Name: Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri come studiare l'associazione delle proteine HMGB1 ai danni DNA specifici mediante immunoprecipitazione della cromatina modificata e saggi di superavvolgimento del DNA in cellule umane. Questo metodo facilita l'identificazione di nuovi target farmacologici per la terapia del cancro.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Vasquez per le discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 per KMV]; e la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas [RP101501]. Il finanziamento per la carica di accesso aperto: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 per KMV].

1. Preparazione di ICL TFO-dirette sui plasmidi Substrati <ol><li> Incubare quantità equimolari di plasmide pSupFG1 10,11 DNA (DNA plasmide 5 mg è un buon punto di partenza) con psoraleni coniugato TFO AG30 in 8 ml di triplex tampone di legame [50% glicerolo, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] e dH 2 O ad un volume finale di 40 microlitri in un tubo ambra. Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare la reazione a 37 ° C bagnomaria per 12 ore. </li><li> Riscaldare la lampada UVA per garantire la piena potenza. Posizionare la reazione triplex su pellicola di paraffina, e posizionare il film di paraffina sul ghiaccio sotto la (nm 365) lampada UVA. Collocare un filtro Mylar tra la lampada e la reazione. </li><li> UVA irradiare per una dose totale di 1,8 J / cm 2. Conservare i campioni a 4 ° C per un ulteriore uso. Attenzione: Indossare occhiali protettivi corretta e abbigliamento con UVA irradiazione. </li><li> Linearizzare 200 ng del plasmide sopra preparato con il restriction enzima Eco R1 in un volume totale di 20 microlitri con il produttore fornito 10x tampone. Calore denaturare l&#39;enzima per 20 minuti a 65 ° C. Spin i campioni per 10 minuti a 10.000 xg e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 50x tampone alcalino [1,5 M di NaOH, 50 mM etilendiamminotetraacetico acido (EDTA)]. Aggiungere 0,5 mg di agarosio a 50 ml dH 2 O. Far bollire per sciogliere l&#39;agarosio e metterlo in un bagno d&#39;acqua a 50 ° C. </li><li> Dopo che la temperatura del agarosio disciolto è fino a 50 ° C, aggiungere 1 ml di tampone 50x alcalina, mescolare e poi versare il gel nel vassoio gel. Attendere che il gel di solidificare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere 4 ml di 0,5 M EDTA ai 20 ml di campione di DNA linearizzato e incubare per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 6x tampone di gel loading alcalina (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w / v) ad alto peso molecolare polisaccaride, 0,06% verde di bromocresolo in dH 2 O) per campioni e ad una scaletta DNA 1 kb. NOTA: E &#39;importante utilizzare 6x tampone di caricamento del gel alcalino, si prega di consultare la discussione. </li><li> Caricare i campioni sul gel nella stanza fredda e correre durante la notte in un tampone alcalina 1x (12-16 ore) a 3,2 volt per cm. Una volta che i campioni sono entrati nel gel, posizionare una lastra di vetro sulla superficie del gel per evitare che galleggianti. </li><li> Neutralizzare i campioni immergendo il gel in tampone di neutralizzazione [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M acetato di sodio (pH 5,2)] per 45 min a temperatura ambiente. </li><li> Macchia il gel per il DNA con 4 ml di 1% etidio bromuro (EtBr) in 50 ml di acqua per 1 ora a temperatura ambiente. Decolorare con acqua per 15 minuti. Visualizzare il DNA utilizzando un sistema di imaging. Attenzione: EtBr è un agente mutageno potente e può essere assorbito attraverso la pelle. Evitare il contatto diretto con EtBr. </li></ol> 2. Trasfezione e immunoprecipitazione di TFO diretti da plasmidi ICL contenenti in cellule umane <ol><li> Piastra 400.000 cellule di mammifero (ad esempio, U2OS Ocellule steosarcoma) per piatto di 60 millimetri in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) senza antibiotici 24 ore prima della trasfezione. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Prima di trasfezione, mezzi di crescita caldo e tampone fosfato isotonico (PBS) a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. </li><li> Incubare 30 ml di reagente di trasfezione con 500 ml di terreni di crescita 1x (Mix 1) e 2 mg di TFO-diretti ICL contenenti plasmidi in 500 ml di 1x terreni di crescita (mix 2) in separati 14 ml provette con fondo arrotondato per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere mix 1 a mescolare 2, mescolare bene pipettando su e giù. Incubare per 25-30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS caldo. Aggiungere la miscela trasfezione in modo goccia a goccia distribuendo uniformemente tutta la piastra di cellule. Aggiungere 1 ml di terreni di crescita alla piastra e portare il volume finale a 2 ml. mescolare noill. Posizionare le piastre di coltura nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 4 ore. </li><li> Sostituire il supporto con i media da 3 ml crescita supplementato con 10% FBS e incubare ulteriormente per 16 ore. Non usare antibiotici. </li><li> Trattare cellule con 80 ml di 37% di formaldeide fresco per piastra ad una concentrazione finale di circa 1% e incubare per 10 min a temperatura ambiente in assenza di luce. Attenzione: La formaldeide è tossica e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza. esposizione alla formaldeide può causare danni alla pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. </li><li> Quench formaldeide reticolazione aggiungendo 300 ml di glicina refrigerati (fornito nel kit disponibili in commercio) per piastra e incubando per 5 min. Rimuovere il supporto e lavare due volte con PBS freddo, e poi raccogliere le cellule raschiando in 1 ml freddo (4 ° C) PBS in una provetta. Mantenere i campioni in ghiaccio in ogni momento. </li><li> Preparare pellet cellulari mediante centrifugazione a 4 ° C per 5 min at 13.400 xg con un tavolo refrigerata centrifuga. Pipettare il supernatante e posizionare il pellet di cellule in ghiaccio. </li><li> Omogeneamente risospendere il pellet in 1 ml freddo (4 ° C) tampone A (in dotazione nel kit disponibili in commercio) e incubare in ghiaccio per 10 min. Mescolare di tanto in tanto invertendo il tubo. Cellule pellet come prima (vedi al punto 2.9). </li><li> Omogeneamente risospendere il sedimento in 1 ml di freddo (C 4 °) Buffer B (in dotazione nel kit disponibili in commercio) e incubare in ghiaccio per 10 minuti con miscelazione occasionale invertendo. Cellule pellet per centrifugazione come prima (vedi sopra punto 2.9). </li><li> Risospendere nuovamente le cellule in 200 microlitri refrigerati tampone B. Aggiungere 2 ml di micrococcica nucleasi (MNase) ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. Mescolare di tanto in tanto la reazione muovendo il tubo. Arrestare la reazione MNase ponendo la provetta in ghiaccio e aggiunta di 40 mM EDTA. Cellule pellet come prima (vedi al punto 2.9). </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri 1x immunopr cromatinaecipitation tampone (chip) di buffer (in dotazione nel kit disponibili in commercio) integrato con cocktail inibitore della proteasi. </li><li> Mettere le cellule risospese in una provetta per microcentrifuga a parete sottile. Sonicare i campioni da loro galleggia sull&#39;acqua bagno sonicatore per 20 secondi seguita da 20 sec incubazione in ghiaccio. Ripetere i passaggi da sonicazione 9 volte per generare ~ 800-1.200 frammenti bp. <ol><li> A 20 ml di campioni sonicati aggiungere 3 ml 5 M NaCl e 1 ml RNasi A. Mescolare bene nel vortex e incubare a 37 ° C per 30 min. Successivamente, aggiungere 2 ml proteinasi K e incubare per 2 ore a 65 ° C. Purificare i campioni utilizzando un kit di purificazione PCR. Esegui campioni su 1% gel e visualizzare con EtBr. NOTA: Intensità massima del DNA risultante dovrebbe essere pari o inferiore a 1.000 bp. </li></ol></li><li> In tre tubi separati, aggiungere 30 ml di lisato in un tubo siliconato pre-raffreddata e quindi aggiungere 70 ml di tampone ChIP refrigerata 1x con inibitori della proteasi aggiunto. Aggiungere 1 μg di anti-immunoglobulina G (IgG), H3 anti-istone (come controllo positivo), o anti-HMGB1 alle rispettive provette. Incubare per una notte in una camera fredda con rotazione continua. </li><li> perline risospendere proteina G in modo omogeneo nella cella frigorifera. Aggiungere 4 ml di proteine ​​G perline per provetta e incubare per un altro 2-4 ore in cella con rotazione. </li><li> Utilizzando un sostegno magnetico, agglomerare le perline e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 microlitri 1x tampone ChIP mescolato con cocktail di inibitori delle proteasi al pellet e lavare per 5 min in cella con rotazione. Ripetere il lavaggio due volte. </li><li> Eseguire un lavaggio supplementare con sale alta 1x chip di buffer (contenente 70 mM NaCl). </li><li> Risospendere il pellet con tampone di eluizione 160 microlitri (fornita in kit disponibili in commercio) e incubare a 37 ° C con rotazione per 30 min. </li><li> Agglomerare le perline e raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 6 ml di 5 M NaCl e 2 ml di proteinasi K, e incubare una notte a 65° C. </li><li> Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione prodotto di PCR ed eluire il DNA utilizzando 50 ml dH 2 O. </li><li> Eseguire la PCR 16 reazioni utilizzando set di primer alla regione (s) di interesse, e risolvere i prodotti su un gel di agarosio 1% colorato con EtBr. </li></ol> 3. superavvolgimento Assay e 2-dimensionale in Gel di Agarosio <ol><li> Preparare DNA tampone di sintesi di riparazione (45 mm Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mm KCl; 7,4 mm MgCl 2; 0,9 mm DTT; 0,4 mm EDTA; 2 mM ATP, 20 mM dNTP, 3,4% glicerolo e 18 mg albumina sierica bovina) . Conservare a -80 ° C. Scongelare su ghiaccio e prima dell&#39;uso aggiungere 40 mM fosfocreatina e 2,5 microgrammi creatinfosfochinasi. </li><li> Preparare 10x tampone superavvolgimento [500 mm Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl 2, 1 mM EDTA], e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Linearizzare 300 ng di DNA pSupFG1 plasmide supercoiled completamente con 1 ml Vaccinia topoisomerasi I (5-15 U / ml) con 1xtampone superavvolgimento in una reazione 10 ml. Incubare la miscela a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Scongelare HeLa cell-free estratto 24 sul ghiaccio. Per i plasmidi completamente rilassato, aggiungere 25 ml estratto cellulare HeLa e buffer di sintesi di riparazione del DNA. Mescolare bene. Aggiungere ulteriori 1 ml di vaccinico topoisomerasi I del mix, e incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Terminate le reazioni aggiungendo sodio dodecil solfato (SDS) (1% concentrazione finale) e proteinasi K (0,25 mg / ml concentrazione finale). Incubare a 65 ° C per 2 ore. </li><li> Cast un gel di agarosio 1% con 1x Tris Borato EDTA (TBE) buffer. Aggiungere DNA colorante carico e caricare le reazioni direttamente sul gel almeno 4 corsie a parte. Eseguire il gel per 8-10 ore a 2 V / cm a 1x TBE (dimensione 1) a temperatura ambiente per risolvere i topoisomero. NOTA: Preparare una soluzione madre 5x TBE in 1 L di dH 2 O con l&#39;aggiunta di 54 g di Tris base. 27,5 g di acido borico e 20 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Preparare 2 L di 1xTBE con 3 mg / ml clorochina fosfato. Immergere il gel in 200 ml di questa soluzione per 20 min. Coprire il vassoio gel con un foglio di alluminio. </li><li> Per elettroforesi il gel nella seconda dimensione, ruotare il gel 90 ° in senso orario ed eseguirlo per 4-6 ore a 2 V / cm in clorochina contenente 1x TBE per risolvere i supercoils positivi e negativi. </li><li> Macchia gel con EtBr per 1 ora su una sedia a dondolo. Decolorare il gel con dH 2 O per 15 minuti e successivamente visualizzare la distribuzione termica dei topoisomero usando un imager. </li></ol>

<ol><li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li>
<li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li>
<li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li>
<li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li>
<li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage%2C+DNA+repair%2C+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li>
<li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li>
<li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li>
<li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li>
<li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li>
<li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li>
<li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li>
<li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li>
<li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li>
<li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA%3A+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li>
<li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li>
<li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li>
<li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li>
<li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein%2FTATA+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li>
<li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V%28D%29J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li>
<li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li>
<li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li>
<li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li>
<li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li>
<li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li>
<li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li>
<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

La formazione efficiente ICLs TFO-diretti dipende da due fattori fondamentali: in primo luogo, i componenti corretta tampone (per esempio, MgCl 2) e il tempo di incubazione del TFO con il suo substrato DNA bersaglio (dipende l&#39;affinità di legame del TFO al suo obiettivo duplex, e le concentrazioni utilizzate); e in secondo luogo, la corretta dose di UVA (365 nm) irradiazione per formare legami crociati psoraleni efficiente. formazione triplex ottimale può essere ottenuto utilizzando HPLC o gel TF...

Triplex di formazione oligonucleotidi (TFOS) DNA legano duplex in modo specifico per la sequenza tramite incollaggio Hoogsteen-idrogeno per formare strutture a tripla elica 1-5. La tecnologia Triplex è stata usata per interrogare una varietà di meccanismi biomolecolari, come la trascrizione, il DNA riparazione dei danni, e gene targeting (rivisto in riferimenti 6-8). TFOS sono stati ampiamente utilizzati per indurre un danno site-specific su plasmidi reporter 9,10. Il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato in precedenza un TFO, AG30, legato ad una molecola psoraleni per indurre site-specific legami crociati interstrand DNA (ICL) nel gene supF sul plasmide pSupFG1 5,10-12. ICL sono altamente citotossico come queste lesioni reticolazione covalente i due filamenti di DNA, e se non riparati, possono bloccare la trascrizione del gene e impedire il meccanismo di replicazione del DNA 13,14. A causa della loro potenziale citotossico, agenti ICL-induttori sono stati utilizzati come farmaci chemioterapici nel trattamentodi cancro e altre malattie 15. Tuttavia, la trasformazione e la riparazione di ICL in cellule umane non è ben compreso. Così, una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nella trasformazione di ICLs in cellule umane può contribuire a migliorare l&#39;efficacia dei regimi chemioterapici ICL-base. ICL TFO-indotte e dei loro intermedi di riparazione hanno il potenziale di causare notevoli distorsioni strutturali per l&#39;elica del DNA. Tali distorsioni sono obiettivi probabili per le proteine di architettura, che si legano al DNA distorto con maggiore affinità rispetto a B-forma canonica duplex DNA 16-20. Qui, abbiamo studiato l&#39;associazione di una proteina architettonica altamente abbondanti, HMGB1 con ICL in cellule umane tramite immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) saggi su plasmidi psoraleni reticolato e identificato un ruolo per HMGB1 nel modulare la topologia del DNA plasmide psoralen-reticolato in umana lisati cellulari di cancro. HMGB1 è altamente abbondante e ubiquitariamente espresso non suatono proteina architettonica che si lega al DNA danneggiato e substrati di DNA in alternativa strutturati con affinità maggiore di B-forma canonica DNA 17-20. HMGB1 è coinvolta in numerosi processi metabolici del DNA, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA 16,21-23. Abbiamo precedentemente dimostrato che HMGB1 si lega al ICL TFO-diretti in vitro con alta affinità 20. Inoltre, abbiamo dimostrato che la mancanza di HMGB1 aumentato il trattamento mutageno di ICL TFO-diretti e HMGB1 identificato come una riparazione per escissione di nucleotidi (NER) co-fattore 23,24. Recentemente, abbiamo scoperto che HMGB1 è associata con ICL TFO-diretti nelle cellule umane e la sua assunzione di tali lesioni dipende dalla proteina NER, XPA 16. Superavvolgimento negativo del DNA ha dimostrato di promuovere la rimozione efficiente di lesioni del DNA da NER 25, e abbiamo scoperto che HMGB1 induce superavvolgimento negativo preferenzialmente su TFO-diretti plas ICL contenentisubstrati metà (relativi ai substrati non danneggiati plasmidi) 16, fornendo una migliore comprensione del ruolo potenziale (s) di HMGB1 come cofattore NER. Il trattamento dei ICLs non è pienamente compresa in cellule umane; in tal modo, le tecniche e le analisi sviluppate sulla base degli strumenti molecolari qui descritte potrebbe portare all&#39;identificazione di proteine ​​supplementari coinvolte nella riparazione ICL, che a loro volta possono servire come bersagli farmacologici che possono essere sfruttate per migliorare l&#39;efficacia dei regimi chemioterapici cancro. Qui, un approccio efficace per valutare l&#39;efficienza della formazione ICL TFO-diretto nel DNA plasmidico da denaturazione agarosio elettroforesi su gel è stato discusso. Inoltre, utilizzando i plasmidi contenenti le ICL TFO-diretti, le tecniche per determinare l&#39;associazione di HMGB1 con plasmidi ICL-danneggiati in un contesto cellulare utilizzando saggi ChIP modificati sono stati descritti. Inoltre, un metodo facile per studiare modifiche topologiche introdotte da the HMGB1 proteine ​​architettonico, in particolare su substrati plasmide ICL-danneggiati in lisati cellulari umane è stata determinata eseguendo saggi superavvolgimento tramite elettroforesi bidimensionale agarosio. Le tecniche descritte possono essere utilizzate per favorire la comprensione del coinvolgimento di riparazione del DNA e delle proteine ​​architetturali nel trattamento dei danni DNA mirate su plasmidi in cellule umane. Descriviamo protocolli dettagliati per la formazione di TFO-diretti ICLs psoraleni sito-specifici sul DNA plasmidico, e successiva ChIP plasmid e superavvolgimento saggi per identificare le proteine ​​che associano con le lesioni e proteine ​​che alterano la topologia DNA, rispettivamente. Questi test possono essere modificati per eseguire con altri agenti che danneggiano il DNA, TFOS, substrati plasmidi, e linee cellulari di mammiferi di interesse. Infatti, abbiamo dimostrato che non vi è almeno un potenziale unico e ad alta affinità sito TFO vincolante all&#39;interno di ogni gene annotata nel genoma umano 26. Comemai, per chiarezza, abbiamo descritto queste tecniche per l&#39;uso di un TFO specifica psoralen-coniugato (pAG30) su uno specifico plasmide mutazione giornalista (pSupFG1) in cellule umane U2OS abbiamo utilizzato in Mukherjee &amp; Vasquez 2016 16.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Ordine personalizzato</td><td>HPLC (o gel) purificato</td></tr><tr><td>Simple ChIP Kit IP per cromatina enzimatica</td><td>Segnalazione cellulare Inc.</td><td>9003</td><td>Il protocollo suggerito dal produttore è ottimizzato per l'IP della cromatina e non per l'IP del plasmide. Gli anticorpi IgG e H3 di controllo, nonché le perle di proteina G e la nucleasi micrococcica sono forniti dal produttore.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>HMGB1 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel e kit di pulizia PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>sale di clorochina-difosfato</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>Per elettroforesi bidimensionale su gel di agarosio</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione GenePORTER</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerasi I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Lampada ultravioletta a onde lunghe Blak-Ray</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>Lampada UVA</td></tr><tr><td>EpiSonic Bioprocessore multifunzionale 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Sonicatore a bagnomaria</td></tr><tr><td>Filtro Mylar</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td>80112939</tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ sistema</td><td>di imaging del DNA</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Utilizzato per la reticolazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Verde di bromocresolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>Colorante di caricamento del DNA</td></tr><tr><td>Provette siliconate</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Provetta per microfuge a bassa ritenzione</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific Fotometro</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>Misurazione della dose UVA</td></tr><tr><td><forte>Linee cellulari</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osteosarcoma umano U2OS</td><td>ATCC ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Coltivato secondo il fornitore La raccomandazione</td></tr><tr><td>dell'adenocarcinoma cervicale umano HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Coltivato secondo il fornitore' s raccomandazione Primer</td></tr><tr><td>anteriore prossimale</td><td>5&prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer inverso prossimale</td><td>5&prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer anteriore distale</td><td>5&prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer inverso distale</td><td>5&prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

strumenti per studiare il ruolo di architettura hmgb1 proteine ​​nella lavorazione di helix deformante, dna specifiche per sito interstrand crosslinks

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

casella di gruppo ad alta mobilità 1 proteine ​​(HMGB1) è una proteina di architettura non-istone che è coinvolto nella regolazione di molte funzioni importanti nel genoma, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA. HMGB1 si lega al DNA strutturalmente distorto con maggiore affinità rispetto alla canonica B-DNA. Ad esempio, abbiamo scoperto che HMGB1 si lega al DNA interstrand legami crociati (ICL), che collegano covalentemente i due filamenti del DNA, causa la distorsione dell&#39;elica, e se non riparati può causare la morte delle cellule. A causa della loro potenziale citotossico, diversi agenti ICL-inducono sono attualmente utilizzati come agenti chemioterapici in clinica. Mentre gli agenti ICL-formatura mostrano preferenze per alcune sequenze di base (ad esempio, 5&#39;-TA-3 &#39;è il sito di reticolazione preferito per psoraleni), che in gran parte inducono danni al DNA in modo indiscriminato. Tuttavia, covalentemente accoppiando l&#39;agente ICL induce ad un oligonucleotide triplex-formatura (TFO), che si lega al DNA in una sequenza specificamodo, il danno al DNA mirato può essere raggiunto. Qui, usiamo un TFO covalente coniugata sulla &#39;fine a una 4&#39;-idrossimetil-4,5&#39; la 5 (HMT) psoralen, 8-trimethylpsoralen per generare un ICL site-specific su un plasmide mutazione giornalista da utilizzare come strumento di per studiare la modifica architettonica, trasformazione e riparazione delle lesioni del DNA complessi HMGB1 in cellule umane. Descriviamo tecniche sperimentali per preparare ICL TFO-dirette sui plasmidi reporter, e di interrogare l&#39;associazione di HMGB1 con le ICL TFO-orientate in un contesto cellulare utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina. Inoltre, descriviamo saggi superavvolgimento DNA per valutare specifica modifica architettonica del DNA danneggiato misurando la quantità di giri superelica introdotte sul plasmide psoralen-reticolato da HMGB1. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare i ruoli di altre proteine ​​coinvolte nella trasformazione e riparazione di ICL TFO-dirette o altri danni al DNA mirato in qualsiasi linea cellulare di interesse.

Formazione del ICL TFO-diretta è critica per la metodica plasmidi basati, che vengono utilizzati per interrogare i ruoli delle proteine ​​architettoniche nella lavorazione ICL in cellule umane. Denaturazione agarosio elettroforesi su gel è un modo facile per determinare l&#39;efficienza della formazione ICL TFO-diretto. I plasmidi che ospitano ICL TFO-diretti migrano con una mobilità più lenta attraverso la matrice gel (Figura 1A, corsia 3) se confrontato con i plasmidi ...

Il danno mirato al DNA può essere ottenuto legando un agente dannoso al DNA a un oligonucleotide (TFO) che forma un triplex. Utilizzando TFO modificati, l'associazione proteica specifica per il danno al DNA e la modifica della topologia del DNA possono essere studiate nelle cellule umane utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina modificata e saggi di superavvolgimento del DNA qui descritti.

Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine ​​nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

L'obiettivo generale degli esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina modificata e superavvolgimento del DNA è studiare l'associazione e le successive modifiche topologiche indotte da proteine architettoniche su danni al DNA sito-specifici provocati da agenti chemioterapici o cancerogeni nelle cellule umane. Questa metodologia ci permetterà di affrontare domande fondamentali riguardo al danno e alla riparazione del DNA, favorendo così la scoperta di nuovi bersagli farmacologici per la terapia del cancro. La nostra tecnologia ci consente di indirizzare danni sito-specifici al DNA e facilita la valutazione di processi critici di riparazione del DNA rilevanti per il cancro umano.Per iniziare, 24 ore prima della trasfezione, seminare 400.000 cellule di mammifero per piastra da 60 millimetri in DMEM integrato con 10% di FBS senza antibiotici. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. In un tubo rotondo da 14 millilitri, mescolare 30 microlitri di agente transfezionante a temperatura ambiente con 500 microlitri di mezzo di crescita 1X riscaldato a 37 gradi Celsius.In un secondo tubo, combinare due microgrammi di plasmidi contenenti ICL diretti dal TFO in 500 microlitri di mezzo di crescita 1X. Incubare i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti. Combinare la miscela uno con la miscela due ed eseguire pipettaggi su e giù per mescolare accuratamente.Quindi, incubare la soluzione a temperatura ambiente per 25-30 minuti. Successivamente, lavare le cellule due volte con PBS tiepido. Poi, aggiungere la miscela di trasfezione in modo goccia a goccia, distribuendo la soluzione in modo uniforme su tutta la piastra delle cellule.Aggiungere un millilitro di mezzo di crescita alla piastra e portare il volume finale a due millilitri. Mescolare bene e posizionare le piastre di coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quattro ore dopo, sostituire il mezzo con tre millilitri di mezzo di crescita contenente il 10% di FBS e incubare per ulteriori 16 ore.Dopo l'incubazione, aggiungere 80 microlitri di formaldeide fresca al 37% per piastra alle cellule e incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Arrestare il cross-linking della formaldeide aggiungendo 300 microlitri di glicina fredda per piastra e incubare per cinque minuti. Rimuovere quindi il mezzo e lavare le piastre due volte con PBS freddo.Successivamente, dopo aver aggiunto un millimetro di PBS freddo, raccogliere le cellule raschiando in una provetta per microcentrifuga posta sul ghiaccio, mantenendo i campioni sul ghiaccio in ogni momento. Preparare i pellet cellulari centrifugando a 13.400 × g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, rimuovere il soprannatante e posizionare i pellet sul ghiaccio. Utilizzare un millilitro di Buffer A freddo per risospendere omogeneamente i pellet e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, centrifugare le cellule come in precedenza. Ora, con un millilitro di Buffer B freddo, risospendere omogeneamente i pellet e incubare sul ghiaccio per 10 minuti, mescolando occasionalmente per inversione.Quindi, centrifugare le cellule come in precedenza. Dopo aver risospeso nuovamente le cellule in 200 microlitri di Buffer B freddo, aggiungere due microlitri di micrococca nuclease, o MNase, e incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, arrestare la reazione della MNase ponendo i tubi sul ghiaccio e aggiungendo 40 millimolare di EDTA.Il livello di digestione da parte della nucleasi micrococcale è molto critico, poiché una sovradigestione può causare una perdita di segnale, mentre una sottodigestione può generare un elevato fondo non specifico. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere i pellet in 100 microlitri di buffer per immunoprecipitazione della cromatina, o buffer ChIP, integrato con una miscela di inibitori delle proteasi. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga con pareti sottili.Sonicare i campioni immergendoli in un bagno ad ultrasuoni per 20 secondi, seguiti da 20 secondi su ghiaccio. Ripetere i passaggi di sonicazione nove volte per generare frammenti di circa 800-1.200 paia di basi. Aggiungere a 20 microlitri dei campioni sonicati tre microlitri di cloruro di sodio 5 M e un microlitro di RNasi A. Vortexare le provette e incubarle a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi, aggiungere due microlitri di proteinasi K e incubare a 65 gradi Celsius per due ore. Dopo aver purificato i campioni secondo il protocollo indicato nel testo, eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio all'1% e visualizzare con bromuro di etidio. In tre tubi siliconati separati e pre-raffreddati, aggiungere 30 microlitri di lisato e 70 microlitri di buffer ChIP 1X freddo contenente inibitori delle proteasi.Aggiungere un microgrammo di anticorpi anti-IgG, anti-istone H3 o anti-HMGB1 ai rispettivi tubi. Incubare tutta la notte in una stanza fredda con rotazione continua. In ambiente freddo, dopo aver risospeso le perle di Proteina G, aggiungere quattro microlitri delle perle a ciascun tubo di reazione e incubare in stanza fredda con rotazione per altre due-quattro ore.Posizionare le provette su un supporto magnetico per far sedimentare le perle e rimuovere il sopranatante. Aggiungere 200 microlitri di buffer ChIP 1X con cocktail di inibitori delle proteasi ai pellet ed eseguire un lavaggio in condizioni di freddo con rotazione per cinque minuti. Successivamente, effettuare un ulteriore lavaggio con buffer ChIP 1X ad alta concentrazione salina.Quindi, utilizzare 160 microlitri di tampone di eluizione per risospendere i pellet e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione per 30 minuti. Centrifugare per formare il pellet delle perle e raccogliere il sopranatante in una provetta pulita. Aggiungere sei microlitri di cloruro di sodio 5 M e due microlitri di proteinasi K, quindi incubare tutta la notte a 65 gradi Celsius.Dopo aver purificato il DNA, secondo il protocollo indicato nel testo, eseguire reazioni di PCR utilizzando coppie di primer per la regione o le regioni di interesse, e risolvere i prodotti su un gel di agarosio all'1%, colorato con bromuro di etidio. Prima dell'uso, scongelare su ghiaccio il tampone per la sintesi di riparazione del DNA precedentemente preparato e aggiungere fosfocreatina 40 millimolare e 2,5 microgrammi di creatina fosfocinasi. Dopo aver preparato il tampone 10X per superavvolgimento, secondo il protocollo indicato nel testo, utilizzare un microlitro di topoisomerasi 1 vaccinia con tampone per superavvolgimento 1X in una reazione da 10 microlitri per linearizzare 300 nanogrammi di plasmide superavvolto PCA FG1.Aggiungere ai plasmidi rilassati 25 microlitri di estratto cellulare di HeLa appena scongelato e tampone per la sintesi del DNA. Mescolare bene, quindi aggiungere un microlitro di topoisomerasi 1 del virus vaccinia alla reazione e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Arrestare le reazioni aggiungendo SDS all'1% e proteinasi K a 0,25 milligrammi per millilitro, quindi incubare a 65 gradi Celsius per due ore.Dopo aver preparato un gel di agarosio al 1% con tampone TPE 1X, aggiungere il colorante di carico per DNA alle reazioni e caricare i campioni direttamente sul gel, distanziandoli di almeno quattro pozzetti. Eseguire l'elettroforesi per otto-dieci ore a due volt per centimetro in tampone TBE 1X per la prima dimensione a temperatura ambiente, al fine di risolvere i topoisomeri. Preparare due litri di tampone TBE 1X con tre microgrammi per millilitro di fosfato di cloroquina.Immergere il gel in 200 millilitri della soluzione, coperto con carta d'alluminio, per 20 minuti. Per eseguire l'elettroforesi del gel nella seconda dimensione, ruotare il gel di 90 gradi in senso orario ed eseguirlo per quattro-sei ore a due volt per centimetro in cloroquina contenente TBE 1X per risolvere le supereliche positive e negative. La quantità di cloroquina nel tampone di elettroforesi e nel gel è molto critica, così come lo è far correre il gel a un voltaggio molto basso nella seconda dimensione per separare le supereliche positive e negative.Dopo la colorazione e la decolorazione del gel, secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare un sistema di imaging per visualizzare la distribuzione termica delle topoisomeri. Come si osserva in questo gel, circa il 79% dei plasmidi contenenti ICL indotti da TFO migra con una mobilità più lenta attraverso la matrice di agarosio rispetto ai plasmidi di controllo non incrociati. Saggi ChIP eseguiti su lisati di cellule umane U2OS trasfettate con plasmidi di controllo o con plasmidi contenenti ICL indotti da TFO mostrano un arricchimento di HMGB1 nella regione P-ICL rispetto alla regione di controllo, quando immunoprecipitati con anticorpo anti-HMGB1.Quando l'HMGB1 è stato ridotto nelle cellule mediante trattamento con siRNA, l'arricchimento specifico per P-ICL è risultato diminuito. Quando gli stessi campioni sono stati immunoprecipitati utilizzando un anticorpo anti-IgG, è stata rilevata una minima amplificazione PCR. Infine, in questa figura, l'elettroforesi su gel bidimensionale di agarosio dimostra una modifica architettonica dei plasmidi contenenti ICL diretti dal TFO mediante introduzione di superavvolgimento negativo da parte dell'HMGB1 in estratti cellulari di HeLa.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque giorni, se svolta correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare che tutti i lavaggi devono essere effettuati in ambiente refrigerato, poiché i lavaggi a temperatura ambiente potrebbero aumentare il segnale di fondo. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come l'abbattimento della proteina mediato da siRNA, seguito da saggi di screening per mutazioni, possono essere eseguiti per rispondere a domande del tipo: la proteina di interesse è coinvolta nella riparazione del DNA?In alternativa, modifica in modo significativo gli spettri di mutazione durante il processo? Questa tecnica ha aperto la strada allo studio dell'associazione tra proteine e danni al DNA in siti specifici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come studiare l'associazione delle proteine strutturali con i legami crociati del DNA mirati e, successivamente, determinare l'effetto di tale associazione sulla topologia del DNA.Non dimenticare che lavorare con bromuro di etidio può essere estremamente pericoloso e, pertanto, durante l'esecuzione di questo esperimento si dovrebbe indossare sempre un'adeguata attrezzatura di protezione.

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Research

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JoVE Journal

Genetics

Genetica

L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Il presente protocollo evidenzia un metodo modificato per rilevare e quantificare i legami incrociati DNA-proteina (DPC) e le loro modificazioni post-traduzionali (PTM), tra cui l'ubiquitilazione, la SUMOilazione e l'ADP-ribosilazione indotte da inibitori della topoisomerasi e dalla formaldeide, consentendo così lo studio della formazione e della riparazione delle DPC e dei loro PTM.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Qui, presentiamo un protocollo semplice e rapido per il rilevamento dell'interazione proteica nei siti di danno al DNA.

Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

Questo protocollo dimostra l'esecuzione di un saggio a singola molecola per la visualizzazione dal vivo dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG. Descrive (1) la preparazione di un substrato di DNA, (2) la purificazione dell'elicasi CMG di Drosophila melanogaster marcata in fluorescenza, (3) la preparazione di una cella a flusso microfluidico per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e (4) il saggio di svolgimento del DNA a singola molecola.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Presentiamo un metodo rapido ed efficiente per rilevare le comuni rotture dei siti fragili attraverso l'immunoprecipitazione nativa della cromatina γH2A.X (ChIP). Questo approccio riduce significativamente sia il tempo che la manodopera associati ai tradizionali saggi ChIP γH2A.X, mantenendo al contempo un'elevata riproducibilità e affidabilità dei risultati.

Cattura delle rotture di siti fragili comuni mediante γH2A nativo. X ChIP

Scopri come studiare l'associazione delle proteine HMGB1 ai danni DNA specifici mediante immunoprecipitazione della cromatina modificata e saggi di superavvolgimento del DNA in cellule umane. Questo metodo facilita l'identificazione di nuovi target farmacologici per la terapia del cancro.

Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine ​​nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks (Video) | JoVE Journal

Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine ​​nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks

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