Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare i cambiamenti nella composizione lipidica dei neutrofili durante il rilascio di trappole extracellulari dei neutrofili utilizzando la cromatografia su strato sottile e l'HPLC. Questo metodo può essere utilizzato per ottenere informazioni più dettagliate sui meccanismi coinvolti nella formazione di trappole extracellulari di neutrofili, o in breve nome, formazione di NET. Il vantaggio principale di questa procedura è che fornisce informazioni sul ruolo dei lipidi nella funzione generale dei neutrofili utilizzando un protocollo facile da seguire.

L'isolamento di cellule derivate dal sangue umano sarà dimostrato da un'ex dottoranda del nostro laboratorio, Ariane Neumann. E sarà assistita da Friederike Reuner. La preparazione delle cellule per l'analisi dei lipidi sarà dimostrata da Graham Brogden, un post-doc nel mio laboratorio, e Diab Husein, uno studente di master nel programma di biochimica.

Per isolare i neutrofili derivati dal sangue umano, stendere circa 20 mL di sangue su 20 mL di soluzione di diatrizoato di sodio/destrano vicino a una fiamma, senza mescolare. Centrifugare per 30 minuti a 470 volte g senza frenare. È fondamentale non mescolare la fase ematica con il grado di densità in soluzione.

Dopo la fase di centrifugazione, le cellule mononucleate devono essere rimosse con cura per evitare la contaminazione o l'attivazione non specifica delle cellule. Rimuovere le cellule mononucleate e lo strato di plasma giallastro. Trasferire la cella polimorfonucleata, o fase PMN, in una nuova provetta da 50 mL e riempirla fino a 50 mL con soluzione salina tamponata con fosfato 1X.

Centrifugare il campione per 10 minuti a 470 volte g con frenata. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di acqua sterile per cinque secondi per lisare gli eritrociti. Riempire immediatamente la provetta fino a 50 mL con 1X PBS e centrifugare il campione.

Dopo aver rimosso il surnatante, il pellet deve essere bianco. Se è ancora rosso, ripeti questi passaggi. Quindi risospendere il pellet in 1000 microlitri di Roswell Park Memorial Institute, o mezzo RPMI.

Contare il numero di cellule utilizzando la colorazione con Trypan Blue e un emocitometro al microscopio ottico. Preparare una sospensione cellulare in RPMI a una concentrazione di due milioni di cellule per mL. Circa 25 milioni di neutrofili possono essere raccolti da 20 ml di sangue.

Per trattare farmacologicamente i neutrofili per l'analisi dei lipidi utilizzare 15 milioni di cellule preparate. Incubare i campioni nelle provette di reazione per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo la centrifugazione dei campioni, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 300 microlitri di HBSS.

Dopo aver centrifugato nuovamente il campione utilizzando gli stessi parametri, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di una soluzione 1:1 di cloroformio:metanolo. Quindi omogeneizzare il pellet risospeso con una cannula da 26 gauge spingendo il campione dentro e fuori da una siringa da 1 ml 10 volte. Per isolare i lipidi dai neutrofili derivati dal sangue periferico umano, prendere i neutrofili preparati e metterli sul ghiaccio.

Pipettare i neutrofili in una provetta di vetro da 15 ml con tappo a vite e guarnizione in PTFE e omogeneizzarli agitandoli per un minuto. Quindi aggiungere 2 mL di metanolo seguiti un minuto dopo da 1 mL di cloroformio. Dopo aver agitato per un altro minuto, ruotare i tubi di vetro a temperatura ambiente e 50 giri/min per 30 minuti.

Successivamente, pellettare la frazione proteica centrifugando la soluzione a 7 gradi Celsius e 1.952 volte g per 10 minuti. Decantare con cura il surnatante in una nuova provetta di vetro da 15 ml con tappo a vite, lasciando il pellet contenente proteine. Conservare il pellet a 20 gradi Celsius per una futura quantificazione.

Aggiungere 1 mL di cloroformio e attendere un minuto. Quindi, aggiungere 1 mL di acqua distillata doppia e capovolgere la provetta di vetro con tappo a vite con il campione per 30 secondi. Dopo aver centrifugato il campione come prima, rimuovere e scartare la fase superiore fino allo strato torbido, ma escluso.

Essiccare i campioni in un concentratore sottovuoto a 60 gradi Celsius e conservarli a 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per iniziare, riempire fino a 5 ml di ciascuna soluzione nella camera di vetro corrispondente. Aggiungere qualsiasi tipo di carta da filtro per aumentare la velocità di funzionamento in ogni camera.

Pre-incubare una lastra di vetro HPTLC gel di silice 60 da 20x10 cm nella prima soluzione di corsa. Una volta che la soluzione di scorrimento raggiunge la parte superiore del piatto, asciugalo per 10 minuti a 110 gradi Celsius. Sciogliere il pellet lipidico, precedentemente ottenuto dopo essiccazione con un concentratore sottovuoto, nel volume desiderato di soluzione di cloroformio:metanolo 1:1, e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius per scioglierlo.

Quindi, utilizzare un righello e una matita morbida per contrassegnare i punti di caricamento per il numero desiderato di campioni più almeno uno standard. Segnare la distanza percorsa a circa 4 cm per la prima soluzione di corsa e a circa 6 cm per la seconda soluzione di corsa. Per caricare i campioni, lavare tre volte la siringa da 10 microlitri in cloroformio:metanolo 1:1 prima di caricare ogni nuovo campione.

Caricare 10 microlitri di ogni campione a goccia cercando di concentrare il campione su un'area il più piccola possibile. Posizionare la piastra verticalmente nella prima camera con la soluzione in esecuzione uno. Assicurarsi che la piastra sia parallela alla parete della camera di vetro per ottenere una velocità di migrazione uniforme.

Fare attenzione che le piastre siano posizionate parallelamente alla parete posteriore delle camere di vetro e che i frontali del solvente non corrano troppo lontano per garantire che i lipidi siano separati in modo efficiente. Una volta che la linea del solvente ha raggiunto il primo segno, rimuovere la piastra, asciugarla e posizionarla nella seconda soluzione. Ripetere passaggi simili per la seconda e la terza soluzione in esecuzione.

Lasciare la piastra nella soluzione fino a quando il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra. Quindi, rimuovere il piatto e asciugarlo a temperatura ambiente per un minuto. Mettere la piastra nella soluzione di solfato di rame per sette secondi.

Dopo aver asciugato bene la piastra, cuocetela in forno per sette minuti a 170 gradi centigradi. Togliete la piastra dal forno e lasciatela raffreddare. Per eseguire l'HPLC, collegare la colonna a una cartuccia di protezione sullo strumento e riscaldarla a 32 gradi Celsius.

Utilizzare il metanolo come fase mobile a una velocità di flusso di 1 mL al minuto e 65 bar. Impostare il rilevatore UV in modo che misuri a 202 nanometri per quantificare la quantità di colesterolo in ciascun campione. Lavare accuratamente la macchina HPLC prima di analizzare i campioni e stabilire una curva standard del colesterolo come descritto nel protocollo di testo.

Infine, risospendere i campioni in 500 microlitri di cloroformio:metanolo 1:1 in flaconi di vetro da 1,5 mL di colore ambrato con tappo a vite in PTFE rosso/silicone bianco prima di caricarli sullo strumento HPLC. Qui è mostrato il profilo lipidico dei neutrofili su una piastra HPTLC. I lipidi possono essere identificati confrontando le distanze di migrazione con lo standard.

Viene mostrato anche un cromatogramma HPLC che mostra due grandi picchi. Il primo picco poco prima dei due minuti è il cloroformio. Il secondo grande picco a cinque minuti è il colesterolo.

Di seguito sono riportate le curve standard del colesterolo determinate dall'HPLC e dall'HPTLC. La curva standard ottenuta mediante HPLC è lineare su un intervallo di concentrazione più ampio rispetto alla curva standard HPTLC. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare i neutrofili derivati dal sangue umano e successivamente analizzare la loro composizione lipidica.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di indossare guanti in nitrile per proteggere le mani dall'esposizione pericolosa al cloroformio: metanolo e anche di lavorare sotto una cappa aspirante. Esperimenti futuri forniranno ulteriori informazioni sui meccanismi coinvolti nella formazione di NET e sulle funzioni generali dei neutrofili che non sono ancora completamente comprese. Non dimenticare che lavorare con cellule primarie derivate dal sangue umano richiede un'autorizzazione etica e adeguate precauzioni di sicurezza, come lavorare in un rispettivo laboratorio di biosicurezza per evitare l'esposizione al rischio di agenti patogeni umani.

Infine, lo scopo del nostro studio è quello di trovare nuovi bersagli terapeutici contro un'infezione basata sul sistema immunitario innato, e soprattutto la composizione lipidica è molto interessante per noi poiché ci aiuterà a capire perché il neutrofilo agisce come antimicrobico contro un'infezione.