Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse
17 novembre 2016
Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.
L'obiettivo generale di questa procedura è creare un modello murino riproducibile, sostenibile e persistente di deficit di cellule staminali limbari. Questa semplice tecnica fornisce un modello animale coerente di carenza di cellule staminali limbari, senza indurre lesioni indesiderate all'occhio, che è difficile da ottenere con i modelli standard di lesioni chimiche. Questo modello è utile per studiare il processo patologico a lungo termine a livello cellulare e molecolare.
E per testare o confrontare l'efficacia di nuovi trattamenti. Dopo aver anestetizzato il topo, pizzicare la punta del piede per garantire un'adeguata profondità di anestesia. Ispezionare l'occhio sotto una lampada a fessura per verificare l'assenza di precedenti lesioni corneali.
Instillare una goccia di tetracaina cloridrato all'1% sull'occhio e attendere 60 secondi. Successivamente, applicare delicatamente il 5% di iodio povidone sull'occhio e sui capelli circostanti. Dopo un minuto, strofinare la goccia o stenderla sui capelli intorno all'occhio per evitare che i capelli interferiscano con la punta dello strumento.
Preparare una fresa rotante sterile e un paio di pinzette piegate sterili e tenerle su un foglio sterile durante la procedura. Ora, stabilizza l'occhio afferrando le palpebre dal lato nasale usando le pinzette piegate e proctoreggiando delicatamente l'occhio. Fare attenzione a non esercitare troppa pressione.
Sotto un microscopio operatorio, radersi due volte intorno all'area limbare utilizzando la fresa rotante sterile. Rimuovere l'intero epitelio corneale dal limbus al limbus con la fresa rotante in modo circolare e lavorare con il lato laterale della sua punta. Per evitare lesioni allo stroma, non spazzolare nuovamente le parti corneali da cui è stato rimosso l'epitelio.
Non esercitare alcuna pressione sull'occhio. Pulire la punta del pennello secondo necessità. Applicare una goccia di PBS sterile sulla cornea e rimuovere eventuali fogli epiteliali staccati con un panno morbido per la pulizia.
Quindi, radere l'epitelio rimanente, se presente. Prestare attenzione alla coda del topo per garantire un'adeguata profondità di anestesia durante l'intervento chirurgico. Applicare una goccia di fluoresceina sodica sulla cornea.
Pulire la cornea dopo 30 secondi ed esaminarla al microscopio con un filtro blu cobalto per verificare la completa rimozione dell'epitelio. Dopo la procedura, posizionare l'animale nella sua gabbia su una coperta riscaldante e osservarlo per 30-45 minuti fino al completo recupero dall'anestesia. Nel frattempo, applicare l'unguento oftalmico all'1% di eritromicina sull'occhio e continuare l'applicazione dell'antibiotico ogni giorno per una settimana.
Inoltre, iniettare 0,1 mg/kg di Buprenorfina per via sottocutanea immediatamente e 12 ore dopo la procedura e continuare l'iniezione due volte al giorno per due giorni. Questo è il fenotipo della cornea un mese dopo la procedura. Si può vedere un'estesa neovascolarizzazione che è una caratteristica del deficit di cellule staminali limbari.
Una cornea normale esprime citocheratina 12 ma è priva di citocheratina 8 o cellule caliciformi. Nel deficit di cellule staminali limbari, la citocheratina 8 e le cellule caliciformi compaiono sulla cornea, mentre la citocheratina 12 viene persa. Una volta padroneggiata, questa tecnica si tradurrà in una neovascolarizzazione corneale che coprirà quasi l'intera superficie corneale del topo in un mese ed è stabile fino a tre mesi.
È importante evitare di spazzolare nuovamente le parti corneali che l'epitelio è già stato rimosso. Ciò può causare infiammazione e opacizzazione indesiderata dello stroma. A seguito dello sviluppo del deficit di cellule staminali limbari, i metodi di trattamento sperimentali possono essere testati e confrontati.
In alternativa, i trattamenti possono essere iniziati poco dopo l'infortunio. Questo video ha mostrato come rimuovere efficacemente l'epitelio limbare e corneale per indurre la carenza di cellule staminali limbari nel topo. Con alcune modifiche, può essere eseguito anche su altri animali.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica riproducibile per creare un modello murino sostenibile di carenza delle cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello è essenziale per lo studio del processo patologico e per la sperimentazione di nuovi trattamenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Oftalmologia
Sfondo
- La carenza di cellule staminali limbali compromette la salute della cornea e la visione.
- I modelli attuali spesso inducono danni indesiderati, complicando la ricerca.
- È necessario un modello sostenibile per studi a lungo termine.
- Questa tecnica mira a colmare questa lacuna.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello murino consistente di LSCD.
- Facilitare lo studio dei processi cellulari e molecolari della malattia.
- Valutare l'efficacia di potenziali trattamenti.
Metodi Utilizzati
- Viene somministrato l'anestetico al topo.
- L'occhio viene ispezionato con una lampada a fessura per verificare la presenza di lesioni pregresse.
- Viene impiegata una tecnica specifica per indurre la DCSL senza provocare danni aggiuntivi.
- Viene effettuato un monitoraggio a lungo termine del modello.
Risultati principali
- Il modello imita con successo la DSCC senza provocare danni indesiderati all'occhio.
- Permette studi cellulari e molecolari a lungo termine.
- Trattamenti innovativi possono essere testati efficacemente utilizzando questo modello.
- I risultati indicano un metodo affidabile per le ricerche future.
Conclusioni
- Questa tecnica fornisce uno strumento prezioso per la ricerca sulla DSCC.
- Migliora la comprensione delle malattie delle cellule staminali limbali.
- Studi futuri potranno basarsi su questo modello per migliorare le opzioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La creazione di un modello murino riproducibile di carenza delle cellule staminali limbali (LSCD) risponde a un'esigenza fondamentale di sistemi pertinenti alla malattia nella scoperta di farmaci oftalmici. Questo modello consente una riduzione del rischio meccanicistica e una maggiore affidabilità predittiva nella valutazione preclinica di terapie rigenerative e anti-infiammatorie rivolte ai disturbi corneali. Il suo fenotipo persistente e l'allineamento traslazionale supportano un solido avanzamento della pipeline e la comparabilità tra diversi programmi di ricerca.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della funzione delle cellule staminali limbali e delle vie di rigenerazione corneale.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo un modello di malattia coerente e controllato da lesione.
- Facilita la validazione funzionale di bersagli terapeutici candidati per il trattamento della LSCD.
- Migliora l'affidabilità predittiva della rilevanza traslazionale nella ricerca sulle malattie della superficie oculare.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma in vivo validata per la valutazione quantitativa dell'efficacia terapeutica.
- Consente una valutazione standardizzata di parametri cellulari e molecolari, come l'espressione della citocheratina e la neoangiogenesi.
- Permette lo screening riproducibile e scalabile di nuovi composti o prodotti biologici per la riparazione della cornea.
- Facilita il confronto affidabile di diverse modalità terapeutiche in un contesto controllato.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla patologia umana della carenza delle cellule staminali della cornea (LSCD), favorendo lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Consente un approccio continuo dalla scoperta alla validazione preclinica di strategie rigenerative.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio per terapie oculari mirate alla carenza di cellule staminali.
- Fornisce informazioni meccanicistiche sui processi di progressione della malattia e di risposta terapeutica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello di LSCD si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica delle ipotesi, l'identificazione di composti promettenti e la validazione traslazionale di terapie per la superficie oculare.
- Biologia della scoperta: Supporta l'indagine basata su ipotesi sulla perdita delle cellule staminali limbali e sui meccanismi di riparazione della cornea.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per la valutazione dell'efficacia e della sicurezza di interventi in fase di studio.
- Analisi: Consente la misurazione di marcatori molecolari (ad esempio, profili di citocheratina) e della neovascolarizzazione per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati preclinici alla rilevanza clinica modellando fenotipi di DCSL sostenuti.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e adattabile per la valutazione trasversale di terapie oculari in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nello sviluppo di farmaci oftalmici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità degli studi preclinici sulla LSCD.
- Valore strategico: Perfeziona il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale per i portafogli oftalmici.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione mirata, corretta per il rischio, di candidati rigenerativi e anti-infiammatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in chirurgia oculistica su piccoli animali e nella gestione post-procedurale.
- Necessita dell'accesso a microscopi chirurgici, frese motorizzate e strumenti analitici molecolari.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di induzione del danno e di valutazione fenotipica.
- Adattabile ad altri modelli di piccoli animali mediante modifiche procedurali.
- Una tecnica accurata è essenziale per evitare lesioni stromali e garantire la coerenza del modello.
