Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

L'obiettivo generale del CARA è quello di fornire una valutazione semiquantitativa a medio rendimento dell'attività dei composti contro i micobatteri replicanti e non replicanti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, in qualità di surrogato di CFU, il CARA consente di testare rapidamente la dipendenza dalla dose e dal tempo di un composto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di farmaci per la tubercolosi, come determinare se un composto è batteriostatico o battericida contro i batteri replicanti e se è battericida contro i batteri non replicanti.

A dimostrare il metodo sarà Julia Roberts, una collaboratrice del nostro laboratorio. Aggiungere 450 millilitri di acqua in un becher di vetro da un litro o 900 millilitri di acqua in un pallone di Erlenmeyer da due litri. Includere un'ancoretta autoclavabile nel becher o nel pallone.

Successivamente, aggiungere una polvere di Middlebrook 7H11, carbone attivo a una concentrazione finale dello 0,4% e una soluzione di glicerolo al 50% per ottenere una concentrazione finale dello 0,2%. Coprire l'apertura del pallone o del becher con un foglio di alluminio e fissarlo al vetro con del nastro adesivo per autoclave. Dopo aver sterilizzato in autoclave il fluido, raffreddarlo a circa 55-65 gradi Celsius su una piastra di agitazione magnetica impostata a bassa velocità per mantenere il carbone in sospensione.

Mentre si lavora in modo asettico in una cappa di biosicurezza dotata di una piastra di agitazione magnetica, rimuovere la pellicola dal terreno e aggiungere 100 o 50 millilitri di supplemento OADC rispettivamente al pallone da due litri o al becher da un litro e continuare a mescolare. Utilizzando una pipetta multicanale con otto o 12 puntali filtranti, riempire una micropiastra da 96 pozzetti con 200 microlitri di carbone 7H11-OADC dal serbatoio del reagente o dal becher, lavorando rapidamente per evitare la solidificazione dell'agar e la formazione di bolle. Metti le pile di micropiastre CARA in sacchetti di plastica richiudibili per evitare che si secchino e conservale a quattro gradi Celsius.

Inoculare provette da centrifuga in polipropilene a fondo tondo o coniche contenenti rispettivamente quattro o 20 millilitri di Middlebrook 7H9-ADN o 7H9-OADC con M.smegmatis a un OD580 compreso tra 0,01 e 0,1. Incubare le colture di M. smegmatis a 37 gradi Celsius e 20% di O2 con agitazione, espandendo le colture alla fase di log medio o a un OD580 approssimativo di 0,5. Per impostare un esperimento di concentrazione inibitoria minima in condizioni di replicazione e non replicazione, distribuire 200 microlitri di cellule in 7H9-ADN a un OD580 di 0,01 in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo chiaro.

Per il test non replicante, utilizzare PBS contenente lo 0,02% di tiloxapol per lavare le cellule due volte. E usa un mezzo non replicante per risospendere le cellule. Utilizzare un terreno non replicante per diluire le cellule a un OD580 di 0,1 e aggiungere nitrato di sodio a una concentrazione finale di 0,5-5 millimolari da un ceppo molare appena preparato.

Distribuire 200 microlitri di cellule con un OD580 di 0,1 in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo chiaro. Dopo aver preparato gli agenti di test secondo il protocollo di testo, aggiungere due microlitri di agente di test uno nelle file da A a E e due microlitri di agente di test due nelle file da E a H e mescolare accuratamente. Per i saggi replicanti, incubare le micropiastre di M.smegmatis a 37 gradi Celsius, 20% O2 e 5% CO2 per una o 48 ore.

Nei momenti in cui il CARA verrà utilizzato come lettura, utilizzare una pipetta multicanale p200 impostata da 50 a 75 microlitri per risospendere con cura il contenuto del pozzetto della piastra del saggio in stile MIC90 pipettando su e giù da cinque a 10 volte. Quindi utilizzare i puntali delle pipette per far roteare delicatamente il contenuto dei pozzetti con un movimento circolare. Trasferire 10 microlitri del contenuto del pozzetto del saggio non diluito nei pozzetti corrispondenti della micropiastra CARA evitando schizzi durante i trasferimenti, assicurandosi che l'aliquota da 10 microlitri sia localizzata al centro dei pozzetti della micropiastra CARA.

Con il nastro adesivo, rilegare le pile di micropiastre CARA e poi inserirle in un sacchetto di plastica richiudibile. Incubare le micropiastre CARA di M.smegmatis a 37 gradi Celsius con il 20% di O2 per uno o due giorni per le piastre replicanti e per due o tre giorni per le piastre non replicanti. Quando nei pozzetti di controllo negativo è visibile una pellicola di crescita batterica o colonie macroscopiche più grandi, utilizzare un singolo set di 12 puntali p200 con una pipetta multicanale per erogare 40 microlitri di PBS sterile lungo il lato dei pozzetti e consentire al PBS di distribuirsi sulla parte superiore delle microcolonie di agar/batteriche.

Preparare il reagente di sviluppo CARA mescolando cinque milligrammi di resazurina e 50 millilitri di Tween80 al 5% in PBS. Aggiungere 50 microlitri di reagente di sviluppo CARA appena preparato a ciascun pozzetto della micropiastra CARA. Quindi fai oscillare le piastre avanti e indietro un paio di volte per aiutare a distribuire il reagente sull'agar e sul tappetino batterico in ogni pozzetto.

Mettere le piastre in un sacchetto di plastica richiudibile e incubare a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti per M.smegmatis. Prima della lettura della fluorescenza, posizionare le micropiastre CARA in una cappa di biosicurezza per 15 minuti a temperatura ambiente con i coperchi rimossi. Quando si utilizzano gli spettrofotometri BSL3 al di fuori di una cappa di biosicurezza, far aderire un adesivo PCR di qualità ottica sulla piastra e utilizzare un tovagliolo di carta morbido per sigillare ermeticamente premendo delicatamente sulla superficie dell'adesivo.

Determinare la fluorescenza tramite lettura dall'alto con eccitazione a 530 nanometri ed emissione a 590 nanometri. Non è necessario cancellare la piastra. Per analizzare i dati, tracciare la concentrazione dell'inibitore sull'asse X su una scala log10 e la fluorescenza sull'asse Y su una scala lineare.

Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo. La concentrazione dell'agente in esame che provoca l'incapacità della fluorescenza CARA di salire al di sopra dei livelli di fondo è il CARA-MBC maggiore di 99 che è mostrato qui. Il maggiore di uguale a 99 pedice indica che il CARA-MBC fornisce una concentrazione stimata dell'agente di prova, che dà origine a un'uccisione batterica maggiore di due log10.

Si sospetta che i composti esercitino un effetto post-antibiotico se mostrano una finestra statica, definita come uno spostamento maggiore di quattro volte a destra tra le curve MIC e CARA. La finestra statica indica che una molecola attiva contro la replicazione di M. tuberculosis può essere batteriostatica invece che battericida. Per le molecole con un potente effetto post-antibiotico, le finestre statiche possono essere difficili da osservare e sono evidenti solo dopo l'ispezione di un asse Y espanso per la fluorescenza CARA, come si vede qui.

Qui sono mostrate le molecole attive replicanti e non replicanti testate da MIC90 e CARA. Mentre l'isoniazide e il linezolid sembrano avere attività contro i batteri non replicanti dal test MIC90, il CARA suggerisce che sono inattivi nelle condizioni non replicanti testate. In questo esperimento CARA, l'esposizione di M. smegmatis a concentrazioni crescenti di rifampicina ha rivelato un impatto in appena un'ora e ha mostrato un aumento dell'attività battericida tra tre e 24 ore, uccidendo in modo maggiore di due o tre log10 a circa 10 microgrammi per millilitro entro 24 ore.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore per preparare le piastre, meno di un'ora per trasferire le cellule su piastre CARA e circa una o due ore per sviluppare e misurare la fluorescenza delle piastre CARA se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare il CARA come test predittivo per determinare se un composto ha attività battericida o batteriostatica contro i micobatteri che si replicano o non si replicano. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare un CARA e analizzare i dati in modo da aiutare a prevedere il tipo di attività di un composto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.