Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine ​​nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks

L'obiettivo generale degli esperimenti di immunoprecipitazione e superavvolgimento del DNA della cromatina modificata è quello di studiare l'associazione e le successive modificazioni topologiche indotte da proteine architettoniche su danni al DNA sito-specifici indotti da agenti chemioterapici o cancerogeni in cellule umane. Questa metodologia ci permetterà di affrontare questioni chiave sul danno e la riparazione del DNA, il che dovrebbe facilitare la scoperta di nuovi bersagli farmacologici per la terapia del cancro. La nostra tecnologia ci consente di dirigere il danno al DNA sito-specifico e facilita la valutazione dei processi critici di riparazione del DNA rilevanti per il cancro umano.

Per iniziare, 24 ore prima della trasfezione, piastrate 400.000 cellule di mammifero per piatto da 60 millimetri in DMEM integrato con il 10% di FBS senza antibiotici. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte. In un tubo a fondo tondo da 14 millilitri, combinare 30 microlitri di agente trasfezionista a temperatura ambiente con 500 microlitri di terreno di coltura 1X riscaldato a 37 gradi Celsius.

In una seconda provetta, combinare due microgrammi di plasmidi contenenti ICL diretti con TFO in 500 microlitri di terreno di coltura 1X. Incubare le provette a temperatura ambiente per 10 minuti. Combinare la miscela uno con la miscela due e pipettare su e giù per mescolare accuratamente.

Quindi incubare la soluzione a temperatura ambiente per 25-30 minuti. Quindi, usa il PBS caldo per lavare le celle due volte. Quindi, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia, distribuendo la soluzione in modo uniforme su tutta la piastra di cellule.

Aggiungere un millilitro di terreno di coltura alla piastra e portare il volume finale a due millilitri. Mescolare bene e posizionare le piastre di coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quattro ore dopo, sostituire il terreno con tre millilitri di terreno di coltura con il 10% di FBS e incubare per altre 16 ore.

Dopo l'incubazione, aggiungere alle cellule 80 microlitri di formaldeide fresca al 37% per piastra e incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti. Estinguere la reticolazione della formaldeide aggiungendo 300 microlitri di glicina refrigerata per piastra e incubare per cinque minuti. Quindi rimuovere il mezzo e utilizzare PBS freddo per lavare i piatti due volte.

Successivamente, dopo aver aggiunto un millimetro di PBS raffreddato, raccogliere le cellule raschiando in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio, mantenendo i campioni sempre in ghiaccio. Preparare i pellet cellulari centrifugando a 13, 400 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e posizionare i pellet sul ghiaccio.

Utilizzare un millilitro di tampone A refrigerato per risospendere in modo omogeneo i pellet e incubare su ghiaccio per 10 minuti. Quindi, pellettare le celle come prima. Ora, con un millilitro di tampone B raffreddato, risospendere in modo omogeneo i pellet e incubare su ghiaccio per 10 minuti mescolando occasionalmente invertendolo.

Quindi pellettare le celle come prima. Dopo aver risospeso nuovamente le cellule, in 200 microlitri di tampone B raffreddato, aggiungere due microlitri di nucleasi micrococcica, o MNasi, e incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, arrestare la reazione MNasi posizionando le provette sul ghiaccio e aggiungendo 40 millimolari di EDTA.

Il livello di digestione da parte della nucleasi micrococcica è molto critico, perché la sovradigestione può causare la perdita del segnale, mentre la sottodigestione può causare molto background aspecifico. Dopo aver pellettato le cellule, risospendere i pellet in 100 microlitri di immunoprecipitazione della cromatina, o tampone ChIP, integrato con un cocktail di inibitori della proteasi. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga a parete sottile.

Sonicare i campioni facendoli galleggiare su un sonicatore a bagno d'acqua per 20 secondi, seguiti da 20 secondi sul ghiaccio. Ripetere le fasi di sonicazione nove volte per generare circa 800-1.200 frammenti di coppie di basi. A 20 microlitri di campioni sonicati, aggiungere tre microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e un microlitro di RNasi A.Vortex le provette e incubarle a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, aggiungere due microlitri di proteinasi K e incubare a 65 gradi Celsius per due ore. Dopo aver purificato i campioni, secondo il protocollo di testo, eseguirli su gel di agarosio all'1% e visualizzarli con bromuro di etidio. In tre provette siliconate separate e pre-raffreddate, aggiungere 30 microlitri di lisato e 70 microlitri di tampone ChIP 1X raffreddato con l'aggiunta di inibitori della proteasi.

Aggiungere un microgrammo di anticorpi anti-IgG, anti-istone H3 o anti-HMGB1 alle rispettive provette. Incubare per una notte in cella frigorifera a rotazione continua. Nella cella frigorifera, dopo aver risospeso le perle di proteina G, aggiungere quattro microlitri di perle a ciascuna provetta di reazione e incubare in una cella frigorifera con rotazione per altre due o quattro ore.

Posizionare le provette su una griglia magnetica per pellettare le perline e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 microlitri di tampone ChIP 1X con cocktail di inibitori della proteasi ai pellet e lavare al freddo con rotazione per cinque minuti. Successivamente, con il tampone ChIP 1X ad alto contenuto di sale, eseguire un lavaggio aggiuntivo.

Quindi, utilizzare 160 microlitri di tampone di eluizione per risospendere i pellet e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione per 30 minuti. Pellettare le perline e raccogliere il surnatante in un tubo nuovo. Aggiungere sei microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e due microlitri di proteinasi K e incubare per una notte a 65 gradi Celsius.

Dopo aver purificato il DNA, secondo il protocollo di testo, eseguire reazioni di PCR utilizzando set di primer per la regione o le regioni di interesse, e risolvere i prodotti su un gel di agarosio all'1%, colorato con bromuro di etidio. Prima dell'uso, scongelare il tampone di sintesi della riparazione del DNA precedentemente preparato su ghiaccio e aggiungere 40 millimolari di fosfocreatina e 2,5 microgrammi di creatinfosfochinasi. Dopo aver preparato il tampone di superavvolgimento 10X, secondo il protocollo di testo, utilizzare un microlitro di vaccinia topoisomerasi 1 con il tampone di superavvolgimento 1X in una reazione di 10 microlitri per linearizzare 300 nanogrammi di plasmide superavvolto, PCA FG1.

Ai plasmidi rilassati, aggiungere 25 microlitri di estratto di cellule HeLa appena scongelate e tampone di sintesi del DNA. Mescolare bene, quindi aggiungere un microlitro di vaccinia topoisomerasi 1 alla reazione e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Terminare le reazioni aggiungendo l'1% di SDS e 0,25 milligrammi per millilitro di proteinasi K e incubare a 65 gradi Celsius per due ore.

Dopo aver colato un gel di agarosio all'1% con tampone TPE 1X, aggiungere un colorante caricante di DNA alle reazioni e caricare i campioni direttamente sul gel ad almeno quattro corsie di distanza. Far funzionare il gel per 8-10 ore a due volt per centimetro in 1X TBE per la prima dimensione a temperatura ambiente per risolvere i topoisomeri. Preparare due litri di 1X TBE con tre microgrammi per millilitro di fosfato di clorochina.

Immergere il gel in 200 millilitri di soluzione, coperto con un foglio di alluminio per 20 minuti. Per elettroforare il gel nella seconda dimensione, ruotarlo di 90 gradi in senso orario e farlo funzionare per quattro-sei ore a due volt per centimetro in clorochina contenente 1X TBE per risolvere le superbobine positive e negative. La quantità di clorochina nel tampone per elettroforesi e nel gel è molto critica, così come far funzionare il gel a una tensione molto bassa per la seconda dimensione è molto critico per separare le superbobine positive e negative.

Dopo aver colorato e decolorato il gel, secondo il protocollo di testo, utilizzare un imager per visualizzare la termodistribuzione dei topoisomeri. Come si vede in questo gel, circa il 79% dei plasmidi che ospitano ICL diretti da TFO migrano con una mobilità più lenta attraverso la matrice di gel di agarosio rispetto ai plasmidi di controllo non reticolati. I saggi ChIP eseguiti su lisati di cellule U2OS umane trasfettate con plasmidi di controllo o plasmidi contenenti ICL diretti con TFO mostrano un arricchimento di HMGB1 nella regione P-ICL rispetto alla regione di controllo quando immunoprecipitato con anticorpo anti-HMGB1.

Quando HMGB1 è stato espletato dalle cellule tramite il trattamento con siRNA, l'arricchimento specifico per P-ICL è diminuito. Quando gli stessi campioni sono stati immunoprecipitati utilizzando un anticorpo anti-IgG, è stata rilevata un'amplificazione minima della PCR. Infine, in questa figura, l'elettroforesi bidimensionale su gel di agarosio dimostra la modifica architettonica dei plasmidi contenenti ICL diretti con TFO come superavvolgimento negativo da parte di HMGB1 negli estratti di cellule HeLa.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare che tutti i lavaggi devono essere eseguiti nella cella frigorifera, poiché i lavaggi a temperatura ambiente possono aumentare il segnale di fondo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la deplezione proteica mediata da siRNA, seguita da saggi di screening delle mutazioni, al fine di rispondere a domande come: la proteina di interesse è coinvolta nella riparazione del DNA?

Oppure, altera in modo significativo gli spettri di mutazione durante il processo? Questa tecnica ha aperto la strada allo studio dell'associazione tra proteine e danno al DNA sito-specifico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come studiare l'associazione delle proteine architettoniche per indirizzare un legame incrociato del DNA e, successivamente, determinare l'effetto di tale associazione sulla topologia del DNA.

Non dimenticare che lavorare con il bromuro di etidio può essere estremamente pericoloso e, pertanto, durante l'esecuzione di questo esperimento è necessario indossare sempre indumenti protettivi adeguati.