Preparazione e

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare la sintesi di una sonda basata sull'attività, ARN 14 six eight six, specifica per l'N-acetilamminoetanolammide acida amidasi, o NAAA, e descriverne l'utilizzo per rilevare l'enzima cataliticamente attivo in estratti cellulari e sezioni di tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande riguardo alla funzione in viva della NAAA, fornendo informazioni sull'attivazione della NAAA in diverse condizioni fisiologiche e patologiche, come le malattie infiammatorie e neurodegenerative. Il suo principale vantaggio consiste nel fatto che una semplice manipolazione segue la reazione della NAAA con la sonda, fornendo così informazioni affidabili sullo stato di attivazione in viva dell'enzima.

Un altro vantaggio è che, a differenza degli anticorpi specifici, la nostra sonda rileva solo la forma attiva dell'enzima, il che è utile per lo stato di microscopia a fluorescenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché combina diverse competenze che contribuiscono a un racconto completo, dalla corretta sintesi fino alle sue applicazioni finali. In un pallone da 50 millilitri a fondo rotondo sciogliere 350 milligrammi di undecynenolo e tre virgola cinque millilitri di diclorometano anidro.

Aggiungere quindi 25 milligrammi di DMAP e 530 milligrammi di DPC a questa soluzione. Mescolare la miscela a temperatura ambiente per 16 ore. Dopo 16 ore, aggiungere 20 millilitri di diclorometano alla soluzione.

Trasferire la miscela in un imbuto separatore. Aggiungere 15 millilitri di acqua. Agitare la miscela e lasciare separare le due fasi.

Successivamente aprire il rubinetto, raccogliere la fase organica nella parte inferiore, chiudere il rubinetto e trasferire nuovamente la fase organica nelimbuto. Aggiungere 15 millilitri di una soluzione satura di bicarbonato di sodio alla miscela. Agitare ilimbuto separatore e lasciare separare le due fasi.

Dopo aver asciugato lo strato organico con solfato di sodio, filtrarlo attraverso cotone in un pallone a fondo rotondo a due colli. Quindi evaporare lo strato organico a secco sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Pesare il pallone ed ottenere 600 milligrammi di olio, che è una miscela di due composti: piridil undecinil carbonato e undecinolo due ossipiridina carbossilato, in un rapporto di uno virgola sette a uno.

In un pallone da 10 millilitri a fondo rotondo, sciogliere 60 milligrammi di ossiacetilene ammonio acetato in due millilitri di diclorometano anidro. Raffreddare la soluzione a zero gradi Celsius in un bagno di ghiaccio, quindi aggiungere 81 microlitri di diazaproprilammina in modo goccia a goccia. Successivamente, sciogliere 350 milligrammi della miscela grezza contenente undecinolo due carbossilato di ossipiridina in due millilitri di diclorometano anidro.

Aggiungere la miscela disciolta alla soluzione e mescolare a temperatura ambiente per 15 ore. Successivamente, evaporare il solvente a secco sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Purificare il composto mediante cromatografia su colonna a gel di silice usando un apparato automatizzato per cromatografia su colonna.

Prima assorbire il campione su gel di silice. Dopo aver equilibrato la colonna con cicloesene, caricare il campione nella cartuccia. Eluire il campione con acetato di etile in cicloesano dallo 0 al 100, raccogliendo i picchi in provette.

Evaporare il solvente delle frazioni corrispondenti al composto fino a completa essiccazione sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante, ottenendo 40 milligrammi di un solido bianco. Dopo aver pre-pulito il campione come descritto nel protocollo testuale, aggiungere 11,3 microlitri di una soluzione madre di azide polietilenglicole biotina 5 millimolare e vortexare. Quindi aggiungere 11,3 microlitri di una soluzione madre di TCEP 50 millimolare appena preparata al campione e vortexare.

Dopo aver premiscelato 34 microlitri di una soluzione lavorativa appena preparata di TBTA 1,7 millimolare con 11,3 microlitri di una soluzione madre di solfato di rame 50 millimolare, aggiungere 45,3 millilitri di questa soluzione al campione e omogeneizzare con il vortex. Utilizzare contenitori etichettati. Incubare la reazione a 25 gradi Celsius per almeno due ore.

Dopo un'incubazione di un'ora, osservare la precipitazione delle proteine e mescolare la reazione. Centrifugare il campione per quattro minuti a 6.500 ×g a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere 750 microlitri di metanolo freddo e risospendere il pellet mediante sonificazione con un sonicator a sonda per cinque secondi.

Quindi centrifugare il campione per quattro minuti a 6.500 ×g a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante con una siringa e un ago. Dopo aver lavato altre due volte con metanolo freddo, aggiungere 325 microlitri di SDS al 2,5% in PBS al pellet proteico.

Sonicare il campione tre volte per cinque secondi. Successivamente, riscaldare il campione per cinque minuti a 65 gradi Celsius. Dopo la sonica, centrifugare il campione per cinque minuti a 6.500 ×g a temperatura ambiente.

Quindi trasferire il soprannatante in un tubo pulito da 15 millilitri e aggiungere 1,4 millilitri di PBS al soprannatante per diluire la concentrazione di SDS allo 0,5 percento. Per l'arricchimento con streptavidina, portare prima il volume del campione a 4,2 millilitri con PBS. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di una sospensione al 50% di agarosio con streptavidina prerisciacquato, utilizzando una punta con estremità tagliata.

Incubare la miscela per due ore a temperatura ambiente con rotazione. Dopo aver centrifugato per due minuti a 1.400 × g, rimuovere il soprannatante senza far seccare il pellet di perle. Utilizzare il soprannatante residuo per trasferire le perle in una colonna spin da un millilitro e lavare la colonna per gravità con un millilitro di SDS all'1% in PBS.

Continuare a lavare le perle con urea a sei moli seguita da PBS come descritto nel protocollo testuale. Quindi utilizzare 500 microlitri di PBS per trasferire le perle lavate in un tubo da un punto cinque millilitri. Dopo aver centrifugato il campione per due minuti a 1.400 volte G, aspirare delicatamente il soprannatante con una siringa e un ago.

Per eluire le proteine legate alla resina, aggiungere 25 microlitri di buffer di eluizione al pellet di resina e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, seguiti da 15 minuti a 95 gradi Celsius. Aggiungere circa 400 microlitri di mix per click chimica alle fette di tessuto che sono state preparate secondo il protocollo descritto nel testo. Prestare attenzione affinché il volume scelto di mix per click chimica sia sufficiente a coprire le fette.

Quindi incubare le sezioni di tessuto per un'ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, lavare i campioni con PBS per cinque minuti e successivamente con metanolo freddo per cinque minuti. Successivamente, lavare le sezioni di tessuto tre volte con una soluzione di un percento di Tween 20 e zero virgola cinque millimoli di EDTA in PBS per due minuti.

Infine, lavare le sezioni un'ultima volta con PBS per cinque minuti. Dopo l'essiccazione a temperatura ambiente, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio antifade con DAPI. Chiudere i campioni con coprioggetti e sigillare con vernice.

Per la sintesi della sonda, l'undecinenolo viene attivato dal carbonato di dipiridile in presenza di una quantità catalitica di 4-dimetilammino piridina per produrre un carbonato misto, che successivamente reagisce con il lattame aminilico. Il beta-lattame, ovvero la parte terminale della sonda, reagisce con il sito attivo di NAAA, mentre l'alkine terminale può essere funzionalizzato con un marcatore reporter mediante chimica click. ARN 14 sei otto sei è stato utilizzato per rilevare l'attivazione di NAAA in estratti proteici di zampe infiammate di ratto mediante blocco proteico. In ratti naïve, nessun segnale di NAAA viene rilevato.

Al contrario, nei ratti trattati con adiuvante completo di Freund si osserva una marcata banda corrispondente a NAAA attiva. Un'altra applicazione di ARN 14 six eight six è l'analisi tissutale mediante microscopia a fluorescenza. Qui le cellule rosse rappresentano macrofagi alveolari positivi per NAAA attiva.

NAAA è localizzata in strutture vescicolari diffuse, come osservabile a un ingrandimento maggiore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare e utilizzare ARN 14 six eight six per rilevare NAAA attiva nei tessuti, sia mediante analisi proteica su blot che mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, anche se questo protocollo è specifico per il nostro bersaglio, le applicazioni della sonda che descriviamo potrebbero essere facilmente adattate ad altre sonde basate sull'attività, specifiche per bersagli diversi da NAAA.