Thermo flusso LED - La combinazione Optogenetics con citometria a flusso

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di stimolare sostanze otticamente controllate durante le misure citofluorimetriche. Questo nuovo dispositivo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare combinando la potenza delle sostanze controllate otticamente con la citometria a flusso. Per la prima volta, gli strumenti optogenetici possono essere caratterizzati e analizzati utilizzando la citometria a flusso.

Fino ad oggi non esisteva alcun metodo consolidato comparabile. Per iniziare, sospendere i linfociti Ramos B trasdotti a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro e trasferirli in una provetta FACS di vetro. Quindi, sostituire l'O-ring nero del citometro a flusso con un O-ring in gomma e applicare grasso al silicone per creare una migliore tenuta.

Inserire il tubo di vetro in un citometro a flusso e posizionare il prototipo LED attorno al tubo con le luci spente. Misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa nel canale GFP. La fase più critica della procedura è la manipolazione dei tubi di vetro.

I tubi FACS in vetro sono molto fragili e, quindi, si consiglia di esercitarsi nell'inserimento dei tubi di vetro nel citometro prima di fare esperimenti. Quindi, accendi la luce LED a 500 nanometri all'esterno del tubo e continua a misurare l'intensità della fluorescenza di Dronpa. Aumentare l'intensità delle luci LED fino a quando l'intensità della fluorescenza di Dronpa diminuisce, al fine di stimare l'intensità luminosa minima necessaria, al fine di misurare la fotocommutazione della proteina Dronpa-Linker-Dronpa.

Quindi, accendi la luce LED a 400 nanometri del prototipo all'esterno del tubo e continua a misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa. Aumentare l'intensità luminosa delle luci LED a 400 nanometri fino all'aumento dell'intensità della fluorescenza Dronpa. Inizia seguendo le istruzioni di progettazione e produzione nel protocollo di testo allegato per fabbricare gli strati interni ed esterni del dispositivo LED di fotocommutazione.

Inserire i LED con lunghezza d'onda di 400 e 500 nanometri nei canali del dispositivo. Incollali in posizione e collegali come indicato. Queste specifiche lunghezze d'onda saranno utilizzate per commutare le proteine di fusione Dronpa-Linker-Dronpa tra i loro stati scuri e luminosi.

Quindi, assemblare il dispositivo e assicurarsi che sia a tenuta stagna per evitare perdite prima di alimentare il trasformatore. Dopo l'assemblaggio del dispositivo, raccogliere i linfociti Ramos B e sospenderli in una densità da tre a dieci milioni di cellule per millilitro. Trasferire 600 microlitri di cellule in una provetta di vetro FACS.

Metterli sul ghiaccio e proteggere le cellule dalla luce fino a quando non vengono misurate. Collegare il dispositivo assemblato a una pompa dell'acqua riscaldata e regolare la temperatura a 37 gradi Celsius. Quindi, inserire con cautela il tubo di vetro FACS nel dispositivo e collegarlo al citometro a flusso.

Registra l'intensità della fluorescenza Dronpa nel canale GFP. Il design di questo dispositivo optogenetico include una camera che può essere collegata a una rete di acqua circolante per mantenere la temperatura del campione a un valore costante. Mentre il dispositivo emetteva tre diverse lunghezze d'onda, solo un aumento marginale della temperatura è stato osservato nel campione FACS, quando l'acqua scorreva a 37 gradi Celsius attraverso il dispositivo.

Il costrutto di fusione Dronpa-Linker-Dronpa è stato clonato e trasdotto in cellule Ramos B. Quando viene diretto allo stato monomerico da una sorgente luminosa a 500 nanometri, l'intensità dell'emissione diminuisce. Quindi, una volta che la sorgente luminosa viene commutata sulla luce a 400 nanometri, il monomero Dronpa viene rapidamente trasformato nello stato dimero e l'intensità aumenta rapidamente.

Utilizzando questo dispositivo, la proteina di fusione citosolica Dronpa-Linker-Dronpa è stata in grado di essere fotocommutata più volte. Il passaggio allo stato buio avviene lentamente, mentre il passaggio allo stato luminoso avviene quasi istantaneamente. Il recupero spontaneo della fluorescenza di Dronpa al buio mostra che l'efficiente fotocommutazione verso la forma luminosa richiede un'illuminazione specifica e avviene solo lentamente in modo spontaneo.

L'analisi cinetica mostra che la velocità di fotocommutazione è nel complesso molto riproducibile e che anche dopo una lunga incubazione al buio, solo circa il dieci percento della fluorescenza viene recuperata senza fotocommutazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire qualsiasi analisi citofluorimetrica, comprese le misurazioni del flusso di calcio, al fine di esplorare la funzionalità dello strumento optogenetico scelto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'optogenetica per esplorare il cablaggio delle vie di segnalazione cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire un protocollo di fotocommutazione per il tuo specifico strumento optogenetico. Non dimenticare che la luce UV può essere estremamente pericolosa e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare sempre occhiali protettivi, come gli occhiali protettivi.