Name: Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Scopri come visualizzare i linfociti produttori di IL-22 utilizzando topi reporter transgenici. Questo metodo consente di tracciare le citochine in vivo nei tessuti murini e di studiare le risposte immunitarie in condizioni fisiologiche e patologiche.

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Ringraziamo Kelli Czarra e Megan Karwan per l'assistenza tecnica sugli animali, Kathleen Noer e Roberta Matthai per l'assistenza alla citometria a flusso e Donna Butcher e Miriam R. Anver per l'analisi patologica. Questo progetto è stato sostenuto da una sovvenzione della Ely and Edythe Broad Foundation (a Scott Durum) ed è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, nell'ambito del contratto n. HHSN261200800001E (MRA).

Tutti gli animali hanno ricevuto cure adeguate secondo le procedure sperimentali descritte nella Guida 2011 per cura e l&#39;uso di animali da laboratorio Comitato di Federico Laboratorio Nazionale per la Ricerca sul Cancro. 1. Generazione di IL-22-tdTomato topi reporter di BAC recombineering NOTA: I topi dovrebbero essere inconscia e non si muovono in risposta a uno stimolo nocivo. Sterilizzare l&#39;area chirurgica con il 70% di etanolo e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro. <ol><li> Purificare BAC DNA (RP23-401E11, lunghezza clone di 228391 bps) utilizzando un metodo di estrazione alcalina 10, 11. Caratterizzare il clone BAC da SpeI digestione di 5 mg di RP23-401E11 per confermare la dimensione corretta del gene bersaglio. NOTA: Il BAC DNA è stato digerito in 14 frammenti. </li><li> Inserire il gene TdTomato giornalista nel sito Not I / Sal I del vettore shuttle PLD53SC-A-GFP-B11 e sostituire il gene GFP nello stesso sito. Quindi, utilizzando BAC RP23-401E11 come modello, amplificare le caselle di omologia (A e B) al primo esone tradotta di Il-22 (esone 1) mediante PCR (95 ° C 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 secondi, e una estensione finale a 72 ° C per 10 min). In un sistema di reazione PCR 50 microlitri, aggiungere 50 ng (1 ml) di BAC DNA, 0,5 ml di primer (10 mM), 40 ml di PCR Supermix alta fedeltà, e 8 ml di H 2 O. NOTA: I primer per le caselle A e B sono i seguenti: Una casella in avanti: 5&#39;-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e Reverse: 5&#39;-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Scatola B Forward: 5&#39;-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5&#39;-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. I siti degli enzimi di restrizione (Asc I e Pac I) sono sottolineate. </li><li> Legare 500 ng di Asc I-digerito A e 500 ng di Fragm B Pac I-digeritoEnt in 50 ng di PLD53SC-ATB (tdTomato) vettore a 16 ° C per 1 ora. </li><li> Transform purificato vettoriale PLD53SC-ATB in cellule BAC-competenti 11 e li cultura su Luria-Bertani (LB) piastre di agar con cloramfenicolo (20 mg / ml) e ampicillina (30 mcg / ml) a 37 ° C. Scegli due o tre colonie di co-integrazione dalle piastre maestro Ch / Amp. </li><li> Inoculare ogni colonia in 1 ml di LB addizionato con 20 ug / ml di cloramfenicolo e incubare per 1 ora a 37 ° C e 225 rpm. Distribuire 100 ml di ciascuna miscela su una piastra di LB-agar (10 g di Peptone 140, 5 g di estratto di lievito, 12 g di agar e 1 L di acqua; pH 7.5) addizionato con cloramfenicolo e 4-4,5% di saccarosio. Incubare la cultura durante la notte a 37 ° C. </li><li> Scegli entrambe colonie grandi e piccoli e li replate su due piatti LB-agar con cloramfenicolo. Poi, esporre le piastre con o senza luce UV per 30 sec e raccogliere le colonie sensibili agli UV per ulteriori analisi. </li><li> Identificare il DNA BAC modificato mediante PCR utilizzando tdTomato / IL-22 Primer eterozigote (Forward: 5 &#39;ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverse: 5&#39; TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). Le condizioni Thermocycler sono le seguenti: 95 ° C per 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 56 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; e una estensione finale a 72 ° C per 10 min. </li><li> Conferma la sequenza dell&#39;area modificata del BAC BAC sequenziamento diretto di grandi prep BAC DNA 12. </li><li> Anestetizzare un mouse destinatario con una dose di 0,25% tribromoethanol nella cavità peritoneale, quando impiantare gli zigoti microiniettati in topi / 6c C57BL pseudo-gravidanza. </li><li> Linearizzare l&#39;IL-22-tdTomato BAC costrutto (10 mg) mediante digestione con 5 ml di restrizione endonucleasePi-SCEI in 100 ml di sistema di reazione e microinject il DNA linearizzato BAC in uova fecondate di C57BL / 6 femmine in fase di pronuclei 13. Screit il topi transgenici con l&#39;analisi Southern blot di DNA isolati da biopsie di coda utilizzando le procedure standard. </li></ol> Preparazione 2. Single-cell da milza, timo, linfonodi, e le placche di Peyer NOTA: topi reporter IL-22-tdTomato sono stati mantenuti al National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Il metodo di eutanasia è conforme alle più recenti linee guida AVMA sull&#39;eutanasia. Tutti i topi sono stati sacrificati con CO 2 inalazione 14. <ol><li> Euthanize un IL-22-tdTomato del mouse in una camera di CO 2 e metterlo su un tampone pulito. Sterilizzare la pelle dell&#39;addome spruzzando il 70% di alcol e tagliarlo aperto. Rimuovere la milza nel fianco sinistro e il timo dietro lo sterno. </li><li> Per raccogliere i nodi mesentericlymph (situato nel tessuto mesenterico) e placche di Peyer (piccoli lymphoidnodules in tutta la regione ileo dell&#39;intestino tenue), prendere la mesenterica bianco perlato i nodi vicino alla tegli parete dell&#39;intestino tenue con sezionare pinze con punte a punta fine seghettati e poi rimuovere l&#39;intero intestino tenue e colon fuori dal corpo. Trova le patch ovali estesi (placche del Peyer) lungo l&#39;intestino e tagliarli con le forbici. Macinare questi tessuti linfoidi (linfonodi e placche di Peyer) individualmente tra due vetrini smerigliati in una cella singola sospensione in PBS / 1% di siero fetale bovino (FBS) tampone sul ghiaccio. </li><li> Tritare la milza o tessuti timo utilizzando lo stesso metodo come al punto 2.2. Centrifugare la sospensione della milza per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi ACK per milza per i pellet cellulari. </li><li> Mescolare bene e lasciare riposare per 1 min. Aggiungere 9 ml di tampone sterile tampone fosfato salino (PBS) per ogni campione. Centrifugare per centrifugazione per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C per rimuovere i globuli rossi. NOTA: Non aggiungere ACK buffer di lisi delle cellule del timo. </li><li> Risospendere le leucociti risultanti in 5 ml di PBS e pass le cellule attraverso un colino cella di 100 micron. Raccogliere il pellet di cellule per centrifugazione a 500 g per 8 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di media RPMI o tampone FACS e contare le cellule vitali utilizzando 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS. </li></ol> 3. Isolamento di intraepiteliale linfociti e lamina propria cellule dall&#39;intestino <ol><li> Aprire la pelle addominale come al punto 2.1, tagliare l&#39;intestino tenue, dal duodeno (accanto allo stomaco) per ileo (vicino alla appendice), e l&#39;intero colon, proprio sopra l&#39;ano. Rimuovere il adiposo in più e pinze dei tessuti utilizzando mesenterici. Mettere subito l&#39;intestino in PBS ghiacciato. </li><li> Se vuoi placche di Peyer (piccole, noduli grezzi) lungo la regione distale del piccolo intestino. Rimuovere le masse con pinza Andopen dell&#39;intestino lunghezza con le forbici. Lavare accuratamente l&#39;intestino con 10 ml di PBS ghiacciato. </li><li> Incubare i tessuti in 20 ml di tampone di pre-digestione (5 mM EDTAe 1 mM ditiotreitolo in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)) per 30 minuti a 37 ° C con rotazione lenta (50 rpm) in un agitatore. Dopo ciascuna delle 2 incubazione, rimuovere lo strato di cellule epiteliali, che contiene i linfociti intraepiteliali (IELS), da un&#39;intensa vortex (30 sec a 12.000 giri al minuto) e passare tutti i tessuti attraverso un colino cella di 100 micron. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione EDTA al tessuto per la seconda incubazione per 30 min a 37 ° C. Passare le frazioni IEL attraverso un colino cella di 100 micron e piscina con le frazioni precedenti. Mantenere i frammenti rimanenti intestino sul ghiaccio da trattare nella fase 3.9. </li><li> Centrifugare le frazioni IEL in pool a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare le frazioni IEL in pool con 10 ml di HBSS / 5% FBS e spin giù per 5 min a 800 xg e 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 8 ml di terreno 44% di silice colloidale e 15 rivestirle medio silice colloidale 5 ml di 67%. Centrifugare il 44% / 67.5% Di pendenza miscela di cellule per 20 minuti a temperatura ambiente e 1.500 x g. </li><li> Raccogliere le cellule IEL della band a livello di interfaccia. Innanzitutto, rimuovere lo strato superiore del surnatante (circa 5 ml) con 1 ml pipetta. Poi, IELS raccolta all&#39;interfase della colloidale medio di silice gradiente. </li><li> Lavare le IELS con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreno RPMI. Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 800 xg e 4 ° C. Risospendere le IELS in 5 ml di RPMI per passo 3.15. </li><li> Per l&#39;isolamento dei linfociti della lamina propria (LPLS), sminuzzare i frammenti di tessuto dell&#39;intestino dal punto 3.4 in piccoli pezzi con le forbici (1 mm) e digerire i pezzi con 10 ml di tampone di digestione (0,05 g di collagenasi, 0,05 g di DNasiI, e 0,3 g di dispasi II in RPMI / 5% FBS) per 15-20 minuti a 37 ° C. </li><li> Filtrare la miscela attraverso un colino cella di 70 micron. Il supernatante flow-through contiene LPL rilasciato. </li><li> Completamente digerire i frammenti intestino ripetendo i passaggi 3,9-3,10 (di solito, devono essereripetuto 3 volte). Ogni volta, piscina il surnatante contenente il LPLS. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione per 5 min a 1500 xg e temperatura ambiente e risospendere il pellet in RPMI / 5% FBS. farli passare attraverso un colino cella di 40 micron. </li><li> Risospendere le pellet cellulari in 10 ml della frazione 40% di 40:80 silice colloidale dislivello medio li sovrapporre 5 ml della frazione 80% in una provetta da 15 ml. </li><li> Eseguire la separazione gradiente di densità per centrifugazione per 20 min a 1500 xg e temperatura ambiente 15. </li><li> Raccogliere il LPLS, come descritto al punto 3.7. li Risciacquare una volta con 10 ml di PBS e risospendere il pellet in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS o mezzo RPMI. </li><li> Contare le cellule vitali (sia IELS e LPLS) con lo 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS. </li></ol> 4. L&#39;espressione di IL-22-tdTomato in Colite <ol><li> Preparare sospensioni cellulari milza singoli da topi IL-22-TdTomato ad una concentrazione di 1 x 10 &lt;sup&gt; 7 cellule / ml in PBS sterile, come descritto ai punti 2.1-2.4. </li><li> Purificare le cellule T CD4 + con il mouse CD4 cellulare Metodo di isolamento Negativo 10. Etichettarli con l&#39;anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) e anti-CD45RB FITC-(clone 16A, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) mediante incubazione a 4 ° C per 30 min. </li><li> Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Lavare le cellule con 2 ml di PBS / 1% tampone FBS e risospendere in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS colorazione. </li><li> Eseguire le cellule T etichettati su una macchina di citometria a flusso 16. Porta le cellule su una popolazione di cellule T e di ordinamento CD4 + CD45RB alte cellule doppio positive (la lunghezza d&#39;onda rilevata a 488 nm e 633 nm) laser. </li><li> Raccogliere le cellule ordinati per centrifugazione per 5 min a 500 xg e 4 ° C. Risospendere il pellet di cellule in tampone PBS sterile a 1 x 10 6 </sup&gt; cellule / ml. Iniettare le cellule (0,5 x 10 6) nel peritoneo ofeach Rag1 - Mouse destinatario - /. </li><li> Sacrificare i topi riceventi sotto di CO 2 in vari momenti. Raccogliere i linfonodi mesenterici e intestino tenue e crasso, come descritto ai punti 2.1 e 2.2. Mettere ogni linfonodo mesenterico e cut-aperto intestino (carta / intestino / carta del panino) nel 4% paraformaldeide (PFA, gestire sotto una cappa) durante la notte per riparare i tessuti. Sostituire il PFA con il 18% di saccarosio per 16-24 ore e poi congelare i tessuti per il sezionamento. </li><li> Utilizzare la macchina criostato per tagliare il tessuto 17, 18, 19. Riscaldare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente per circa 60 minuti e metterli in acetone per 10 min a temperatura ambiente. li asciugare a temperatura ambiente per circa 5 minuti. </li><li> Aggiungere FBS in eccesso, rimuoverlo dalla pipetta e aggiungere anti-RFP ad un 1: BSA 200 diluizione nel 0,1% / 1x PBS. Incubare l&#39;anticorpo a 37 ° C per 60 min. </li><li> Risciacquare le sezioni in 1x PBS per 10 min e applicare l&#39;anticorpo secondario corrispondente (goat anti-rabbit 568) al tessuto, diluito 1: 300 in 1% BSA / PBS 1x, per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBS 1x per 10 min, pulire asciugare e aggiungere lamelle. </li><li> Visualizza tutti i campioni con un microscopio a fluorescenza in presenza di luce coerente (RFP: filtro di eccitazione 540-580 nm) con l&#39;obiettivo 40X. </li></ol>

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<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75, 274-282 (1993).</li>
<li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+the+intestine%3A+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li>
<li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

IL-22 svolge un ruolo essenziale nella innata difesa ospite e nel rimodellamento tissutale. Cellule-22 producono IL sono stati identificati ex vivo mediante colorazione intracellulare. Tuttavia, rimane ancora difficile da monitorare l&#39;espressione di IL-22 in situ, sia allo stato normale o in condizioni infiammatorie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo per sviluppare un modello di topo IL-22 giornalista, che ci permette di localizzare le cellule giornalista esprimono in vivo. La cod...

Cellule specifiche del tipo di espressione di geni reporter è utile per identificare le cellule che esprimono attivamente il target in tessuti sotto stati omeostatiche e perturbate. Permette anche per la purificazione di queste cellule, che rimangono vitali, per studiare le altre proprietà. topi reporter sono stati utilizzati nel chiarire il meccanismo di azione di specifiche citochine, fattori di trascrizione, e elementi regolatori. Strategie Precedente 1, 2, 3 sono in gran parte affidamento sul battendo il giornalista nel locus bersaglio nel topo cromosoma, una procedura che richiede tempo e costosa. Così, un metodo semplice per la generazione di topi transgenici è desiderabile. Le citochine sono una vasta classe di piccole proteine ​​secrete / peptidi che regolano le risposte immunitarie attraverso la segnalazione intercellulare. L&#39;interleuchina 22 (IL-22) è una citochina con molte riferito attività, tra cui barriera function, la riparazione dei tessuti e l&#39;infiammazione 4. Sebbene IL-22 è stato inizialmente scoperto come prodotto delle cellule T 5, rapporti successivi hanno dimostrato la sua espressione nelle cellule natural killer (NK) negli esseri umani 6 e 7 topi e in altre classi di linfociti innate 8. Nonostante vasta osservazione di cellule-22 che producono IL, visualizzazione di IL-22 in precedenza necessaria la stimolazione ex vivo e permeabilizzazione alle macchie con anticorpi. Pertanto, il romanzo IL-22 topi reporter sarebbe uno strumento molto utile per studiare la funzione di IL-22 nei processi omeostatici e patogeni. Qui, abbiamo sviluppato un modello semplificato transgenico giornalista mouse per osservare le cellule IL-22-producono in vivo e in vitro. Utilizzando un metodo BAC recombineering 9, abbiamo inserito la sequenza tdTomato cDNA con Poly A frammenti di segnale in IL-22 locnoi e sostituito esone 1. Le altre regioni, esoni, e gli elementi normativi non tradotte non sono stati perturbati, dal momento che vorremmo imitare la regolazione naturale della IL-22, per quanto possibile. Il sito di inserimento giornalista interrompe la sequenza di segnale, con conseguente accumulo del reporter all&#39;interno delle cellule che producono, a differenza di IL-22 stessa, che sta rapidamente secreto. Questo nuovo metodo può essere applicato anche alla generazione di topi transgenici per altre proteine ​​secrete.

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RPCI23. C</td><td>Bisogno di ID gene: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Estratto di lievito, 5 g cloruro di sodio.</td></tr><tr><td>Anti-topo CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza fenolo rosso</td><td>Thermo Fisher Scientific 14175145</td><td></td><td>KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-glucosio</td></tr><tr><td>Dnasi I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi ACK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare scienze della vita</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (proteasi neutra, grado II)</td><td>Microscopio</td><td></td> a fluorescenza invertita Roche 4942078001 <td></td></tr><tr><td>IX70</td><td>Olympus</td><td></td><td>Richiedi un Preventivo</td></tr><tr><td>Microscopio Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td>Richiedi un Preventivo</td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>dinale Microscopia elettronica Science</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Richiedi un preventivo</td></tr><tr><td>LSRII SORP/citometria a flusso</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td></td><td>Richiedi un preventivo</td></tr></tbody></table>

visualizzazione di il-22 che esprimono linfociti utilizzando topi reporter

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

topi reporter sono stati ampiamente utilizzati per osservare la localizzazione di espressione dei geni target. Questo protocollo si concentra su una strategia per stabilire un nuovo modello di topo transgenico giornalista. Abbiamo scelto di visualizzare interleuchina (IL) 22 genica perché questa citochina ha importanti attività nell&#39;intestino, dove contribuisce a riparare tessuti danneggiati da infiammazione. Sistemi Reporter offrono notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dei prodotti in vivo. Nel caso di IL-22, altri studi avevano prima isolato cellule dai tessuti e poi ri-stimolate le cellule in vitro. IL-22, che è normalmente secreta, è stato intrappolato all&#39;interno delle cellule usando un farmaco e la colorazione intracellulare è stato usato per visualizzarla. Questo metodo identifica le cellule capaci di produrre IL-22, ma non ne determina che facevano così in vivo. Il design giornalista comprende l&#39;inserimento di un gene per una proteina fluorescente (tdTomato) nel IL-22 gene in tale way che la proteina fluorescente non può essere secreto e quindi rimane intrappolata all&#39;interno delle cellule che producono in vivo. Produttori fluorescenti possono quindi essere visualizzati in sezioni di tessuto o ex vivo analisi tramite citometria a flusso. Il processo di costruzione vera e propria per il giornalista incluso recombineering un cromosoma artificiale batterico che conteneva il gene IL-22. Questo cromosoma multistrato è stato poi introdotto nel genoma del mouse. Omeostatico IL-22 espressione reporter è stato osservato in diversi tessuti di topo, tra cui la milza, timo, linfonodi, le placche di Peyer, e intestino, mediante citometria a flusso di analisi. La colite è stata indotta da cellule T (CD4 + CD45RBhigh) di trasferimento, ed espressione reporter è stato visualizzato. Le cellule T positive erano prima presenti nei linfonodi mesenterici, e quindi hanno accumulato all&#39;interno della lamina propria delle piccole tessuti dell&#39;intestino e del colon distale. La strategia con BAC ha dato espressione giornalista buona fedeltà rispetto a IL-22 Expressione, ed è più semplice di procedure knock-in.

Un murino IL-22 giornalista transgene è stata creata usando recombineering per modificare un cromosoma artificiale batterico portando la IL-22 locus. La figura 1 mostra uno schema di pBACe3.6 vettore contenente il gene sacBII, un indicatore positivo-selezione, e cloramfenicolo antibiotico gene di resistenza 11. Dopo aver introdotto tdTomato in esone 1, la sequenza di peptide segnale è stato interrotto, come mostrato nella Figura 2...

Descriviamo qui un modello di topo reporter transgenico per visualizzare le cellule produttrici di IL-22 all'interno di diversi tessuti di topo. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la posizione di altre citochine o proteine secretarie nel topo.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

L'obiettivo generale di questa procedura di modificazione genetica del topo è identificare, purificare e caratterizzare le cellule immunitarie produttrici di IL-22. Le cellule del sistema immunitario rilasciano mediatori chiamati citochine che sono responsabili della difesa da agenti estranei come i batteri e del ripristino dei tessuti danneggiati. L'IL-22 è una di queste citochine e le sono state attribuite molte attività che vanno dalla riparazione dei tessuti alla patologia.E un certo numero di diversi tipi di cellule nel sistema immunitario sono stati segnalati per essere in grado di produrlo. Quindi, per chiarire quali cellule producono effettivamente IL-22, abbiamo sviluppato un nuovo topo reporter IL-22. Questo ci ha permesso di identificare i produttori rilevanti di IL-22 in vivo nei topi in condizioni normali e in un modello di malattia infiammatoria intestinale.Abbiamo anche utilizzato cellule reporter per purificare gli espressori di IL-22 per determinare le loro altre proprietà. Viene brevemente delineato il metodo di generazione dei topi reporter e vengono descritti i metodi di analisi. I metodi descritti possono essere applicati ad altri geni allo scopo di identificar

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

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Immunologia e Infezioni

Questa procedura descrive l'individuazione e isolamento di mouse leucociti TH17 che attivamente secernono IL-17 sulla stimolazione.

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

L'imaging intravitale stabile ad alta risoluzione delle cellule immunitarie nel fegato è impegnativo. Qui forniamo un metodo altamente sensibile e affidabile per studiare la migrazione e le interazioni cellula-cellula delle cellule immunitarie nel fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) mediante microscopia a scansione laser multifotone intravitale in combinazione con il monitoraggio della terapia intensiva.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Il metodo descritto qui consente la visualizzazione dell'attivazione dell'infiammazione dipendente dal promotore IL-8 nei polmoni dei topi attraverso la bioluminescenza non invasiva (BLI). Lo stesso animale può essere sottoposto a più volte BLI per un massimo di due mesi a partire dal momento della consegna del costruttore di reporter luciferasi.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di reporter che può essere utilizzato per identificare e quantificare le interazioni recettore-ligando.

Un sistema di BW Reporter per lo studio di interazioni recettore-ligando

Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.

Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Qui, descriviamo un semplice metodo di imaging confocale per visualizzare la localizzazione in situ delle cellule che secernono la gamma di interferone citochina negli organi linfoidi secondari murini. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di altre citochine in tessuti diversi.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2), implicate nell'infiammazione di tipo 2, partecipano principalmente alla risposta all'infezione da elminti, alle malattie allergiche, all'omeostasi metabolica e alla riparazione dei tessuti. In questo studio, viene dimostrata una procedura per isolare le ILC2 dalla mucosa nasale murina e rilevare l'espressione di CD226.

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

Le cellule T e ILC2 che esprimono IL-9 sono indotte durante l'infezione da N. brasiliensis , ma la loro caratterizzazione è stata ampiamente trascurata nell'intestino infetto a causa della loro bassa frequenza e cinetica differenziale. Questo protocollo descrive l'isolamento di queste cellule da diversi organi bersaglio e la conferma della loro identità tramite citometria a flusso in diversi stadi di infezione.

Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis

Descriviamo un metodo per utilizzare i linfociti infiltranti il tumore (TIL) dai topi attraverso la citometria a flusso per il trasferimento di cellule adottive. Questo protocollo mira a verificare la citotossicità specifica dei TIL contro i tumori in un modello murino di carcinoma pancreatico singenico, fornendo informazioni sullo sviluppo di terapie cellulari adottive per il cancro del pancreas.

Isolamento basato sulla citometria a flusso e valutazione terapeutica dei linfociti infiltranti il tumore in un modello murino di carcinoma pancreatico

Scopri come visualizzare i linfociti produttori di IL-22 utilizzando topi reporter transgenici. Questo metodo consente di tracciare le citochine in vivo nei tessuti murini e di studiare le risposte immunitarie in condizioni fisiologiche e patologiche.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

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