Name: Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a estudiar interacciones endotelio-pericito en vivo mediante ensayo de tapón de matriz gel en ratón. Este método permite identificar vías de señalización en angiogénesis y genes asociados a trastornos vasculares.

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El Dr. K. Yuan recibió el apoyo de una Subvención de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón (15SDG25710448) y el Premio de Prueba de Concepto (SPO121940 de la Asociación de Hipertensión Pulmonar). El Dr. V. de Jesús Pérez recibió el apoyo de un premio de desarrollo profesional de la Fundación Robert Wood Johnson, un premio K08 HL105884-01 de los NIH, un premio de la Asociación de Hipertensión Pulmonar, un premio de investigación biomédica de la Asociación Americana del Pulmón y un premio de Investigación Traslacional y Medicina Aplicada de la Universidad de Stanford.

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. NOTA: Los animales están bajo anestesia con isoflurano al 3% vaporizador y suministro de 3% de gas O2. El uso de ungüento veterinario en los ojos puede ayudar a prevenir la sequedad, mientras que bajo anestesia. 1. Preparación de la célula <ol><li> Crecer cultivos de células endoteliales y pericitos humanos en placas de 100 mm con 10 ml del medio de comunicación adecuado. Reemplazar 10 ml de medio fresco cada 2 - 3 días hasta que las células alcanzan 80% de confluencia. <ol><li> células de cultivo endoteliales (EC) en medio completo de células endoteliales (ECM) suplementado con empresa suministran 5% de suero bovino fetal (FBS), 10% de penicilina / estreptomicina y 10% de suplemento de crecimiento de células endoteliales. </li><li> pericitos en los medios de cultivo de pericitos completa (PM), complementado con la compañía suministran 2% de SFB, 10% de penicilina / estreptomicina y 10% de suplemento de crecimiento de pericitos. </li&gt; </ol></li><li> Preparar mezclas de células <ol><li> Calcular el número requerido de células para los grupos experimental y de control. NOTA: Cada tapón en el grupo experimental contiene un millón (1 x 10 6) EC humana y doscientos mil (2 x 10 5) pericitos. Para el grupo control, cada tapón contiene sólo 1,2 millones de EC humanos. El grupo de control negativo tiene gel matriz solamente. Cada grupo debe incluir al menos cuatro tapones, lo que requeriría dos ratones como los tapones se pueden inyectar en cada lado de un ratón de baja de la espalda. Tres enchufes servirían como por triplicado para el experimento y el cuarto se podrían utilizar en caso de que una falla. Preparar el 25% de células adicionales para que coincida con el volumen extra de gel. </li><li> Recoger y contar las células de las placas de cultivo. <ol><li> Para separar las células, eliminar el medio y lavar una vez con solución salina tamponada 1x temperatura ambiente fosfato (PBS). Retirar PBS, se añade 1 ml de tripsina al 0,25% / EDTA 2,21 mM, y se incuba durante 1 min. Lavar las células de la placa mediante la adición de 2medio y recoger ml en un tubo de 15 ml. </li><li> Recuento de células usando un hemocitómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Centrifugar el número apropiado de células en un gránulo a 400 xg durante 5 min. Para el grupo experimental, centrifugar tanto ECs y pericitos abajo juntos en un pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparación matriz de gel <ol><li> Descongelar matriz de gel por completo a 4 ° C durante 4 horas o toda la noche para obtener una solución homogénea. No se requiere ninguna mezcla. </li><li> gel de alícuota de la matriz en tubos de 1,5 ml y se almacena a 4 ° C. </li><li> Pre-térmica del estériles tubos de 1,5 ml y 28 g jeringas de 1 cc de insulina a 4 ° C. Precaución: Mantenga gel de matriz en hielo en todo momento. </li><li> Mezclar gel matriz fría con bFGF a una relación en volumen de 1: 100 (concentración final de bFGF = 0,5 mg / ml; bFGF de la solución = 50 mg / ml) Después de mezclar la solución de gel de matriz pipeteando arriba y abajo varias veces, incubar en hielo durante 30 - 60 min bntes de la mezcla con las células en el paso 3.1. NOTA: Descongelar la población de bFGF antes de mezclar. Calcular el número de tapones necesarios para la inyección. Por ejemplo, cada tapón de gel requiere 200 l de matriz. Por lo tanto, preparar 25% de gel extra. </li></ol> 3. Mezclar matriz de gel con células <ol><li> Para cada grupo, resuspender el sedimento celular (que contiene el número de células apropiado) con el volumen calculado de gel de matriz que contiene bFGF. Mezclar suavemente para evitar la formación de espuma y dejar en el tubo de 15 ml en hielo hasta que los ratones se preparan para inyección. </li></ol> 4. Preparación del ratón <ol><li> Anestesie 1 ratones SCID para 5 min en 3% de isoflurano más O 2 3% en una cámara de inducción. Centrarse en un grupo experimental o 2 ratones, a la vez. </li><li> Retire el ratón desde la cámara de inducción, el lugar en un lado ventral almohadilla caliente hacia abajo y adjuntar rápidamente una boquilla de hocico a la cara del ratón a través de un sistema no re-respiración para suministrar la anestesia en todo el injeprocedimiento cción. Conmutar el flujo de gas desde la cámara de inducción al sistema sin reinspiración y bajar la presión del gas a 1,5% de isoflurano y 1,5% de O 2. </li><li> Eliminar el vello de ambas regiones traseras laterales (alrededor de 1 cm de diámetro) con una máquina de afeitar o crema de eliminación de pelo. </li><li> Limpie el área con una gasa con alcohol al 70%. </li><li> Devolver el ratón hacia la cámara de inducción y repita los pasos 4.2 a 4.4 con el segundo ratón. </li></ol> 5. matriz de gel de inyección <ol><li> Preparar un ratón para inyección uniendo al sistema sin reinspiración y puesta en el lado ventral hacia abajo almohadilla térmica. </li><li> Cargar el gel de la matriz en un pre-refrigerada 28 G 1 cc jeringa de insulina de un ratón a la vez. <ol><li> Cargar el volumen total de 500 l de gel de matriz para dos tapones (200 l por enchufe más 25% extra) en la jeringa. </li><li> Asegúrese de inyectar el gel de la matriz en los ratones dentro de 3 min de cargar las células en la jeringa para evitar que la ceLLS de depositarse en el lado de la jeringa y para evitar gel matriz se solidifique dentro de la jeringa. </li></ol></li><li> Levante la piel de la espalda para localizar espacio subcutáneo, a continuación, inyectar 200 l de la matriz de gel de forma lenta y uniforme en el espacio subcutáneo de la parte posterior trasera de la caja torácica. </li><li> Retire la aguja de inyección lentamente, teniendo cuidado de evitar que la matriz de gel se escape fuera del lugar de la inyección. Una protuberancia se forma en el sitio de inyección. Limpie el lugar de inyección con un algodón con alcohol. </li><li> inyección repita los pasos 5.2 a 5.5 en el otro lado de la espalda del ratón, a continuación, dejar el ratón sobre su espalda durante 1 minuto para permitir la gelificación de la matriz de gel sobre la almohadilla de calor. </li><li> Esquema de ambos golpes utilizando un marcador permanente para identificar el bulto después de 14 días. Después de un poco de pelo vuelve a crecer, será más fácil encontrar el bache. </li></ol> 6. Enchufe matriz de gel de aislamiento: 14 días después de la inyección <ol><li> La eutanasia a los ratones con humanidad mediante la exposición del animals de&gt; 5 min de la inhalación de dióxido de carbono seguido por dislocación cervical para asegurar la muerte. </li><li> Retire el tapón de gel de la matriz de la espalda del ratón. <ol><li> Retire con cuidado cabello nuevo alrededor del sitio de la inyección, donde el tapón se encuentra repitiendo el paso 4.3. La línea de marcador indica el tamaño del bulto original bajo la piel. </li><li> Escindir el enchufe junto con las capas de piel y músculo que rodea adjuntos en los lados superior e inferior de la clavija, respectivamente. <ol><li> Usando tijeras quirúrgicas finas, hacer una incisión en la frontera marcada de la clavija que es perpendicular a la piel y cortar a través de al músculo debajo del tapón. Luego, corte con cuidado alrededor de la periferia del tapón a lo largo del borde marcado. </li><li> Retire el tapón, manteniéndolo intercalada entre las capas de la piel y el músculo. Lavar inmediatamente en un pequeño vaso de precipitado con 1x PBS para lavar el exceso de sangre. El tapón está ahora listo para ser fijado (paso siguiente, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Fijar el PLUg en 4% de paraformaldehído. <ol><li> Toda la clavija, incluyendo las capas de piel y músculo, en un tubo de 50 ml con 25 ml de paraformaldehído al 4% durante 24 horas a temperatura ambiente sin balanceo. Al día siguiente, la transferencia de la clavija en 25 ml de etanol al 70% durante otras 24 horas antes de la inclusión en parafina. NOTA: Maneje con precaución paraformaldehído. Usar guantes. </li></ol></li></ol> 7. Proceso de la matriz de gel de parafina Plug <ol><li> Preparar el enchufe para la inclusión en parafina. <ol><li> Oriente la clavija como se muestra en la Figura 1a; colocar el tapón en un casete de tejido de manera que el lado de la clavija está orientada hacia arriba y tanto en las capas de piel y músculo son visibles a través de la superficie del bloque de tejido que se va a cortar durante el corte primero. </li></ol></li><li> Parafina incrustar el tapón de acuerdo con los protocolos estándar de inclusión en parafina 13. </li><li> Cortar 8 - 10 micras de espesor secciones fuera del bloque de tejido y su montaje en portaobjetos de microscopio According a los protocolos estándar de parafina seccionar 13. </li><li> Almacenar las preparaciones en un lugar fresco y seco a temperatura ambiente hasta que esté listo para la tinción. </li></ol> 8. Las secciones se tiñen con hematoxilina y eosina (H &amp; E) 13 <ol><li> De-paraffinize las secciones de tejido haciendo pasar las diapositivas a través de 100% de xileno dos veces, 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol y por último 1x PBS, cada uno durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deja diapositivas en 1x PBS hasta el siguiente paso. </li><li> 100 l solución de H &amp; E pipeta sobre la sección y se incuba durante 1 - 5 min, o hasta que hay una clara diferencia entre los núcleos y citoplasma azul rosado en una célula como se observa bajo un microscopio de luz en posición vertical a un aumento de 10X. Tenga cuidado de no dejar que cualquier solución de H &amp; E toque el objetivo. </li><li> Lavar con H &amp; E solución fuera de la corredera por meter el portaobjetos en un vaso grande de agua del grifo, a continuación, colocar el portaobjetos en un rack en el vaso de precipitados y enjuagar con agua corriente durante 2 min. </li><li> Mesve al paso 9.8 para montar las diapositivas. </li></ol> 9. Manchas otras diapositivas capilares humanos y pericitos <ol><li> De-paraffinize las secciones de tejido haciendo pasar las diapositivas a través de 100% de xileno dos veces, 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol y por último 1x PBS, cada uno durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deja diapositivas en 1x PBS hasta el siguiente paso. </li><li> Hervir las secciones de solución de recuperación de antígeno. <ol><li> En un vaso de 2 L, se preparan hirviendo antígeno de recuperación de solución usando tampón de citrato 1x (pH 7,0) a 95 ° C en un bloque de calentamiento. </li><li> Una vez hirviendo, colocar los portaobjetos en una rejilla de metal y sumergir en la solución de recuperación de antígeno de ebullición durante 20 minutos. </li><li> Retirar con cuidado el vaso de precipitados del bloque de calentamiento con las diapositivas todavía sumergidas y permita que la solución para volver lentamente a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. </li><li> Colocar los portaobjetos en PBS 1x hasta el siguiente paso. </li></ol></li><li> Bloquear las secciones en tampón de bloqueo (PBS 1x, 5% de suero de cabra, 00,3% de Triton X-100). <ol><li> Dibujar un círculo hidrofóbica alrededor de los bordes de cada sección con un bolígrafo PAP. </li><li> Colocar los portaobjetos en una bandeja de humedad con agua destilada en la parte inferior de la bandeja. </li><li> Pipeta de tampón de bloqueo 100 l en las secciones asegurándose de que todo el tejido está cubierto por el líquido (puede requerir más de 100 l). </li><li> Incubar las secciones con tampón de bloqueo durante 1 hr. </li></ol></li><li> Incubar las secciones con el anticuerpo primario. <ol><li> Preparar una solución con dos anticuerpos primarios para sondear cada sección para CD31 (EC) y la actina de músculo liso (pericitos) diluido en tampón de dilución (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% de Triton X-100). NOTA: Aquí, la concentración de anti-CD31 es 1:50 y la concentración de actina anti-músculo liso es 1: 300. </li><li> Incubar las secciones durante la noche a 4 ° C con 100 anticuerpos primarios mu l en una bandeja de humedad que contiene agua destilada. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1x PBST (1x PBS + 0,1% TWEEN20) durante 5 minutos cada lavado. </li><li> Incubar las secciones con anticuerpo secundario. <ol><li> Preparar una solución con un fluoróforo conjugado de cabra anti-conejo anticuerpo secundario para reconocer el anticuerpo de conejo anti-CD31 diluido en tampón de dilución. <ol><li> NOTA: El anticuerpo primario actina de músculo liso ya está conjugado con un fluoróforo Cy3, así que se necesita ninguna tinción anticuerpo secundario. conejo concentración de cabra anti anticuerpo secundario es de 1: 250. </li></ol></li><li> Incubar las secciones durante 1 hora con 100 l de anticuerpo secundario en la bandeja la humedad que contiene agua destilada. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1x PBST durante 5 minutos cada lavado. </li><li> Montar las diapositivas. <ol><li> Pipeta 2 - 3 gotas (~ 40 - 60 l) de antifade solución de montaje con DAPI tinción nuclear en cada sección. </li><li> Con cuidado, coloque un no. 1.5 cubreobjetos sobre las secciones y solución de montaje, lo que permite que el fluido se extiende a lo largo de las secciones y de los bordes dela hoja de la cubierta. utilizar suavemente un dedo para presionar las burbujas de aire que puedan estar situados sobre la sección. </li><li> Deje que los portaobjetos se sequen durante al menos 1 hora antes de su uso. </li></ol></li></ol> Densidad capilar 10. Cuantificar y la Estructura 14 <ol><li> Contar el número de capilares en H &amp; E secciones teñidas, expresado como # / mm2. <ol><li> Adquirir fotos de cuatro campos diferentes en un microscopio de luz en posición vertical bajo un aumento de 40X. NOTA: Los capilares se identifican como tubos llenos de células rojas de la sangre. </li><li> Alternativamente, en lugar de los capilares contando manualmente, utilice el software de análisis de imágenes (por ejemplo, Wimasis Análisis de Imágenes) para cuantificar diversos parámetros de la angiogénesis, como el número buque, buque longitud media y diámetro, y los puntos de ramificación. </li></ol></li><li> Analizar la estructura capilar en secciones teñidas de inmunofluorescencia. <ol><li> Adquirir fotos de cuatro campos diferentes en un microscopio de fluorescencia invertidacon el cubo de filtro FITC y TxRed. <ol><li> Utilice un cubo FITC a la imagen EC mediante excitación a 488 nm de longitud de onda y utilizar un cubo TxRed de pericitos imagen mediante excitación a 594 nm de longitud de onda. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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No se adjuntan intereses financieros en competencia.

El ensayo de tapón de gel de matriz ha demostrado ser un método conveniente y potente para evaluar la regulación de genes en la angiogénesis, los compuestos angiogénicos y antiangiogénicos en vivo, y como complemento a las pruebas in vitro. A continuación, describimos en detalle un nuevo ensayo tapón de gel de la matriz de la angiogénesis humana que investiga la interacción entre las células endoteliales y pericitos durante la formación de los vasos. Hay algunas me...

La angiogénesis es el proceso por el que los nuevos vasos sanguíneos se forman a partir de una red vascular preexistente 1 y es el foco de la investigación en curso a través de muchas áreas que van desde el desarrollo normal a la enfermedad. Este proceso dinámico implica la proliferación y migración de células endoteliales (EC) y el reclutamiento de pericitos para la construcción de un tubo vascular que se dirige hacia el sitio que necesita oxígeno y nutrientes 2. Para estudiar este proceso requiere un ensayo igualmente dinámico, lo más importante que puede recapitular la naturaleza tridimensional de la formación del tubo. Los ensayos in vitro de la matriz 3D se han desarrollado para hacer frente a esta necesidad y han funcionado bien para permitir que los investigadores definir los pasos discretos en el espacio y el tiempo en el que tiene lugar la angiogénesis 3, 4, 5, 6. Sin embargo, estos modelos matriciales en 3D in vitro se limitan a estudiar los vasos no perfundidos unad por lo tanto, carecen de los componentes críticos pertinentes para el proceso de angiogénesis (por ejemplo, haciendo circular el crecimiento y factores inhibidores, la tensión antinatural / fuerzas a través del lecho vascular) y dejar de simular el complejo entorno presente en el tejido vivo. Para hacer frente a esta limitación, varios ensayos de angiogénesis in vivo se han desarrollado 7, incluyendo el ensayo de tapón de gel de matriz que será el tema central de nuestro informe 8, 9. El ensayo de tapón de gel de matriz es un ensayo de angiogénesis in vivo bien establecido que atrae a los investigadores, ya que proporciona una plataforma sólida para probar las funciones de las diferentes células y sustancias en la angiogénesis. gel Matrix es una solución de membrana basal disponibles en el mercado que es secretada por la línea celular de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) que se solidifica en un material similar a un gel a 37 ° C. El gel de matriz puede mezclarse con células y / o sustancias, tales como factores de crecimiento, y injected por vía subcutánea en el ratón. El anfitrión EC invadirá el tapón de más de 14 días, formar una red vascular, y se convierten en perfusión de la sangre del huésped. Hasta la fecha, los ensayos tapón de gel de matriz se han centrado exclusivamente en el estudio del comportamiento de las células endoteliales durante la angiogénesis, sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento todavía no se ha hecho ningún esfuerzo para determinar si este ensayo puede usarse células endoteliales de co-cultivo y pericitos para estudiar cómo interactúan estos dos tipos de células durante la angiogénesis. Específicamente, la comprensión de la relación entre la EC y pericitos es valioso para el estudio de enfermedades en las que la pérdida de vasos sanguíneos es patológica, incluyendo isquemia microvascular y enfermedad vascular periférica 10, 11, 12. A continuación, se describe un protocolo que introduce pericitos derivadas de seres humanos a la mezcla de gel de la matriz junto con EC humana y el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Esta mezcla luego se puede inyectar por vía subcutánea in el dorso de ratones SCID para permitir la formación de vasos híbridos, totalmente funcionales, con recubrimiento de pericitos. Nuestro protocolo se describe cómo preparar tapones de gel de matriz que contienen EC humanos, ya sea con o sin pericitos humanos, la colocación en ratones SCID y cómo analizar los cortes histológicos de los puntos finales de la angiogénesis críticos.

<table><tbody><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina/0,53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kit de medios de células endoteliales (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>incluye medios, suplemento de crecimiento EC y penicilina/estreptomicina, cada uno suministrado al volumen adecuado para facilitar la mezcla</td></tr><tr><td>Kit de medios de pericitación (PM)</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>incluye medios, suplemento de crecimiento de pericitos y penicilina/estreptomicina, cada uno suministrado en el volumen adecuado para facilitar la mezcla</td></tr> de <tr><td>células endoteliales microvasculares pulmonares humanas primarias</td><td>Iniciativa Innovadora de Hipertensión Pulmonar</td><td></td><td>Este tipo de célula también está disponible comercialmente. Células utilizadas en el paso 1-4 de</td></tr><tr><td>los pericitos pulmonares humanos primarios</td><td>Iniciativa Innovadora de Hipertensión Pulmonar Este</td><td></td><td>tipo de célula no está disponible comercialmente, pero los paricitos cerebrales sí lo están. Células utilizadas en el paso 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (factor de crecimiento básico de fibroblastos)</td>La solución madre de <td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>es de 50 &mu; g/ml en 0,1% BSA en PBS, alícuotas a 50 &mu; l y almacenado a -20 grados</td></tr><tr><td>Matrigel Membrana Basal Matrix</td><td>BD 356237</td><td></td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Jeringa Insluin</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Inmunodeficiencia Combinada Severa) ratones</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD. La cepa SCID IL2R gamma knockout es la mejor cepa; 4-6 semanas de edad</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, estériles</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de rosca de 15 ml, estériles</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Pluma PAP</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair crema depilatoria</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-humano anti-humano anti-anti-humano CD31 anticuerpo primario</td> anti-conejo anti-conejo La solución de trabajo <td>LS-B4737</td> de <td>Biosciences</td><td>es 1:50</td></tr><tr><td>anti-humano Actina de músculo liso CY3 anticuerpo fluorescente primario</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>es 1:300</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-conejo de cabra; 488/verde</td> La solución de trabajo <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>es 1:250</td></tr><tr><td>Célula de solución Prolong Gold DAPI</td><td> Portaobjetos</td> de microscopio <td>de señalización 8961S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>n.º 1,5 cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>tampón de citrato 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>tijeras quirúrgicas extrafinas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td> Formalina (paraformaldehído<td></td></tr><tr><td>)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Casetes de papel tisú</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>suero de cabra</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio in vivo de interacción humano-endotelial de pericitos utilización de plug ensayo matriz de gel en el ratón

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

La angiogénesis es el proceso por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes. El crecimiento de nuevos vasos requiere la proliferación, migración y alineación coordinadas de las células endoteliales para formar estructuras tubulares, seguidas del reclutamiento de pericitos para proporcionar soporte mural y facilitar la maduración de los vasos. Los enfoques actuales de cultivo celular in vitro no pueden reproducir completamente el complejo entorno biológico donde las células endoteliales y los pericitos interactúan para producir vasos funcionales. Presentamos una nueva aplicación del ensayo in vivo matrix gel plug para estudiar las interacciones endotelio-pericito y la formación de vasos sanguíneos funcionales utilizando ratones con mutaciones de inmunodeficiencia combinada graves (SCID). En resumen, el gel de matriz se mezcla con una solución que contiene células endoteliales con o sin pericitos, seguido de una inyección en la parte posterior de ratones SCID anestesiados. Después de 14 días, los tapones de gel de la matriz se retiran, se fijan y se seccionan para el análisis histológico. La longitud, el número, el tamaño y la extensión de la cobertura pericitaria de los vasos maduros (definida por la presencia de glóbulos rojos en el lumen) se pueden cuantificar y comparar entre grupos experimentales utilizando plataformas estadísticas comerciales. Más allá de su uso como ensayo de angiogénesis, este ensayo de tapón de gel de matriz se puede utilizar para realizar estudios genéticos y como plataforma para el descubrimiento de fármacos. En conclusión, este protocolo permitirá a los investigadores complementar los ensayos in vitro disponibles para el estudio de las interacciones endotelio-pericito y su relevancia para la angiogénesis sistémica o pulmonar.

Representante tinción H &amp; E y de inmunofluorescencia de secciones tapón de gel de la matriz se muestran en la Figura 2. Secciones de la CE únicamente las clavijas muestran algunos vasos que en su mayoría no son perfundidos con sangre (Figura 2 arriba a la izquierda, flechas negras), mientras que los tapones que contienen tanto las EC y los pericitos mostrar varios perfundidos vasos de mayor diámetro y la cobertura de pericitos completa, como se evide...

Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

El objetivo general de este ensayo de gel matriz in vivo es investigar la interacción de las células endoteliales con parásitos. Este ensayo de matrigel está diseñado para ayudar a los investigadores a estudiar las etapas principales de la androgénesis. También permitirá la identificación de las vías de señalización responsables de las etapas principales en la formación de vasos sanguíneos, así como de los genes cuya disfunción puede provocar trastornos vasculares y otras aberraciones de la androgénesis.La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar la formación de vasos sanguíneos in vivo que involucra tanto a las células endoteliales como a sus células de soporte, los pericitos. Para comenzar, cultive células endoteliales humanas y cultivos celulares de parásitos en placas de 100 milímetros con 10 mililitros del medio adecuado. Cambie el medio cada dos o tres días hasta que las células alcancen una confluencia del 80 %.Para preparar la solución de gel matriz para mezclar con las células, descongele un stock de gel matriz durante la noche a cuatro grados Celsius. Luego, prepare alícuotas de 1,5 mililitros para almacenar a largo plazo a veinte grados Celsius bajo cero, o a cuatro grados Celsius durante hasta dos semanas. Cada tapón experimental requerirá 200 microlitros de gel matriz.Así, un tubo cargado puede abastecer seis placas con un exceso del 25%. Prepare cada alícuota necesaria para su uso añadiendo 15 microlitros de stock de beta-FGF 100x descongelado. Mezcle el beta-FGF en solución mediante pipeteo, luego incube en hielo durante al menos 30 minutos antes de añadir las células.En este momento, enfríe algunas jeringas de insulina de 1 cc con aguja de 28 gauge para las inyecciones. Para recolectar las células de las placas de cultivo, retire el medio y lave las células una vez con PBS. Después de retirar el PBS, agregue un mililitro de solución de tripsina y devuelva las placas al incubador durante un minuto.Luego, pipetee dos mililitros de medio de cultivo sobre las placas para desprender las células y recoja el medio en un tubo de 15 mililitros. Ahora, verifique la concentración de las muestras utilizando un hemocitómetro. A continuación, prepare alícuotas de células en tubos de 15 mililitros.Se utiliza aquí una combinación de un millón de células endoteliales y 200.000 parásitos para el grupo experimental. A continuación, centrifugue las alícuotas celulares a 400g durante cinco minutos. Luego, agregue el volumen calculado de gel matriz al sedimento celular y mezcle con pipeteo suave para que no se forme espuma, ya que las burbujas de aire no pueden inyectarse.Ahora mantenga las preparaciones en hielo hasta que los ratones estén listos para la inyección. Después de anestesiar un ratón con isoflurano y confirmar el estado de anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie, sujete el ratón al sistema de no rebreathing que suministra isoflurano y colóquelo sobre la almohadilla calefactora, con el lado ventral hacia abajo. Ahora retire aproximadamente un centímetro cuadrado de pelo de ambas regiones laterales posteriores.A continuación, limpie la piel expuesta con alcohol al 70%. Luego, cargue un mililitro de la solución celular preparada en una jeringa enfriada, lo suficiente para cuatro implantes. Para realizar una inyección, levante la piel de la espalda para localizar el espacio subcutáneo.Luego, inyecte lentamente 200 microlitros de manera uniforme en el espacio subcutáneo posterior a la caja torácica, y retire lentamente la aguja para evitar fugas. Después de la inyección, se formará un bulto en el sitio. Limpie el sitio con alcohol y luego marque el contorno del bulto con un rotulador permanente para poder localizarlo más tarde.A continuación, repita el procedimiento de inyección en el otro lado del ratón. Asegúrese de inyectar todas las células dentro de los tres minutos, ya que de lo contrario comenzarán a adherirse a la jeringa. Es fundamental realizar bien el paso de inyección para garantizar que el tapón de gel matriz se forme entre las capas de piel y músculo, de modo que el tapón mantenga una buena forma y no se difunda.Antes de proceder a inyectar el siguiente ratón, deje que el ratón inyectado permanezca sobre la almohadilla térmica durante un minuto para dar tiempo a que la matriz se gelifique. Tras la eutanasia, coloque el ratón sobre la mesa de operaciones. Después de eliminar cualquier pelo regenerado en el sitio de inyección, busque las líneas marcadoras que identifican la ubicación del tapón.Luego, utilizando tijeras quirúrgicas finas, realice una incisión a lo largo del borde marcado del cilindro, perpendicularmente a la piel y hasta el músculo subyacente. Corte cuidadosamente alrededor de la periferia del borde marcado. A continuación, retire el cilindro, manteniéndolo intercalado entre las capas de piel y músculo.Lave inmediatamente el injerto en un vaso de precipitados pequeño con PBS para eliminar la sangre. Luego, coloque todo el injerto en un tubo de 50 mililitros con 25 mililitros de paraformaldehído al 4%. Deje que se fije a temperatura ambiente durante 24 horas sin agitación.Al día siguiente, transfiera los fragmentos a 25 mililitros de etanol al 70 % durante 24 horas. Luego, continúe con la inclusión en parafina. Las secciones de los fragmentos que contienen solo células endoteliales muestran que algunos vasos no se perfunden con la sangre del huésped después de 14 días in-vivo.Por el contrario, los implantes que contienen tanto células endoteliales como parásitos muestran muchos vasos perfundidos tras 14 días in-vivo. Estos implantes presentan células positivas para la tinción de actina de músculo liso, visibles en rojo, inmediatamente adyacentes a células endoteliales positivas para CD31, visibles en verde. Por lo tanto, los parásitos podrían desempeñar un papel importante en la formación de nuevos vasos sanguíneos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar esta poderosa técnica in vivo para estudiar la formación de vasos sanguíneos utilizando múltiples tipos celulares. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores exploren diversos temas de biología vascular en modelos de ratón. Tras seguir este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa y el inmunotransferido tipo Western, para responder preguntas adicionales, tales como los cambios en la expresión génica y en proteómica.Esta técnica poderosa permitirá al investigador estudiar in vivo cómo interactúan las células endoteliales y los parásitos durante la formación de vasos sanguíneos, que es un paso clave en la androgénesis. Esta técnica poderosa también permitirá al investigador estudiar otras interacciones entre células que son relevantes para comprender enfermedades vasculares como la hipertensión pulmonar, entre otras.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una metodología para ofrecer la médula humana derivados de la sangre endoteliales que forman colonias de células (ECFCs) y médula ósea procedentes de células madre mesenquimales (MSC), integrado en un gel de colágeno / fibronectina, por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Esta combinación de células / gel genera una red humana vascular que conecta con la vasculatura del ratón.

Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

En este video, demostramos la visualización en tiempo real de las interacciones entre las células sanguíneas y el endotelio en las venas mesentéricas de un modelo de ratón inyectado intraperitonealmente con lipopolisacárido.

Microscopía intravital para analizar las interacciones entre células sanguíneas y endoteliales en un modelo de ratón con inflamación

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente...

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Describimos un ensayo de tapón de matrigel para ilustrar el potencial angiogénico de un conjunto de factores secretados por las células cancerosas utilizando dos modalidades de imagen complementarias, ultrasonido y endomicroscopía. El matrigel, un gel imitador de matriz extracelular (MEC), se utiliza para introducir al huésped (ratón) factores angiogénicos secretados al medio condicionado (CM).

Monitoreo Funcionalidad y Morfología de Vasculatura Reclutado por factores secretados por las células tumorales generadoras de crecimiento rápido

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

El mantenimiento de la cobertura de la barrera hematoencefálica es clave para la homeostasis del sistema nervioso central. Este protocolo describe técnicas in vitro para delinear los procesos fundamentales y patológicos que modulan la cobertura de la barrera hematoencefálica.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.

Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

El método aquí presentado puede evaluar el efecto de los reactivos sobre la angiogénesis o la permeabilidad vascular in vivo sin tinción. El método utiliza la inyección de dextrano-FITC a través de la vena de la cola para visualizar los neovasos o la fuga vascular.

Ensayo de tapón de gel de matriz in vivo modificado para estudios de angiogénesis

Aprende a estudiar interacciones endotelio-pericito en vivo mediante ensayo de tapón de matriz gel en ratón. Este método permite identificar vías de señalización en angiogénesis y genes asociados a trastornos vasculares.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

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