Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

L'obiettivo generale di questa procedura di modificazione genetica del topo è identificare, purificare e caratterizzare le cellule immunitarie produttrici di IL-22. Le cellule del sistema immunitario rilasciano mediatori chiamati citochine che sono responsabili della difesa da agenti estranei come i batteri e del ripristino dei tessuti danneggiati. L'IL-22 è una di queste citochine e le sono state attribuite molte attività che vanno dalla riparazione dei tessuti alla patologia.

E un certo numero di diversi tipi di cellule nel sistema immunitario sono stati segnalati per essere in grado di produrlo. Quindi, per chiarire quali cellule producono effettivamente IL-22, abbiamo sviluppato un nuovo topo reporter IL-22. Questo ci ha permesso di identificare i produttori rilevanti di IL-22 in vivo nei topi in condizioni normali e in un modello di malattia infiammatoria intestinale.

Abbiamo anche utilizzato cellule reporter per purificare gli espressori di IL-22 per determinare le loro altre proprietà. Viene brevemente delineato il metodo di generazione dei topi reporter e vengono descritti i metodi di analisi. I metodi descritti possono essere applicati ad altri geni allo scopo di identificare gli espressori e purificare le cellule esprimenti vitali per un'ulteriore caratterizzazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia sulle attività biologiche dell'IL-22 e sulle proprietà delle cellule che la producono. A dimostrare la procedura con me saranno Julie Hixon, una biologa, Caroline Andrews, un post-dottorato, e Wenqing Li, uno scienziato dello staff, tutti del laboratorio del Dr.Durham. Dopo aver inserito il gene reporter tdTomato in un vettore navetta, sostituendo il gene GFP all'interno dello stesso sito, utilizzare il cromosoma artificiale batterico appropriato, o modello BAC, per amplificare le caselle di omologia A e B al primo esone tradotto di IL-22 in un sistema di reazione PCR da 50 microlitri.

Quindi trasformare i vettori purificati in cellule batteriche competenti per BAC su piastre di agar Luria-Bertani o LB contenenti cloramfenicolo e ampicillina a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, inoculare due o tre colonie in un millilitro di brodo LB, integrato con cloramfenicolo a 37 gradi Celsius e 225 giri/min. Dopo un'ora, distribuire 100 microlitri di ciascuna miscela su una piastra di agar LB integrata con cloramfenicolo e saccarosio per una coltura notturna a 37 gradi Celsius.

La mattina successiva, riplaccare le colonie grandi su una nuova piastra di agar LB con cloramfenicolo e le colonie piccole su un'altra piastra di agar LB ed esporre le piastre alla luce UV per 30 secondi. Quindi selezionare una colonia sensibile ai raggi UV e utilizzare un primer eterozigote tdTomato IL-22 per confermare la presenza del DNA BAC modificato mediante PCR. Dopo aver rimosso la milza e il timo, utilizzare una pinza per dissezione seghettata a punta fine per raccogliere i linfonodi mesenterici bianchi perlacei vicino alla parete dell'intestino tenue.

Quindi, rimuovi l'intero intestino tenue e il colon e usa le forbici per estrarre le chiazze ovali di Peyer estese lungo l'intestino. Quando tutti i tessuti linfatici sono stati raccolti, macinare i linfonodi mesenterici e i cerotti di Peyer tra due vetrini glassati in PBS integrato con FBS su ghiaccio. Dopo aver generato singole sospensioni di singole cellule di milza e timo allo stesso modo, centrifugare le cellule della milza seguite dalla lisi dei globuli rossi splenici con un millilitro di tampone di lisi ACK milza.

Dopo un minuto, ripristinare l'isotonicità con nove millilitri di PBS e centrifugare nuovamente le cellule. Risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS e filtrare le celle attraverso un filtro a celle da 100 micron. Quindi raccogliere le celle mediante un'altra centrifugazione, risospendendo il pellet in cinque millilitri di terreno RPI per l'enumerazione mediante esclusione del blu di tripano.

Dopo aver prelevato l'intestino tenue dal duodeno all'ileo, insieme all'intero colon, utilizzare una pinza per rimuovere il tessuto adiposo e mesenterico in eccesso dall'intestino e posizionare immediatamente il tessuto intestinale in PBS ghiacciato. Usa il forcipe per raccogliere le chiazze di Peyer lungo la regione distale dell'intestino tenue. Quindi usa le forbici per aprire l'intestino nel senso della lunghezza e sciacquare accuratamente il tessuto con 10 millilitri di PBS ghiacciato.

Trasferire il campione in 20 millilitri di tampone di predigestione per due incubazioni di 30 minuti a 37 gradi Celsius e 50 giri/min in un agitatore, agitando il tessuto per 30 secondi a 12.000 giri/min e premendo tutti i frammenti attraverso un colino cellulare da 100 micron alla fine di ogni incubazione per raccogliere lo strato di cellule epiteliali. Successivamente, aggiungere 20 millilitri di soluzione fresca di EDTA all'impasto cellulare per un'altra incubazione di 30 minuti agitando a 37 gradi Celsius, filtrando e raffreddando le cellule epiteliali intestinali alla fine dell'incubazione come appena dimostrato. Posizionare i frammenti intestinali rimanenti sul ghiaccio e raccogliere le cellule epiteliali intestinali aggregate mediante centrifugazione, seguita da un lavaggio in 10 millilitri di HBSS integrato con FBS.

Risospendere il pellet lavato in otto millilitri di terreno di silice colloidale al 44% e sovrapporre la sospensione cellulare con cinque millilitri di terreno di silice colloidale al 67%. Separare le cellule mediante centrifugazione e utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere i primi cinque millilitri di terreno di separazione cellulare. Quindi raccogliere le cellule all'interfaccia e lavare le cellule epiteliali intestinali in 10 millilitri di terreno RPMI, risospendendo il pellet in cinque millilitri di RPMI fresco.

Dopo aver preparato sospensioni di singole cellule della milza da topi IL-22 td-Tomato come appena dimostrato. Risospendere le cellule a una concentrazione di 10-10-7 cellule per millilitro in PBS sterile e utilizzare il metodo di isolamento negativo delle cellule CD4 di topo per purificare le cellule T CD4 positive. Quindi, etichettare le cellule T con anticorpi anti-CD4 e anti-CD45RB per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione seguita da un lavaggio in due millilitri di PBS integrato con FBS. Risospendere il pellet lavato in un millilitro di PBS e FBS freschi e selezionare le cellule T marcate mediante citometria a flusso in base alla loro coespressione CD4 e CD45RB. Quando tutte le cellule sono state selezionate, raccoglierle mediante centrifugazione e risospendere il pellet a una concentrazione di una volta 10-6 cellule per millilitro in PBS sterile per l'iniezione delle cellule in riceventi di topo knockout RAG1.

Per creare il transgene reporter murino IL-22, la ricombinazione è stata utilizzata per modificare un cromosoma artificiale batterico che trasporta la locusta IL-22 che contiene anche un marcatore di selezione positivo e un gene di resistenza agli antibiotici cloramfenicolo. Dopo l'introduzione di tdTomato nell'esone 1, la sequenza del peptide segnale è stata interrotta, intrappolando il reporter tdTomato all'interno delle cellule che esprimono IL-22 e consentendo il loro rilevamento e isolamento mediante citometria a flusso. Per testare la fedeltà dei reporter di IL-22, gli splenociti generati in vitro possono essere coltivati in condizioni Th22 o neutre con l'espressione di IL-22 tdTomato evidente sia dalla citometria a flusso che dalla microscopia a fluorescenza.

In vivo, i reporter di IL-22 hanno rilevato in diversi tessuti di topo in condizioni omeostatiche con la maggior parte del segnale osservato nelle cellule della lamina propria dall'intestino, ma non nel linfonodo ascellare, nella milza o nel timo. In un modello murino di colite indotta dal trasferimento di cellule CD4 positive CD45RB ad alta T in topi knockout per RAG1, i reporter di tdTomato vengono visualizzati inizialmente nei linfonodi mesenterici, ma il loro eventuale accumulo nella lamina propria dell'intestino tenue distale e dei tessuti del colon. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di scegliere il clone BAC giusto.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come la creazione di modelli di infezione polmonare o cutanea, possono essere eseguiti utilizzando questo topo reporter per rispondere a ulteriori domande sul ruolo dell'IL-22 nella difesa dell'ospite e nella riparazione dei tessuti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la funzione delle proteine secrete che dimostrano una bassa espressione utilizzando un modello murino come questo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare un topo reporter transgenico e identificare i geni reporter IL-22 in vitro e in vivo.