bordo verso la testa del nervo ottico. </li></ol></li><li> Immergere una membrana di nitrocellulosa perforato nel piatto e trascinare delicatamente la retina su di esso conil GCL verso l&#39;alto. Mettere la testa del nervo ottico nel foro centrale quando si prepara un tutto il montaggio della retina. Trasferire la membrana della retina in un altro piatto pulito. appiattire delicatamente la retina con un pennello fine per assomigliare ad una croce di Malta e porre i quattro bordi sui fori. <ol><li> Se una frazione della retina è da esaminare alla volta, tagliare ogni eyecup preparati dal punto 3.3 in 3-4 pezzi con una lama di rasoio con l&#39;epitelio pigmentato rimane attaccato. Proteggere i pezzi inutilizzati dalla luce in soluzione esterna carbogenated e utilizzarli entro 12 ore. </li></ol></li><li> Tamponare la membrana di nitrocellulosa con un pezzo di carta da filtro asciutta e rimuovere la membrana vitreo e interna limitativo con una pinza e un pennello. </li><li> Assicurarsi che tutti i bordi retiniche sono completamente attaccati alla membrana prima di trasferire il gruppo nella camera di registrazione con una copertura in vetro sigillato antiscivolo sul fondo. Fissare la membrana con grasso vuoto per la polizza di copertura e rehydratvia e la retina con la soluzione esterna. Non essere attenti a intrappolare eventuali bolle d&#39;aria sotto l&#39;assemblaggio. </li><li> Impostare la camera sulla scena di un microscopio verticale. Profumato la camera con acqua calda (34-35 ° C) soluzione esterna carbogenated ad una velocità di ~ 3 ml al minuto. </li><li> Esaminare la retina sotto una lente obiettivo 10X prima, e poi utilizzare un obiettivo 60x acqua-immersion per vedere i neuroni GCL e INL sotto contrasto interferenziale differenziale (DIC) e / o epifluorescenza. Per visualizzare ZSC tdTomato esprimenti, utilizzare una sorgente di luce bianca in combinazione LED con un filtro di eccitazione di 554 nm e un filtro di emissione di 581 nm. </li></ol> 4. patch clamp whole-cell da Flat-mount Retina <ol><li> Filtrare la soluzione attraverso un filtro interno siringa nel filamento riempimento personalizzato. </li><li> Inserire il filamento in una micropipetta appena spillata e dispensare la soluzione interna vicino alla punta fino a che la soluzione copre il filo elettrodo d&#39;argento per&gt;5 mm. Fissare la micropipetta su un portaelettrodo con un palo di aspirazione, attraverso il quale la pressione all&#39;interno dell&#39;elettrodo può essere regolata premendo o tirando lo stantuffo di una siringa di plastica da 10 ml tubo collegato. </li><li> Trova la pipetta sotto l&#39;obiettivo e portarlo fino a ~ 100 micron sopra la retina. Sotto la modalità corrente-seguace (I = 0), utilizzare offset DC a zero il segnale di tensione continua in piedi. Misurare la resistenza pipetta sotto il morsetto modalità corrente (I morsetto) iniettando corrente ad onda quadra di ampiezza fissa tramite la pipetta mentre è nel bagno e neutralizzare la differenza ruotando la manopola raccess. Utilizzare la lettura sulla manopola raccess per calcolare la resistenza pipetta dalla legge di Ohm. </li><li> Portare lentamente l&#39;elettrodo a ~ 10 micron sopra la retina. Applicare pressione positiva all&#39;elettrodo. Guarda il cambiamento riflessione vicino alla punta della pipetta mentre si avvicina la retina. Rapidamente, ma delicatamente forzare la pipetta nel GCL e ridurre il PRESSU positivori immediatamente. </li><li> Spostare la pipetta verso un neurone etichettati. Evitare il contatto con altri neuroni, vasi sanguigni e delle cellule endfeet Muller. Applicare una pressione più positivo, se necessario, per evitare l&#39;intasamento degli elettrodi. </li><li> Posizionare la punta della pipetta vicino alla linea mediana di un neurone marcato fino a quando una fossetta è visibile. Rilasciare la pressione positiva e lasciare la membrana plasmatica di riprendersi sulla punta della pipetta. </li><li> Applicare 20 a 120 pA correnti negative alla pipetta per aiutare la formazione di una tenuta giga ohm. Applicare una delicata aspirazione se necessario tirare la membrana plasmatica nella pipetta. Attendere 5 min dopo la formazione della guarnizione di rottura della membrana cellulare. In questo modo la soluzione interna versato viene controllata da superfusione. Rompere la membrana da una delicata aspirazione. </li><li> Dopo la rottura della membrana e in modalità morsetto corrente, accendere l&#39;equilibrio ponte e regolarlo con la manopola raccess. NOTA: Per una piccola cella come il SAC, è necessaria solo leggero aggiustamento, se presente. Alterntivamente, registrare eccitatorio e le correnti post-sinaptiche inibitorie in modalità morsetto tensione (V morsetto) tenendo il cellulare a potenziali inversione di cloruro (circa -75 mV) e il glutammato (circa 0 mV), rispettivamente. Controllare e regolare la posizione della pipetta, se necessario, per ospitare retina occasionale e / o micromanipolatore deriva. </li><li> Per registrare potenziale di membrana o variazione di corrente prima, durante e dopo il trattamento farmacologico, preparare bloccanti sinaptiche (ad esempio, CNQX, AP5, picrotoxin, tubocurarina, etc.) e modulatori dei canali (ad esempio, flupirtina, dopamina, acido meclofenamico, ecc) fresco su il giorno dell&#39;esperimento dalle scorte congelati. Diluire i farmaci con la soluzione carbogenated di Ringer. applicarle in maniera lotto attraverso la perfusione. </li><li> Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dal soma. Trasferire il gruppo dalla camera di un piatto pulito. Staccare e ricollegare la retina su un altro membrana di nitrocellulosa appiattita senza Hol perforatoES per garantire la planarità della retina durante la fissazione. </li><li> Fissare la retina immergendolo in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a RT. Rimuovere la retina dalla membrana di nitrocellulosa e risciacquare a lungo con PBS 1x. Rivela la morfologia delle cellule registrate da O / N colorazione con streptavidina colorante coniugato diluito in PBS 1x con 0,4% Triton X-100 a 4 ° C 14. Montare la retina in media antifade e osservare le cellule registrati utilizzando un microscopio confocale a scansione. NOTA: Le procedure che coinvolgono paraformaldeide, che è volatile e tossica, dovrebbero essere condotte in un progetto da camera per la sicurezza. </li></ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
<li>Gregg, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nyctalopin+expression+in+retinal+bipolar+cells+restores+visual+function+in+a+mouse+model+of+complete+X-linked+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness.</a> J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).</li>
<li>Hellmer, C. B., Ichinose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+light-evoked+postsynaptic+responses+in+neurons+in+dark-adapted%2C+mouse+retinal+slice+preparations+using+patch+clamp+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dendritic+branching+in+direction+selective+retinal+ganglion+cells+in+nob1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+membrane+potential+fluctuations+of+cholinergic+amacrine+cells+in+mice+lacking+ERG+b-waves%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+maintain+eye-specific+segregation+in+nob%2C+a+mutant+with+abnormally+patterned+retinal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity.</a> Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Retinal+Oscillation+Mechanism+in+an+Autosomal+Dominant+Photoreceptor+Degeneration+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model.</a> Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).</li>
<li>Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neural+oscillator+in+the+degenerating+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina.</a> J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+spontaneous+ganglion+cell+spike+activity+in+animal+models+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa.</a> J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Stasheff, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+sustained+spontaneous+hyperactivity+and+temporary+preservation+of+OFF+responses+in+ganglion+cells+of+the+retinal+degeneration+%28rd1%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).</li>
<li>Trenholm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillatory+activity+arising+within+the+electrically+coupled+AII+amacrine-ON+cone+bipolar+cell+network+is+driven+by+voltage-gated+Na%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels.</a> J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).</li>
<li>Chen, C. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+changes+in+displaced+cholinergic+amacrine+cells+lacking+Gbeta5%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+physiological+properties+of+cat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells.</a> J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unconventional+Glutamatergic+Circuit+in+the+Retina+Formed+by+vGluT3+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells.</a> Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).</li>
<li>Hoggarth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+wiring+of+distinct+amacrine+cells+in+the+directionally+selective+retinal+circuit+permits+independent+coding+of+direction+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size.</a> Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).</li>
<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti laboratori hanno registrato dai neuroni GCL nella preparazione 15-18 TV a monte, ma le nostre procedure consentono la registrazione da neuroni INL. Con la presente sottolineare diversi passaggi che sono fondamentali per le registrazioni di routine di successo. La freschezza e planarità della retina sono importanti per penetrare con una pipetta di registrazione. A questo proposito, il fermo attaccamento della retina alla membrana di nitrocellulosa perforato è fondamentale e s...

Come parte facilmente accessibile del sistema nervoso centrale, la retina è stata per decenni un modello utile negli studi di neuroscienze. La marcatura genetica dei neuroni ha permesso una caratterizzazione dettagliata delle connessioni sinaptiche nella retina. Con molte metodologie disponibili per esaminare la funzione e la morfologia dei neuroni retinici, la tecnica di registrazione patch clamp è stata determinante per la nostra attuale comprensione dei segnali trasmessi verticalmente nella retina. Questi segnali sono originati dall'assorbimento di fotoni nei fotorecettori e inviati ai centri visivi del cervello attraverso lo spiking delle cellule gangliari retiniche (RGC). Nonostante l'ampio corpus di conoscenze accumulate finora, la diversità neurale nella retina vascolarizzata dei mammiferi rimane irrisolta e ostacola il pieno apprezzamento dei circuiti retinici che servono la visione normale. Ciò è in parte dovuto al fatto che la maggior parte delle registrazioni sono state eseguite su fette di retina per scambiare l'integrità del circuito laterale con l'accesso a più neuroni retinici prossimali1-3. Per ottenere un quadro completo di come la retina calcola i segnali visivi, è quindi auspicabile registrare i neuroni in montature piatte in cui le connessioni laterali, grandi e piccole, possono essere meglio conservate.
Quando la trasmissione sinaptica dai fotorecettori alle cellule bipolari viene interrotta a causa di una via di segnalazione metabotropica difettosa del recettore del glutammato 6 (mGluR6) nelle cellule bipolari depolarizzanti4-6 o semplicemente come risultato della perdita di fotorecettori nelle retine degenerate7-10, molte RGC mostrano attività oscillatorie. Queste oscillazioni hanno origine da molteplici fonti, tuttavia quella che coinvolge l'accoppiamento della giunzione gap tra le cellule amacrine AII (AII-AC) e le celle bipolari a cono depolarizzante (DCBC) ha ricevuto la massima attenzione e quindi è meglio compresa1,7,11. Abbiamo trovato un'altra fonte, che persiste sotto il blocco farmacologico della suddetta rete AII-AC/DCBC e guida l'oscillazione delle SAC di tipo OFF nei topi RhoΔCTA e Nob con retine deafferenziate7,8,12. Qui descriviamo in dettaglio il nostro protocollo di preparazione dei flat-mount retinici per la registrazione dei neuroni INL. Questo approccio utilizza linee di topi commerciali (codice Jax 006410 e 007905) per marcare i neuroni retinici colinergici mediante l'espressione di una proteina fluorescente (tdTomato) identificabile al microscopio fluorescente dotato di ottiche che migliorano il contrasto. Alcuni risultati sperimentali acquisiti attraverso questo approccio sono stati precedentemente riportati4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>Microscopio fluorescente a stadio fisso con</td> micromanipolatori DIC <td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr> Amplificatore patch clamp <tr><td></td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td></td><td>A-M System</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>AD convertitore</td><td>National Instrument</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>Controller riscaldatore</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Inline riscaldatore</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Estrattore</td> per pipette <td>Rainin Dynamax</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di vetro con filamento</td><td>King Precision Glass</td><td>Stimolatore personalizzato</td><td></td></tr><tr><td></td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocitina</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-metansolfonato</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Filtro siringa</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>1 ml siringa</td><td>Rainin</td><td></td><td></td>17013002</tr><tr><td>10 &mu; l puntale per pipetta</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp di celle starburst amacrine in un appartamento di montaggio preparazione di deafferentated mouse retina

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

La retina dei mammiferi è un tessuto stratificato composto da più tipi di neuroni. Per capire come i segnali visivi vengono elaborati all&#39;interno della propria rete sinaptica intricata, registrazioni elettrofisiologiche sono spesso utilizzati per studiare le connessioni tra i singoli neuroni. Abbiamo ottimizzato una preparazione TV a monte per la registrazione patch clamp di neuroni geneticamente marcate sia in GCL (strato di cellule gangliari) e INL (strato nucleare interno) di retine di topo. Registrazione neuroni INL a Flat-monti è favorita rispetto fette perché le connessioni sia verticali e laterali sono conservati nella ex di configurazione, consentendo circuiti della retina con componenti di grandi dimensioni laterali da studiare. Abbiamo usato questa procedura per confrontare le risposte dei neuroni specchio-partnered in retine come i colinergici cellule amacrine starburst (ZSC).

Registrazioni rappresentativi di on e off-tipo ZSC da una retina deafferentated del mouse sono mostrati in figura 1. Le cellule colinergici sia in GCL e INL può essere attendibilmente identificate da tdTomato fluorescenza e mirati per la cellula intera registrazione patch clamp sotto DIC (Figura 1A) a rivelare l&#39;oscillazione dei loro potenziali di membrana (in alto tracce) e le correnti sinaptiche che la determinano (tracce di fondo, figura 1...

Questo protocollo dimostra come eseguire cellula intera registrazione patch clamp su neuroni della retina da una preparazione TV a montare.

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la registrazione in patch clamp su cellule intere di neuroni retinici interni nel preparato di retina di topo in montaggio piatto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia retinica, come la diversità dei neuroni e le loro connessioni sinaptiche in condizioni normali e patologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che vengono preservate sia le connessioni verticali che quelle laterali, consentendo lo studio di circuiti retinici con ampie componenti laterali.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la retina è un tessuto sottile e delicato che deve essere maneggiato con grande attenzione e pazienza. Tuttavia, la pratica è il modo migliore per padroneggiare la tecnica. Per iniziare questa procedura, rotolare i bulbi oculari del topo in un tovagliolo di carta pulito per rimuovere ogni traccia di sangue.Successivamente, immergerli nella soluzione di Ringer per mammiferi carbogenata. Poi, praticare un foro nel limbo con un ago da 23 gauge e dividere a metà i bulbi oculari tagliando lungo il limbo con forbici microchirurgiche. Quindi, rimuovere la cornea e il cristallino utilizzando pinzette fini.Per il preparato intero della retina, staccare delicatamente l'intera retina dall'epitelio pigmentato utilizzando pinzette fini ed effettuare quattro tagli ortogonali lunghi da 1,5 a 2 millimetri dal margine verso la testa del nervo ottico. Successivamente, immergere una membrana di nitrocellulosa forata nella piastra e trascinare delicatamente la retina sopra di essa con il lato GCL rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare la testa del nervo ottico al centro del foro durante la preparazione del preparato intero della retina.Successivamente, trasferire la membrana con la retina in un altro piatto pulito. Appiattire delicatamente la retina a forma di croce di Malta utilizzando un pennello fine e disporre tutti e quattro i bordi sopra i fori. Asciugare la membrana di nitrocellulosa con un pezzo di carta filtrante asciutta ed eliminare il vitreo e la membrana limitante interna con pinzette e un pennello.Assicurarsi che tutti i margini della retina siano completamente aderenti alla membrana prima di trasferire l'insieme nella camera di registrazione con un vetrino di vetro sigillato sul fondo. Fissare la membrana al vetrino con grasso da vuoto e reidratare la retina con la soluzione esterna. Prestare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto l'insieme. Successivamente, posizionare la camera sul palchetto di un microscopio eretto. Perfundere la camera con soluzione esterna carbogenata a 34 gradi Celsius a un flusso di circa tre millilitri al minuto. Esaminare la retina inizialmente con un obiettivo soggettivo da 10x.Quindi, utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua 60x per osservare i neuroni dello strato delle cellule gangliari (GCL) e dello strato nucleare interno (INL) in condizioni DIC e in fluorescenza epipiana. Per visualizzare le cellule amacrine starburst (SAC) che esprimono tdTomato, utilizzare una sorgente luminosa a LED bianco in combinazione con un filtro di eccitazione a 554 nanometri e un filtro di emissione a 581 nanometri. In questo procedimento, filtrare la soluzione interna attraverso un filtro da siringa nel filamento apposito per il riempimento posteriore.Quindi, inserire il filamento in una micropipetta appena preparata ed erogare la soluzione interna in prossimità della punta finché la soluzione non ricopre il filo dell'elettrodo d'argento per più di cinque millimetri. Successivamente, fissare la micropipetta a un porta-elettrodi mediante un'aspirazione esercitata attraverso un tubo, grazie al quale la pressione all'interno dell'elettrodo può essere regolata spingendo o tirando lo stantuffo di una siringa di plastica da 10 millilitri collegata. Poi, posizionare la pipetta sotto l'obiettivo e abbassarla fino a circa 100 micrometri sopra la retina.In modalità follower attuale, utilizzare l'offset in corrente continua per azzerare il segnale di tensione continua presente. Misurare la resistenza della pipetta in modalità clamp di corrente iniettando correnti a onda quadra di ampiezza fissa attraverso la pipetta mentre si trova nel bagno. Neutralizzare la differenza ruotando la manopola Raccess e utilizzare la lettura indicata per calcolare la resistenza della pipetta.Successivamente, avvicinare lentamente l'elettrodo a circa 10 micrometri sopra la retina. Applicare una pressione positiva sull'elettrodo. Quindi, osservare il cambiamento del riflesso vicino alla punta della pipetta mentre si avvicina alla retina.Velocemente ma delicatamente, spingere la pipetta nel GCL e ridurre immediatamente la pressione positiva. Muovere la pipetta verso un neurone marcato evitando di toccare altri neuroni, vasi sanguigni e i pedicelli delle cellule di Muller. Applicare ulteriore pressione positiva, se necessario, per prevenire l'occlusione dell'elettrodo.Successivamente, posizionare la punta della pipetta vicino al neurone marcato fino a quando non è visibile una piccola depressione. Quindi, rilasciare la pressione positiva e permettere alla membrana plasmatica di ripristinarsi a contatto con la punta della pipetta. Applicare correnti negative comprese tra 20 e 120 picoampere alla pipetta per favorire la formazione di un sigillo gigaohm.È importante permettere alla membrana cellulare di ripristinarsi dopo aver rilasciato la pressione positiva, poiché un'ottima sigillatura che si forma naturalmente tra la membrana e l'apertura della pipetta è fondamentale per preservare la morfologia cellulare dopo la registrazione. Se necessario, applicare un'aspirazione delicata per tirare la membrana plasmatica all'interno della pipetta. Attendere cinque minuti dopo la formazione del sigillo per rompere la membrana cellulare, in modo da permettere la rimozione della soluzione interna fuoriuscita mediante superfusione.Dopo che la membrana è stata rotta e mentre si è in modalità di blocco della corrente, attivare il bilanciamento del ponte e regolarlo utilizzando la manopola Raccess. Registrare le correnti postsinaptiche eccitatorie e inibitorie in modalità di blocco del voltaggio mantenendo la cellula a potenziali di inversione. Al termine della registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dal soma.Trasferire l'assemblaggio dalla camera a una piastra pulita. Successivamente, staccare e riattaccare la retina su un'altra membrana di nitrocellulosa appiattita, senza praticare fori, per garantire l'appiattimento della retina durante la fissazione. Il tessuto è ora pronto per la colorazione.Queste immagini mostrano che le cellule colinergiche sia nello strato delle cellule gangliari (GCL) che nello strato nucleare interno (INL) possono essere identificate in modo affidabile mediante la fluorescenza di tdTomato e bersagliate per la registrazione in modalità whole-cell con patch clamp in condizioni DIC. L'oscillazione dei loro potenziali di membrana può essere rivelata mediante registrazione in modalità clamp di corrente, mentre le oscillazioni generate dalle correnti sinaptiche inibitorie ed eccitatorie vengono evidenziate mantenendo le cellule rispettivamente a zero millivolt e a meno 75 millivolt in condizioni di clamp di tensione. In questo caso, l'analisi istologica post-registrazione delle cellule registrate indica la tipica morfologia dendritica e i livelli di stratificazione delle cellule amacrine a diffusione (SAC) nello strato plessiforme interno (IPL).Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di fissare con cura l'assemblaggio della membrana retinica nella camera di registrazione e di reidratarlo senza intrappolare bolle d'aria al di sotto, in modo accurato e delicato, al fine di ottenere un campione registrabile. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come le registrazioni con doppio patch-clamp, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se le oscillazioni di più cellule bersaglio siano guidate dagli stessi meccanismi sinaptici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia retinica per esplorare la sincronicità delle oscillazioni tra neuroni retinici adiacenti in retine con degenerazione dei fotoricettori.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come rimuovere l'umor vitreo e preparare una montatura piatta della retina per la registrazione su larga scala con tecnica patch clamp mirata ai neuroni retinici interni.

patch-clamp-recording-starburst-amacrine-cells-flat-mount-preparation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Qui si descrive una procedura per la generazione di dark-adattato fette della retina del mouse per le registrazioni elettrofisiologiche.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Questo articolo fornisce una descrizione del modo di sezionare e registrare dalla preparazione della retina isolata nel topo. In particolare, viene descritto come registrare le risposte luce da una popolazione di cellule gangliari fluorescente e successivamente identificare e analizzare la sua morfologia.

Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l'ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

Questo articolo descrive la registrazione delle singole cellule da fluorescente tag popolazioni neuronali della retina topo intatto. Con l'eccitazione a due fotoni infrarossi cellule transgenetically etichettati sono stati mirati per patch-clamp per lo studio di registrazione le loro risposte luce, proprietà del campo recettivo, e la morfologia.

Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

Questo video mostra una tecnica di patch-clamp su cellule intere per la registrazione elettrofisiologica da una retina di topo a montaggio piatto. Una sottile pipetta di vetro con un elettrodo viene utilizzata per avvicinare le cellule amacrine starburst (SAC) all'interno della retina. Dopo aver formato una guarnizione, viene applicata l'aspirazione per rompere la membrana e formare la configurazione patch-clamp a cella intera. Infine, il flusso di ioni attraverso i recettori sinaptici SAC...

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica da una retina di topo a montaggio piatto

Questo video dimostra la registrazione delle risposte post-sinaptiche evocate dalla luce in una preparazione di fetta di tessuto retinico di topo adattato al buio. La fetta di retina viene posta in una camera di registrazione e viene utilizzata una pipetta di registrazione per stabilire la continuità elettrica con una cellula gangliare retinica. Gli impulsi luminosi vengono applicati per generare potenziali post-sinaptici eccitatori nelle cellule ganglionari, che vengono registrati dalla...

Risposte postsinaptiche evocate dalla luce nei neuroni di fette di retina di topo

In questo articolo il video illustra il set-up, le procedure per applicare le patch corpi cellulari e come implementare le registrazioni dinamiche clamp da cellule gangliari in tutto il montaggio del mouse retine. Questa tecnica permette l'indagine del contributo preciso di input sinaptici eccitatori e inibitori, e la loro portata, il tempo di spiking neuronale.

Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

Dimostreremo come preparare fette di retina dall'occhio del topo e registrare le risposte alla luce nei neuroni retinici. L'intera procedura viene eseguita in condizioni adattate al buio.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca 2+ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca 2 + Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

Questo lavoro presenta una preparazione alternativa della retina flatmount in cui la rimozione dei corpi cellulari dei fotorecettori consente una diffusione più rapida degli anticorpi e un migliore accesso con pipette patch ai neuroni retinici interni per esperimenti di immunoistochimica, ibridazione in situ ed elettrofisiologia.

Retina divisa come preparazione flatmount migliorata per lo studio dei neuroni dello strato nucleare interno nella retina dei vertebrati

Impara la registrazione patch clamp su neuroni retinici in preparazione flat-mount di retina di topo. Questo metodo preserva le connessioni sinaptiche verticali e laterali per studiare la diversità neuronale.

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

Esplora altri video