Name: Preparazione e In Vivo Lutilizzo di una sonda Activity-based per N -acylethanolamine Acid amidasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Scopri la sintesi e l'uso della sonda ARN14686 per rilevare la forma attiva di NAAA in estratti cellulari e sezioni tessutali. Questo metodo fornisce informazioni affidabili sull'attivazione enzimatica in condizioni fisiologiche e patologiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano il Nikon Imaging Center presso l'Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italia (NIC@IIT).

<ol><li>Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+mass+spectrometry+and+sequence+database+searching%3A+tools+for+cancer+research+in+the+post-genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era.</a> Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).</li>
<li>Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+yeast+proteome+by+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology.</a> Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).</li>
<li>Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteomics.</a> Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+the+two-hybrid+system+in+exploration+of+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).</li>
<li>Evans, M. J., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+profiling+of+enzyme+families%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based profiling of enzyme families.</a> Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).</li>
<li>Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling%3A+from+enzyme+chemistry+to+proteomic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry.</a> Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Meldal, M., Tornoe, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition.</a> Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).</li>
<li>Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+in+vivo+using+a+copper%28i%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kohn, M., Breinbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Staudinger+ligation-a+gift+to+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Staudinger ligation-a gift to chemical biology.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).</li>
<li>Romeo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Probe+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase.</a> ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).</li>
<li>Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+an+acid+amidase+selective+for+N-palmitoylethanolamine%2C+a+putative+endogenous+anti-inflammatory+substance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance.</a> J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).</li>
<li>Tsuboi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+novel+member+of+the+choloylglycine+hydrolase+family+with+structural+and+functional+similarity+to+acid+ceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase.</a> J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).</li>
<li>Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+%28NAAA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodivers%22%5BJournal%5D)">The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA).</a> Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).</li>
<li>Ribeiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+Systemically+Active+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+Inhibitor+that+Suppresses+Inflammation+and+Human+Macrophage+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation.</a> ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).</li>
<li>Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+and+glycosylation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+lysosomal+enzyme+involved+in+the+endocannabinoid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism.</a> Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+crucial+in+pH+regulation+and+proteolytic+activation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).</li>
<li>West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+human+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).</li>
<li>Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+discovery+of+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors.</a> Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).</li>
<li>Sasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+effects+of+the+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitor+ARN077+in+rodent+pain+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models.</a> Pain. 154, 350-360 (2013).</li>
<li>Duranti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-%282-oxo-3-oxetanyl%29carbamic+acid+esters+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%3A+synthesis+and+structure-activity+and+structure-property+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships.</a> J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).</li>
<li>Ponzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+of+2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic+acid+esters%2C+a+class+of+potent+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).</li>
<li>Solorzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationships+of+N-%282-oxo-3-oxetanyl%29amides+as+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors.</a> J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).</li>
<li>Vitale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure-activity%2C+and+structure-stability+relationships+of+2-substituted-N-%284-oxo-3-oxetanyl%29+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Fiasella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Aminoazetidin-2-one+derivatives+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors+suitable+for+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration.</a> ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).</li>
<li>Armirotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Lactones+Inhibit+N-acylethanolamine+Acid+Amidase+by+S-Acylation+of+the+Catalytic+N-Terminal+Cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine.</a> ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).</li>
<li>Nuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+alpha-amino-beta-lactam+carbamic+acid+ester+as+NAAA+inhibitors.+Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies.</a> Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).</li>
<li>Bonezzi, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Important+Role+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+in+the+Complete+Freund%27s+Adjuvant+Rat+Model+of+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis.</a> J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Speers, A. E., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Protein+Profiling+%28ABPP%29+and+Click+Chemistry+%28CC%29-ABPP+by+MudPIT+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).</li>
<li>Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+biotinylated+proteins+on+streptavidin+resin%3A+a+protocol+for+quantitative+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution.</a> Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (264), (2007).</li>
<li>Giuffrida, A., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution+GC%2FMS+determination+of+anandamide+and+other+fatty+acylethanolamides+in+rat+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma.</a> FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).</li>
<li>Buczynski, M. W., Parsons, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+brain+endocannabinoid+levels%3A+methods%2C+interpretations+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls.</a> Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;attività enzimatica è finemente regolata a diversi livelli, tra cui l&#39;RNA di trascrizione, la sintesi proteica, traslocazione di proteine, modificazione post-traslazionale, e l&#39;interazione proteina-proteina. Spesso, l&#39;espressione dell&#39;enzima da solo non tiene conto per la sua attività. ABPP stato sviluppato per studiare l&#39;attività delle proteine ​​nel loro stato nativo. Sono necessarie due funzioni: una sonda chimica che si lega covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse e un tag g...

Comunemente utilizzati metodi per indagare i pattern di espressione, le interazioni e le funzioni delle proteine, comprese le piattaforme di spettrometria di cromatografia-massa liquida per l&#39;analisi fucile 1,2, lievito metodi doppio ibrido 3,4, e in vitro, sono limitati nel senso che sono in grado di valutare l&#39;attività delle proteine ​​nel loro stato nativo. Attività a base di proteine ​​profiling (ABPP) può essere utilizzato per colmare questa lacuna. In questo approccio, piccola molecola sonde in grado di legare covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse vengono coniugati ad un gruppo giornalista che consente il rilevamento di destinazione. Utilizzando click chemistry (CC), il giornalista può essere integrato nella sonda o può essere introdotto dopo l&#39;impegno di destinazione si è verificato 5,6. Quest&#39;ultimo metodo richiede l&#39;impiego di sonde contenenti opportuni gruppi chimici, ad esempio un alchino terminale o azide, che può essere modificato con una serie di reagenti giornalista tramite reazioni bio-ortogonali such come Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cicloaddizione 7-9 o Staudinger legatura 10,11. Recentemente, abbiamo divulgato la ARN14686 composti come il primo SOA per la in vitro e in vivo di rilevamento della idrolasi cisteina, NAAA 12. NAAA catalizza la disattivazione idrolitica di FAE saturi e monoinsaturi, tra cui oleoylethanolamide (OEA) e palmitoiletanolamide (PEA), che sono agonisti endogeni del movimento anti-infiammatorio dei recettori nucleari PPAR-alfa 13-15. NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in linfociti B 14,16, suggerendo un ruolo nella regolazione della risposta immunitaria innata. L&#39;enzima viene sintetizzato nel reticolo endoplasmatico rugoso in forma inattiva e viene attivata in compartimenti acidi della cellula da un meccanismo autoproteolytic 17. La scissione autoproteolytic genera un nuovo cisteina -Terminal N (C131 in topi e ratti, C126 nell&#39;uomo), che è il nucleofilo responsabile FAE Idrolisi 18,19. L&#39;inibizione farmacologica dell&#39;attività NAAA altera l&#39;equilibrio di sintesi / degradazione FAE a favore di un aumento dei livelli cellulari di FAE 16,20,21. Numerosi derivati β-lattone e β-lattamici hanno dimostrato di inibire l&#39;attività NAAA con elevata potenza e selettività 16,22-26. Questi inibitori agiscono attraverso S -acylation della cisteina catalitica 16,27,28. Il ARN14686 composto è stato progettato sulla base della struttura chimica del, inibitore β-lattamici NAAA serina-derivato sistemicamente attivo, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) 16. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 è stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale per la successiva coniugazione CC con un tag giornalista azide-cuscinetto. Abbiamo scelto di progettare un ABP in due fasi per minimally alterano la struttura del ponteggio originale, mantenendo così l&#39;affinità della sonda per NAAA. Inoltre, evitando l&#39;introduzione di tag ingombranti, tale sonda potrebbe essere più adatto per il trattamento in vivo di un ABP diretta. ARN14686 inibisce NAAA con potenza elevata (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) formando un addotto covalente con la cisteina catalitica dell&#39;enzima 12. Gli esperimenti in topi vivi hanno mostrato che la sonda è selettiva nel catturare NAAA espresso nei polmoni. Acido ceramidasi, un&#39;altra amidasi cisteina che condivide 33-34% di identità con NAAA, è stato anche identificato come un obiettivo a bassa affinità utilizzando alte concentrazioni di sonda (10 micron in vitro, 10 mg / ml per via endovenosa, iv) 12. Abbiamo usato anche ARN14686 per studiare la presenza di NAAA attivo nei tessuti infiammati di ratto in seguito a somministrazione di adiuvante completo di Freund (CFA) 29. Qui, descriviamo un protocollo per i il preparatisu di ARN14686 (Figura 1) e la sua applicazione alla ricerca di NAAA attivazione ex vivo. A titolo di esempio, si descrive una procedura sperimentale di visualizzare NAAA in zampe di ratto dopo la somministrazione CFA. In questo esperimento, le proteine ​​sono estratte dal tessuto zampa dopo l&#39;iniezione iv della sonda, e proteoma ABP-marcato è sottoposto a cc con biotina-azide. campioni Biotinylated sono arricchiti con perline streptavidina, e vengono eseguite le macchie di proteine. In un&#39;altra applicazione, descriviamo la localizzazione di NAAA attiva al microscopio a fluorescenza nei polmoni del mouse da topi trattati con sonda. In questo caso, il tessuto viene sezionata e sezioni sono sottoposti a CC in aggiunta rodamina. Uno schema di flusso di lavoro è illustrato nella figura 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonildiimidazolo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>2-dipiridilcarbonato</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>Dannoso</td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Infiammabile, tossico, pericoloso per l'ambiente acquatico</td></tr><tr><td>4-(Dimetilammino)piridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td></td></tr><tr><td>Tossico Acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Infiammabile, corrosivo</td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Carbone attivo infiammabile, tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Dannoso</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotina</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di bio-spin</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Tampone bloccante</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Albumina sierica Bovin altamente tossica</td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Pericolo per la salute</td></tr><tr><td>Nitrato di ammonio cerico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Ossidante, dannoso</td></tr><tr><td>idrato di cloralio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Cicloesadiene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Infiammabile, Pericolo per la salute</td></tr><tr><td>Cicloesano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Infiammabile, Nocivo, Pericolo per la salute, Pericolo per l'ambiente</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Nocivo, Pericolo per la salute</td></tr><tr><td>Etere etilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Infiammabile, Dannoso</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Infiammabile, Nocivo</td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Infiammabile, Glicerolo nocivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Centrifugare brevemente prima dell'uso per precipitare complessi proteici</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>altamente tossico Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Infiammabile, tossico, pericoloso per la salute</td></tr> <tr><td>N-(3-Dimetilamminopropil)-N&prime; -etilcarbodiimmide cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>nocivo, corrosivo</td></tr><tr><td>N-diisopropiletilammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>infiammabile, corrosivo, tossico</td></tr><tr><td>N-dimetilformammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>infiammabile, nocivo, pericolo per la salute</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serine</td><td>fluorochem</td><td>M03053</td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>confocale Nikon A1 dannosa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Leggere il manuale utente</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Palladio su carbonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Tossico, Pericolo per la salute, Pericolo</td></tr> <tr><td>per l'ambienteParaformaldeide</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Tossico, respiratorio nocivo, corrosivo, falsificabile</td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico)&nbsp;</td><td>Montante antisbiadimento Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold con DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Evitare la formazione di bolle</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td> Idruro di sodio <td>tossico, corrosivo, falsificabile</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td> infiammabile <td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000</td><td>scanner di immagini FUJIFILM</td><td></td><td>Leggi il manuale dell'utente</td></tr><tr><td>Streptavidina agarosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Tossico, infiammabile</td></tr><tr><td>Tetraidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Infiammabile, nocivo, pericoloso per la salute</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Tossico, caldo a 50 &deg; C per sciogliere</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 omogeneizzatore di tessuti di base</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>Urea dannosa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Tossico, caldo a 50 &deg; C per sciogliere</td></tr></tbody></table>

preparazione e<em&gt; in vivo</em&gt; l&#39;utilizzo di una sonda activity-based per<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine acid amidasi

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

profiling proteine ​​Activity-based (ABPP) è un metodo per l&#39;identificazione di un enzima di interesse in un proteoma complessa attraverso l&#39;uso di una sonda chimica che bersaglia siti attivi dell&#39;enzima. Un tag giornalista introdotto nella sonda permette di rilevare dell&#39;enzima etichettati da in-gel fluorescenza scansione, proteine ​​blot, microscopia a fluorescenza o spettrometria cromatografia-massa liquida. Qui, descriviamo la preparazione e l&#39;uso del ARN14686 composto, una sonda a base di attività di clic chimica (CC-ABP) che riconosce selettivamente l&#39;enzima N amidasi acido -acylethanolamine (NAAA). NAAA è una idrolasi cisteina che promuove l&#39;infiammazione disattivando endogeni agonisti del recettore-alfa proliferazione dei perossisomi attivato (PPAR), come palmitoiletanolamide (PEA) e oleoylethanolamide (OEA). NAAA viene sintetizzato come full-length inattiva proenzyme, che viene attivato dal autoproteolysis nel pH acido del lisosoma. studi di localizzazione have dimostrato che NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in B-linfociti. Forniamo esempi di come ARN14686 può essere utilizzato per rilevare e quantificare NAAA attiva ex vivo nei tessuti di roditori da proteine macchia e microscopia a fluorescenza.

ARN14686 è stato progettato sulla base del patibolo dell&#39;inibitore ARN726 NAAA. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale (Figura 1). Il tag alkyne stato introdotto per permettere l&#39;uso di una procedura di etichettatura in due fasi per aggiungere un fluoroforo o una molecola di biotina via CC. Questa caratteristica rende ARN14686 uno strumento molto versatile per sondare NAAA in ...

Qui, descriviamo la preparazione e l&#39;uso di una sonda per attività (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) che consente la rilevazione e quantificazione del forma attiva dell&#39;enzima proinfiammatorie N amidasica acido -acylethanolamine (NAAA), sia in vitro ed ex vivo.

Preparazione e<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilizzo di una sonda Activity-based per<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidasi

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare la sintesi di una sonda basata sull'attività, ARN 14 six eight six, specifica per l'N-acetilamminoetanolammide acida amidasi, o NAAA, e descriverne l'utilizzo per rilevare l'enzima cataliticamente attivo in estratti cellulari e sezioni di tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande riguardo alla funzione in viva della NAAA, fornendo informazioni sull'attivazione della NAAA in diverse condizioni fisiologiche e patologiche, come le malattie infiammatorie e neurodegenerative. Il suo principale vantaggio consiste nel fatto che una semplice manipolazione segue la reazione della NAAA con la sonda, fornendo così informazioni affidabili sullo stato di attivazione in viva dell'enzima.Un altro vantaggio è che, a differenza degli anticorpi specifici, la nostra sonda rileva solo la forma attiva dell'enzima, il che è utile per lo stato di microscopia a fluorescenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché combina diverse competenze che contribuiscono a un racconto completo, dalla corretta sintesi fino alle sue applicazioni finali. In un pallone da 50 millilitri a fondo rotondo sciogliere 350 milligrammi di undecynenolo e tre virgola cinque millilitri di diclorometano anidro.Aggiungere quindi 25 milligrammi di DMAP e 530 milligrammi di DPC a questa soluzione. Mescolare la miscela a temperatura ambiente per 16 ore. Dopo 16 ore, aggiungere 20 millilitri di diclorometano alla soluzione.Trasferire la miscela in un imbuto separatore. Aggiungere 15 millilitri di acqua. Agitare la miscela e lasciare separare le due fasi.Successivamente aprire il rubinetto, raccogliere la fase organica nella parte inferiore, chiudere il rubinetto e trasferire nuovamente la fase organica nelimbuto. Aggiungere 15 millilitri di una soluzione satura di bicarbonato di sodio alla miscela. Agitare ilimbuto separatore e lasciare separare le due fasi.Dopo aver asciugato lo strato organico con solfato di sodio, filtrarlo attraverso cotone in un pallone a fondo rotondo a due colli. Quindi evaporare lo strato organico a secco sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Pesare il pallone ed ottenere 600 milligrammi di olio, che è una miscela di due composti: piridil undecinil carbonato e undecinolo due ossipiridina carbossilato, in un rapporto di uno virgola sette a uno.In un pallone da 10 millilitri a fondo rotondo, sciogliere 60 milligrammi di ossiacetilene ammonio acetato in due millilitri di diclorometano anidro. Raffreddare la soluzione a zero gradi Celsius in un bagno di ghiaccio, quindi aggiungere 81 microlitri di diazaproprilammina in modo goccia a goccia. Successivamente, sciogliere 350 milligrammi della miscela grezza contenente undecinolo due carbossilato di ossipiridina in due millilitri di diclorometano anidro.Aggiungere la miscela disciolta alla soluzione e mescolare a temperatura ambiente per 15 ore. Successivamente, evaporare il solvente a secco sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Purificare il composto mediante cromatografia su colonna a gel di silice usando un apparato automatizzato per cromatografia su colonna.Prima assorbire il campione su gel di silice. Dopo aver equilibrato la colonna con cicloesene, caricare il campione nella cartuccia. Eluire il campione con acetato di etile in cicloesano dallo 0 al 100, raccogliendo i picchi in provette.Evaporare il solvente delle frazioni corrispondenti al composto fino a completa essiccazione sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante, ottenendo 40 milligrammi di un solido bianco. Dopo aver pre-pulito il campione come descritto nel protocollo testuale, aggiungere 11,3 microlitri di una soluzione madre di azide polietilenglicole biotina 5 millimolare e vortexare. Quindi aggiungere 11,3 microlitri di una soluzione madre di TCEP 50 millimolare appena preparata al campione e vortexare.Dopo aver premiscelato 34 microlitri di una soluzione lavorativa appena preparata di TBTA 1,7 millimolare con 11,3 microlitri di una soluzione madre di solfato di rame 50 millimolare, aggiungere 45,3 millilitri di questa soluzione al campione e omogeneizzare con il vortex. Utilizzare contenitori etichettati. Incubare la reazione a 25 gradi Celsius per almeno due ore.Dopo un'incubazione di un'ora, osservare la precipitazione delle proteine e mescolare la reazione. Centrifugare il campione per quattro minuti a 6.500 ×g a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere 750 microlitri di metanolo freddo e risospendere il pellet mediante sonificazione con un sonicator a sonda per cinque secondi.Quindi centrifugare il campione per quattro minuti a 6.500 ×g a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante con una siringa e un ago. Dopo aver lavato altre due volte con metanolo freddo, aggiungere 325 microlitri di SDS al 2,5% in PBS al pellet proteico.Sonicare il campione tre volte per cinque secondi. Successivamente, riscaldare il campione per cinque minuti a 65 gradi Celsius. Dopo la sonica, centrifugare il campione per cinque minuti a 6.500 ×g a temperatura ambiente.Quindi trasferire il soprannatante in un tubo pulito da 15 millilitri e aggiungere 1,4 millilitri di PBS al soprannatante per diluire la concentrazione di SDS allo 0,5 percento. Per l'arricchimento con streptavidina, portare prima il volume del campione a 4,2 millilitri con PBS. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di una sospensione al 50% di agarosio con streptavidina prerisciacquato, utilizzando una punta con estremità tagliata.Incubare la miscela per due ore a temperatura ambiente con rotazione. Dopo aver centrifugato per due minuti a 1.400 × g, rimuovere il soprannatante senza far seccare il pellet di perle. Utilizzare il soprannatante residuo per trasferire le perle in una colonna spin da un millilitro e lavare la colonna per gravità con un millilitro di SDS all'1% in PBS.Continuare a lavare le perle con urea a sei moli seguita da PBS come descritto nel protocollo testuale. Quindi utilizzare 500 microlitri di PBS per trasferire le perle lavate in un tubo da un punto cinque millilitri. Dopo aver centrifugato il campione per due minuti a 1.400 volte G, aspirare delicatamente il soprannatante con una siringa e un ago.Per eluire le proteine legate alla resina, aggiungere 25 microlitri di buffer di eluizione al pellet di resina e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, seguiti da 15 minuti a 95 gradi Celsius. Aggiungere circa 400 microlitri di mix per click chimica alle fette di tessuto che sono state preparate secondo il protocollo descritto nel testo. Prestare attenzione affinché il volume scelto di mix per click chimica sia sufficiente a coprire le fette.Quindi incubare le sezioni di tessuto per un'ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, lavare i campioni con PBS per cinque minuti e successivamente con metanolo freddo per cinque minuti. Successivamente, lavare le sezioni di tessuto tre volte con una soluzione di un percento di Tween 20 e zero virgola cinque millimoli di EDTA in PBS per due minuti.Infine, lavare le sezioni un'ultima volta con PBS per cinque minuti. Dopo l'essiccazione a temperatura ambiente, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio antifade con DAPI. Chiudere i campioni con coprioggetti e sigillare con vernice. Per la sintesi della sonda, l'undecinenolo viene attivato dal carbonato di dipiridile in presenza di una quantità catalitica di 4-dimetilammino piridina per produrre un carbonato misto, che successivamente reagisce con il lattame aminilico. Il beta-lattame, ovvero la parte terminale della sonda, reagisce con il sito attivo di NAAA, mentre l'alkine terminale può essere funzionalizzato con un marcatore reporter mediante chimica click. ARN 14 sei otto sei è stato utilizzato per rilevare l'attivazione di NAAA in estratti proteici di zampe infiammate di ratto mediante blocco proteico. In ratti naïve, nessun segnale di NAAA viene rilevato.Al contrario, nei ratti trattati con adiuvante completo di Freund si osserva una marcata banda corrispondente a NAAA attiva. Un'altra applicazione di ARN 14 six eight six è l'analisi tissutale mediante microscopia a fluorescenza. Qui le cellule rosse rappresentano macrofagi alveolari positivi per NAAA attiva.NAAA è localizzata in strutture vescicolari diffuse, come osservabile a un ingrandimento maggiore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare e utilizzare ARN 14 six eight six per rilevare NAAA attiva nei tessuti, sia mediante analisi proteica su blot che mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, anche se questo protocollo è specifico per il nostro bersaglio, le applicazioni della sonda che descriviamo potrebbero essere facilmente adattate ad altre sonde basate sull'attività, specifiche per bersagli diversi da NAAA.

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Un protocollo per rilevare tricoteceni (micotossine di preoccupazione per la salute umana), utilizzando un metodo di screening di nuova concezione basata su un metodo competitivo immunochimici e una rilevazione finale elettrochimica è dimostrata.

ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il...

Test in vitro Metilazione tRNA con l&#39;Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme

Un metodo per la determinazione dell'attività acetato chinasi è descritto. Questo test utilizza una reazione diretta per determinare l'attività enzimatica e la cinetica di acetato chinasi in acetato che formano direzione con diversi accettori fosforil. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per il saggio altro acetil fosfato o acetil-CoA che utilizzano enzimi.

Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Questo video dimostra la misurazione in vitro dell'attività enzimatica per la α-galattosidasi A e l'acido α-glucosidasi in campioni utilizzando substrati sintetici di 4-metilumbelliferile.

Misurazione in vitro dell'attività enzimatica della α-galattosidasi A e dell'acido α-glucosidasi

L'aggiunta di palmitato reversibile alle proteine ​​è un importante regolatore del traffico intracellulare delle proteine. Questo è di particolare interesse in neuroni dove sono palmitoilato molte proteine ​​sinaptiche. Utilizziamo un metodo semplice biochimico per rilevare le proteine ​​palmitoilato in neuroni in coltura, che possono essere adattati per più tipi di cellule e tessuti.

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

Il presente rapporto descrive un test enzimatico in vitro per misurare l'attività della fosfatidiletanolammina metiltransferasi utilizzando estratti cellulari di Leishmania. Questo test si basa sul trasferimento di un gruppo metilico radioattivo dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina endogena.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Questo lavoro presenta un metodo di screening ad alto rendimento utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico universale che può essere teoricamente applicato a oltre 200 enzimi. Qui, il singolo sistema di screening identifica tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina) semplicemente cambiando il substrato utilizzato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

C'è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci "orfani" chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.

In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe

La microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) viene applicata per l'immagine e l'analisi delle spine dendritiche nell'ippocampo murino.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Questo protocollo delinea le fasi dettagliate della microscopia immunoelettronica pre-incorporamento, con particolare attenzione all'esplorazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine nella retina.

Studio dei circuiti retinici e della localizzazione molecolare mediante microscopia immunoelettronica pre-incorporata

Scopri la sintesi e l'uso della sonda ARN14686 per rilevare la forma attiva di NAAA in estratti cellulari e sezioni tessutali. Questo metodo fornisce informazioni affidabili sull'attivazione enzimatica in condizioni fisiologiche e patologiche.

Preparazione e

Esplora altri video