Name: Preparazione e In Vivo Lutilizzo di una sonda Activity-based per N -acylethanolamine Acid amidasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Scopri la sintesi e l'uso della sonda ARN14686 per rilevare la forma attiva di NAAA in estratti cellulari e sezioni tessutali. Questo metodo fornisce informazioni affidabili sull'attivazione enzimatica in condizioni fisiologiche e patologiche.

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Gli autori ringraziano il Nikon Imaging Center presso l'Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italia (NIC@IIT).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;attività enzimatica è finemente regolata a diversi livelli, tra cui l&#39;RNA di trascrizione, la sintesi proteica, traslocazione di proteine, modificazione post-traslazionale, e l&#39;interazione proteina-proteina. Spesso, l&#39;espressione dell&#39;enzima da solo non tiene conto per la sua attività. ABPP stato sviluppato per studiare l&#39;attività delle proteine ​​nel loro stato nativo. Sono necessarie due funzioni: una sonda chimica che si lega covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse e un tag g...

Comunemente utilizzati metodi per indagare i pattern di espressione, le interazioni e le funzioni delle proteine, comprese le piattaforme di spettrometria di cromatografia-massa liquida per l&#39;analisi fucile 1,2, lievito metodi doppio ibrido 3,4, e in vitro, sono limitati nel senso che sono in grado di valutare l&#39;attività delle proteine ​​nel loro stato nativo. Attività a base di proteine ​​profiling (ABPP) può essere utilizzato per colmare questa lacuna. In questo approccio, piccola molecola sonde in grado di legare covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse vengono coniugati ad un gruppo giornalista che consente il rilevamento di destinazione. Utilizzando click chemistry (CC), il giornalista può essere integrato nella sonda o può essere introdotto dopo l&#39;impegno di destinazione si è verificato 5,6. Quest&#39;ultimo metodo richiede l&#39;impiego di sonde contenenti opportuni gruppi chimici, ad esempio un alchino terminale o azide, che può essere modificato con una serie di reagenti giornalista tramite reazioni bio-ortogonali such come Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cicloaddizione 7-9 o Staudinger legatura 10,11. Recentemente, abbiamo divulgato la ARN14686 composti come il primo SOA per la in vitro e in vivo di rilevamento della idrolasi cisteina, NAAA 12. NAAA catalizza la disattivazione idrolitica di FAE saturi e monoinsaturi, tra cui oleoylethanolamide (OEA) e palmitoiletanolamide (PEA), che sono agonisti endogeni del movimento anti-infiammatorio dei recettori nucleari PPAR-alfa 13-15. NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in linfociti B 14,16, suggerendo un ruolo nella regolazione della risposta immunitaria innata. L&#39;enzima viene sintetizzato nel reticolo endoplasmatico rugoso in forma inattiva e viene attivata in compartimenti acidi della cellula da un meccanismo autoproteolytic 17. La scissione autoproteolytic genera un nuovo cisteina -Terminal N (C131 in topi e ratti, C126 nell&#39;uomo), che è il nucleofilo responsabile FAE Idrolisi 18,19. L&#39;inibizione farmacologica dell&#39;attività NAAA altera l&#39;equilibrio di sintesi / degradazione FAE a favore di un aumento dei livelli cellulari di FAE 16,20,21. Numerosi derivati β-lattone e β-lattamici hanno dimostrato di inibire l&#39;attività NAAA con elevata potenza e selettività 16,22-26. Questi inibitori agiscono attraverso S -acylation della cisteina catalitica 16,27,28. Il ARN14686 composto è stato progettato sulla base della struttura chimica del, inibitore β-lattamici NAAA serina-derivato sistemicamente attivo, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) 16. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 è stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale per la successiva coniugazione CC con un tag giornalista azide-cuscinetto. Abbiamo scelto di progettare un ABP in due fasi per minimally alterano la struttura del ponteggio originale, mantenendo così l&#39;affinità della sonda per NAAA. Inoltre, evitando l&#39;introduzione di tag ingombranti, tale sonda potrebbe essere più adatto per il trattamento in vivo di un ABP diretta. ARN14686 inibisce NAAA con potenza elevata (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) formando un addotto covalente con la cisteina catalitica dell&#39;enzima 12. Gli esperimenti in topi vivi hanno mostrato che la sonda è selettiva nel catturare NAAA espresso nei polmoni. Acido ceramidasi, un&#39;altra amidasi cisteina che condivide 33-34% di identità con NAAA, è stato anche identificato come un obiettivo a bassa affinità utilizzando alte concentrazioni di sonda (10 micron in vitro, 10 mg / ml per via endovenosa, iv) 12. Abbiamo usato anche ARN14686 per studiare la presenza di NAAA attivo nei tessuti infiammati di ratto in seguito a somministrazione di adiuvante completo di Freund (CFA) 29. Qui, descriviamo un protocollo per i il preparatisu di ARN14686 (Figura 1) e la sua applicazione alla ricerca di NAAA attivazione ex vivo. A titolo di esempio, si descrive una procedura sperimentale di visualizzare NAAA in zampe di ratto dopo la somministrazione CFA. In questo esperimento, le proteine ​​sono estratte dal tessuto zampa dopo l&#39;iniezione iv della sonda, e proteoma ABP-marcato è sottoposto a cc con biotina-azide. campioni Biotinylated sono arricchiti con perline streptavidina, e vengono eseguite le macchie di proteine. In un&#39;altra applicazione, descriviamo la localizzazione di NAAA attiva al microscopio a fluorescenza nei polmoni del mouse da topi trattati con sonda. In questo caso, il tessuto viene sezionata e sezioni sono sottoposti a CC in aggiunta rodamina. Uno schema di flusso di lavoro è illustrato nella figura 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonildiimidazolo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Nocivo</td></tr><tr><td>2-dipiridilcarbonato</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>Dannoso</td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Infiammabile, tossico, pericoloso per l'ambiente acquatico</td></tr><tr><td>4-(Dimetilammino)piridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td></td></tr><tr><td>Tossico Acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Infiammabile, corrosivo</td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Carbone attivo infiammabile, tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Dannoso</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotina</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di bio-spin</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Tampone bloccante</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Albumina sierica Bovin altamente tossica</td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Pericolo per la salute</td></tr><tr><td>Nitrato di ammonio cerico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Ossidante, dannoso</td></tr><tr><td>idrato di cloralio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Cicloesadiene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Infiammabile, Pericolo per la salute</td></tr><tr><td>Cicloesano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Infiammabile, Nocivo, Pericolo per la salute, Pericolo per l'ambiente</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Nocivo, Pericolo per la salute</td></tr><tr><td>Etere etilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Infiammabile, Dannoso</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Infiammabile, Nocivo</td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Infiammabile, Glicerolo nocivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Centrifugare brevemente prima dell'uso per precipitare complessi proteici</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>altamente tossico Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Infiammabile, tossico, pericoloso per la salute</td></tr> <tr><td>N-(3-Dimetilamminopropil)-N&prime; -etilcarbodiimmide cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>nocivo, corrosivo</td></tr><tr><td>N-diisopropiletilammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>infiammabile, corrosivo, tossico</td></tr><tr><td>N-dimetilformammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>infiammabile, nocivo, pericolo per la salute</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serine</td><td>fluorochem</td><td>M03053</td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>confocale Nikon A1 dannosa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Leggere il manuale utente</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Palladio su carbonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Tossico, Pericolo per la salute, Pericolo</td></tr> <tr><td>per l'ambienteParaformaldeide</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Tossico, respiratorio nocivo, corrosivo, falsificabile</td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico)&nbsp;</td><td>Montante antisbiadimento Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold con DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Evitare la formazione di bolle</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td> Idruro di sodio <td>tossico, corrosivo, falsificabile</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td> infiammabile <td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000</td><td>scanner di immagini FUJIFILM</td><td></td><td>Leggi il manuale dell'utente</td></tr><tr><td>Streptavidina agarosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Tossico, infiammabile</td></tr><tr><td>Tetraidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Infiammabile, nocivo, pericoloso per la salute</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Tossico, caldo a 50 &deg; C per sciogliere</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 omogeneizzatore di tessuti di base</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>Urea dannosa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Tossico, caldo a 50 &deg; C per sciogliere</td></tr></tbody></table>

preparazione e<em&gt; in vivo</em&gt; l&#39;utilizzo di una sonda activity-based per<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine acid amidasi

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

profiling proteine ​​Activity-based (ABPP) è un metodo per l&#39;identificazione di un enzima di interesse in un proteoma complessa attraverso l&#39;uso di una sonda chimica che bersaglia siti attivi dell&#39;enzima. Un tag giornalista introdotto nella sonda permette di rilevare dell&#39;enzima etichettati da in-gel fluorescenza scansione, proteine ​​blot, microscopia a fluorescenza o spettrometria cromatografia-massa liquida. Qui, descriviamo la preparazione e l&#39;uso del ARN14686 composto, una sonda a base di attività di clic chimica (CC-ABP) che riconosce selettivamente l&#39;enzima N amidasi acido -acylethanolamine (NAAA). NAAA è una idrolasi cisteina che promuove l&#39;infiammazione disattivando endogeni agonisti del recettore-alfa proliferazione dei perossisomi attivato (PPAR), come palmitoiletanolamide (PEA) e oleoylethanolamide (OEA). NAAA viene sintetizzato come full-length inattiva proenzyme, che viene attivato dal autoproteolysis nel pH acido del lisosoma. studi di localizzazione have dimostrato che NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in B-linfociti. Forniamo esempi di come ARN14686 può essere utilizzato per rilevare e quantificare NAAA attiva ex vivo nei tessuti di roditori da proteine macchia e microscopia a fluorescenza.

ARN14686 è stato progettato sulla base del patibolo dell&#39;inibitore ARN726 NAAA. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale (Figura 1). Il tag alkyne stato introdotto per permettere l&#39;uso di una procedura di etichettatura in due fasi per aggiungere un fluoroforo o una molecola di biotina via CC. Questa caratteristica rende ARN14686 uno strumento molto versatile per sondare NAAA in ...

Qui, descriviamo la preparazione e l&#39;uso di una sonda per attività (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) che consente la rilevazione e quantificazione del forma attiva dell&#39;enzima proinfiammatorie N amidasica acido -acylethanolamine (NAAA), sia in vitro ed ex vivo.

Preparazione e<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilizzo di una sonda Activity-based per<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidasi

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare la sintesi di una sonda basata sull'attività, ARN 14 six eight six, specifica per l'N-acetilamminoetanolammide acida amidasi, o NAAA, e descriverne l'utilizzo per rilevare l'enzima cataliticamente attivo in estratti cellulari e sezioni di tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande riguardo alla funzione in viva della NAAA, fornendo informazioni sull'attivazione della NAAA in diverse condizioni fisiologiche e patologiche, come le malattie infiammatorie e neurodegenerative. Il suo principale vantaggio consiste nel fatto che una semplice manipolazione segue la reazione della NAAA con la sonda, fornendo così informazioni affidabili sullo stato di attivazione in viva dell'enzima.Un altro vantaggio è che, a differenza degli anticorpi specifici, la nostra sonda rileva solo la forma attiva dell'enzima, il che è utile per lo stato di microscopia a fluorescenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché combina diverse competenze che contribuiscono a un racconto completo, dalla corretta sintesi fino alle sue applicazioni finali. In un pallone da 50 millilitri a fondo rotondo sciogliere 350 milligram

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Biochemistry

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Un protocollo per rilevare tricoteceni (micotossine di preoccupazione per la salute umana), utilizzando un metodo di screening di nuova concezione basata su un metodo competitivo immunochimici e una rilevazione finale elettrochimica è dimostrata.

ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il...

Test in vitro Metilazione tRNA con l&#39;Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme

Un metodo per la determinazione dell'attività acetato chinasi è descritto. Questo test utilizza una reazione diretta per determinare l'attività enzimatica e la cinetica di acetato chinasi in acetato che formano direzione con diversi accettori fosforil. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per il saggio altro acetil fosfato o acetil-CoA che utilizzano enzimi.

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Questo video dimostra la misurazione in vitro dell'attività enzimatica per la α-galattosidasi A e l'acido α-glucosidasi in campioni utilizzando substrati sintetici di 4-metilumbelliferile.

Misurazione in vitro dell'attività enzimatica della α-galattosidasi A e dell'acido α-glucosidasi

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Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

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Scopri la sintesi e l'uso della sonda ARN14686 per rilevare la forma attiva di NAAA in estratti cellulari e sezioni tessutali. Questo metodo fornisce informazioni affidabili sull'attivazione enzimatica in condizioni fisiologiche e patologiche.

Preparazione e

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