Name: La tecnica del rene perfusi mouse isolato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Impara la tecnica del rene perfuso isolato nel topo per studiare la funzione renale es vivo senza influenze sistemiche. Questo metodo consente di analizzare i meccanismi dell'insufficienza renale acuta in nefrologia.

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Gli autori desiderano ringraziare Hans-Joachim Schurek per l'inestimabile consiglio scientifico. Gli autori ringraziano Monique Carrel e Michèle Heidemeyer per l'eccellente assistenza tecnica, David Penton Ribas e Nourdine Faresse per la lettura critica del manoscritto e Carsten Wagner e Jürg Biber per l'anticorpo NaPi-2a. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro nazionale svizzero di competenza per la ricerca "Kidney.CH" e da una sovvenzione per il progetto (310030_143929/1) del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali descritti in questo manoscritto sono stati condotti secondo il diritto svizzero e approvati dall&#39;amministrazione veterinario del Cantone di Zurigo, Svizzera. 1. Preparazione Buffer <ol><li> Preparare soluzioni 1 - 4 e la soluzione ormone antidiuretico (ADH) (Tabella 1). </li><li> Preparare il tampone di dialisi (Tabella 1). NOTA: Questo è il buffer utilizzato come tampone di dialisi durante la perfusione. Successivamente, gli eritrociti vengono diluiti in questo tampone per formare il perfusato finale. </li><li> preparazione degli eritrociti. <ol><li> Diluire 250 ml di concentrato di eritrociti umani (materiale testato ottenuto dalla banca locale del sangue) a 500 ml con tampone di dialisi. Centrifugare a 2.000 g per 8 minuti. Rimuovere il tampone, facendo attenzione a non rimuovere eventuali eritrociti. Ripetere 3x. </li></ol></li><li> Preparare la (albumina sierica bovina; BSA) l&#39;albumina del buffer. <ol><li> In 200 ml di dialysibuffer di s, sciogliere 44 g di BSA con un ancoretta. Filtrare la soluzione con carta da filtro. </li></ol></li><li> Preparare il perfusato. <ol><li> Filtrare le eritrociti dal punto 1.3.1 attraverso carta da filtro nel buffer BSA. Riempire fino ad un volume totale di 800 ml con tampone di dialisi. NOTA: Questo è il perfusato finale. L&#39;ematocrito dovrebbe essere compresa tra 8 e 12%. Il perfusato può essere conservato per un massimo di 12 ore a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Avvio Dialisi e l&#39;ossigenazione <ol><li> Accendere bagnomaria circonda il serbatoio più grande del buffer, più piccolo serbatoio tampone, e la camera umida (una piccola camera doppia parete portata a 37 ° C e 100% di umidità per mantenere entro il rene) a 37 ° C (figura 2) . </li><li> Riempire il serbatoio buffer maggiore con il tampone di dialisi e il serbatoio più piccolo con perfusato. </li><li> Accendere il 5% di CO 2/95% O 2 afflusso di gas al tampone di dialisi. </li><li> Accendere dialisi continua del perfusato contro il tampone di dialisi. Fate attenzione ad usare a basso flusso tubo di dialisi. Passare al punto 3. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Figura 2: Schema del circuito di perfusione. Schema mostra i principali componenti del circuito di perfusione e la direzione del flusso buffer. Tutti i componenti circondato da blu scuro vengono mantenute a 37 ° C con un bagno di acqua / termostato. 1: Dialisi tampone di almeno 3 volte il volume del buffer di perfusione è continuamente gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2. 2: Dialisi buffer e buffer di perfusione sono continuamente dializzati contro l&#39;altro in un tubo di dialisi da una pompa a rulli. 3: througho costante Per questo la dialisi, il buffer di perfusione è arricchito con 9% O 2/5% di CO 2 ed elettroliti livelli sono mantenutiut perfusione. 4: Una pompa rullo spinge il buffer di perfusione verso il rene. 5: Un windkessel rimuove onde peristaltiche e agisce come una trappola bolla. 6: trasduttore di pressione (collegato a 4. (pompa roller) per mantenere una pressione continua pur consentendo flusso liberamente alternata). 7: Durante la perfusione, il rene rimane in una camera umida per 100% di umidità e temperatura di 37 ° C renale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3. Procedura chirurgica Part 1 (per un diagramma di tutte le legature, vedi Figura 3) Nota: Eseguire tutte le legature utilizzando 5-0 filo chirurgico. <ol><li> Anestetizzare un topo mediante iniezione intraperitoneale (10 ml / g di peso corporeo, 20 mg / ml di ketamina e 1 mg / ml xilazina disciolto in 0,9% NaCl). Confermare la sufficiente profondità di AnesthESIA testando per l&#39;assenza di riflessi retro-piede. </li><li> Fissare il mouse in posizione supina nella camera umida. Proteggere gli occhi con vet unguento. Inserire una siringa da 1 ml di sotto della colonna vertebrale per elevare i vasi lombari. </li><li> Eseguire una laparotomia mediana dalla cresta pubica per l&#39;apertura dello sterno prima la pelle, poi i muscoli addominali, con le forbici. </li><li> Rimuovere l&#39;intestino e posizionarlo sul lato sinistro del laterali del mouse dall&#39;addome. </li><li> Liberare la vescica da tessuto connettivo e di esplorare entrambi gli ureteri e l&#39;uretra. </li><li> Mettere una legatura intorno dell&#39;uretere sinistro (I legature). Chiudilo. </li><li> Inserire una legatura intorno all&#39;uretra (legature II). Chiudilo. </li><li> Posizionare un &quot;laccio&quot; legatura in giro per tutta la vescica (legature III). </li><li> Incidere la vescica 1 mm. </li><li> Incannulare l&#39;apertura cm 2 PE 50 tubi. </li><li> Chiudi legatura III attorno al tubo. </li><li> Tagliare l&#39;uretere sinistro e dell&#39;uretra distale dalle legature. il bladder è ora attaccato al dell&#39;uretere solo a destra e liberi di muoversi. </li><li> Cancellare l&#39;aorta addominale del tessuto connettivo e il grasso. </li><li> Inserire un addominale legatura metà dell&#39;aorta (legature IV). </li><li> Inserire una legatura intorno all&#39;aorta sotto il diaframma tra l&#39;arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco (legature V). </li><li> Mettere una legatura intorno all&#39;arteria mesenterica superiore (legature VI). </li><li> Inserire un legatura aortica direttamente sotto destra e sopra l&#39;arteria renale sinistra (VII legatura). </li><li> Mettere una legatura attorno al pacchetto caudale vena (cava) (VIII legature). Passare al punto 4. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Figura 3: Schema del Legature poste durante l&#39;intervento chirurgico. Vista dell&#39;addome aperto dopo la laparotomia. L&#39;intestino viene spostato verso sinistra. L e R indicano il rene sinistro e destro. Illinee nere mostrano l&#39;area della rispettiva legatura. Legature prima immissione e poi chiusi, nella sequenza indicata nel testo. X indica la posizione di incisione per dell&#39;aorta cannulazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 4. Adescamento del circuito di perfusione <ol><li> Avviare la pompa rotativa e riempire il tubo con perfusato. Fare attenzione a svuotare tutte le bolle d&#39;aria da esso. </li><li> Riempire il dispositivo windkessel a circa la metà del livello con perfusato. </li><li> Calibrare il trasduttore di pressione a 0 mm Hg quando tutti i tubi è riempita e il flusso è 0. Tenere l&#39;ago perfusione a livello renale durante questo periodo. </li><li> Mantenere il flusso ad un livello minimo costante (0,6 ml / min) e passare al punto 5. </li></ol> 5. Procedura chirurgica Parte 2 <ol><li> Posizionare un morsetto tra la legatura IV e la ramificazione della rena sinistral arteria. </li><li> Fai una piccola incisione nella caudale dell&#39;aorta di legatura IV, avendo cura di non tagliare la parete dorsale. </li><li> Dilata l&#39;apertura in aorta con un dilatatore vascolare. </li><li> Incannulare l&#39;aorta con un ago (2 cm di lunghezza, tirato PE 50), spingendo la punta solo al morsetto. </li><li> Aprire il morsetto. </li><li> Inserire la punta di un ago cranialmente fino a raggiungere il bivio dell&#39;arteria rene destro e l&#39;aorta. </li><li> Chiudere la legatura VII. </li><li> Chiudere la legatura IV. </li><li> Aprite la cassa con le forbici dalla dissezione del diaframma. Con un unico taglio, separare l&#39;aorta, vena cava, cuore e nervi vegetativi. Con questo passo, l&#39;animale viene sacrificato via rapida dissanguamento in anestesia profonda continua. </li><li> Avviare il controllo della pressione della pompa di perfusione. Mantenere la pressione media tra 80 e 100 mmHg. </li><li> Chiudi V. legatura </li><li> Chiudere la legatura VI. </li><li> Chiudere la legatura VIII. </li><li> Libero il diritto rene da tissu connettivoe e la sua incorporazione nella capsula adiposa con le forbici. </li><li> Tagliare l&#39;aorta prossimale di legatura V. </li><li> Tagliare l&#39;arteria mesenterica superiore distale di legatura VI. </li><li> Tagliare il fascio nave rene-out di supporto, avendo cura di non tagliare in vasi stessi. </li><li> Tagliare il fegato al collegamento al rene. Fare attenzione per liberare il rene, ma lasciare una piccola parte del aderenti fegato ad esso, in modo che la vena cava viene mantenuto aperto da esso. </li><li> Prendere il fascio di rene di topo. Rimuovere il mouse dalla camera umida. </li><li> Posizionare un &quot;laccio&quot; legatura attorno al collegamento di fegato e rene (legature IX). </li><li> Incannulare la vena cava con una linea venosa (2 centimetri PE 50). </li><li> Chiudere la legatura IX. deflusso venoso attraverso la linea venosa dovrebbe iniziare immediatamente. </li><li> Chiudere la camera umida. </li></ol> 6. Le analisi a valle <ol><li> Durante l&#39;ora successiva, monitorare continuamente il flusso di sangue e intravasculpressione ar 15. Raccogliere deflusso venoso, che può essere utilizzato per l&#39;analisi, ad esempio, renale rilascio di renina 7. Raccogliere le urine per l&#39;analisi della concentrazione di elettroliti e velocità di filtrazione glomerulare 14. Dopo 1 ora di perfusione, i reni possono essere snap-congelati per blotting occidentale o essere fissati per l&#39;imaging approcci 16. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti e nient'altro da rivelare.

Il mouse isolato rene perfuso è uno strumento per lo studio della funzione renale in un ambiente controllato ex-vivo per 1 ora, colmando il divario tra esperimenti in vivo su animali intatti, che può essere viziata da l&#39;impatto di numerosi fattori sistemici, e in esperimenti in vitro in nefrone isolati o cellule in coltura, che necessariamente trascurare l&#39;impatto della struttura dell&#39;organo intatta sulla funzione. C&#39;è, alla conoscenza degli autori, non tecnica alterna...

La perfusione isolata di organi è stato oggetto di uno sforzo continuo tra fisiologi per molti decenni 1. La tecnica consente la funzione dell&#39;organo, senza influenze sistemiche come la pressione sanguigna, ormoni, o nervi, da studiare. Carl Eduard Loebell è considerato il primo ad aver descritto la perfusione successo di un rene isolato, nel 1849 2. Da allora, l&#39;apparato perfusione ha subito notevole raffinatezza. Frey e Gruber ha introdotto un polmone artificiale per le pompe di ossigenazione e pulsatile per continua perfusione 2. Mentre i primi ricercatori hanno studiato principalmente i reni di grandi mammiferi, cioè, maiali e cani 2 3 -la prima relazione l&#39;uso di reni di ratto, di Weiss et al. , È stata una pietra miliare nello studio della perfusione piccolo-mammifero-organo 4. Schurek et al. riferito la necessità di aggiungere eritrociti di mammifero al perfusato se tubulare renale sufficienteossigenazione doveva essere raggiunto 5. Critico per esperimenti di lunga durata è stata l&#39;introduzione della dialisi continua del buffer dallo stesso gruppo di ricerca 6. Nel 2003, Schweda et al. sono stati i primi a segnalare un rene del mouse funzionale isolato perfuso (MIPK) 7, in seguito perfezionato da Rahgozar et al. 18 e Lindell et al. 14. Mentre tecnicamente più impegnativo rispetto al ratto isolato rene perfuso, l&#39;uso del MIPK porta il vantaggio di permettere l&#39;uso di una vasta gamma di topi geneticamente modificati. Questo documento presenta i dettagli del metodo degli autori per la perfusione isolata reni del mouse per 1 ora. Il metodo consente la valutazione continua della velocità di flusso renale, resistenza vascolare, rilascio di ormone, emogasanalisi, analisi delle urine, e l&#39;applicazione di farmaci. Seguendo la procedura, reni potrebbero essere trattati per analisi molecolari e biochimiche, fissati per la microscopia, otrapiantato in un topo ricevente (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Figura 1: panoramica dei possibili Input / Output al rene isolato e perfuso. BGA: analisi dei gas del sangue. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Questa tecnica probabile che riceverà maggiore attenzione nei prossimi anni, come molte applicazioni innovative sono in discussione con l&#39;alba di una prolungata perfusione del rene normotermico prima del trapianto (con o senza l&#39;applicazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing) 8, 9, 10 , 11, la bioingegneria di interi reni da impalcature decellularized 12, e l&#39;applicazione di elevate dosi di coloranti fluorescenti per l&#39;imaging multiphoton 13 </sup&gt;. E &#39;anche un modello ideale con cui studiare il ruolo di specifici geni durante il danno renale acuto 14. Un protocollo step-by-step è dato per consentire ad altri laboratori di eseguire isolato mouse perfusione del rene con successo. Innanzitutto, è specificato la composizione e preparazione del buffer. Quindi, l&#39;intervento è descritto in dettaglio e sono presenti i punti critici. In terzo luogo, i dati vengono presentati che sono rappresentativi di una preparazione di successo: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, velocità di filtrazione glomerulare, e degli elettroliti frazionaria misurazioni funzionali di vitalità e di elettroni trasmissione micrografie della morfologia dei diversi segmenti nefrone di reni perfusi tutti escrezione- fisso dopo 1 ora di perfusione.

<table><tbody><tr><td>Circuito di perfusione:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera umida 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannulare con cestello e porta laterale</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Termostato TC120-ST5&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Pompa a rulli Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio rivestito per soluzione tampone 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio rivestito per soluzione tampone 0,5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore di pressione APT300&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controller</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>Acquisizione dati HSE-USB</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Dializzatore a basso flusso Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in PE per incannulamento dell'aorta 1,19 mm D.I. x 1,70 mm O.D.</td><td>Materie prime scientifiche Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagenti tampone:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmatico 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico sale monosodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Acido malico sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodio-L-Lattato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>acido alfa-chetoglutarico sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ormone antidiuretico dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro utilizzato per la filtrazione degli eritrociti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analisi:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometro medico ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> ...

la tecnica del rene perfusi mouse isolato

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

L&#39;isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. Questo è un prerequisito per lo studio della fisiologia dell&#39;organo isolata e per molte applicazioni innovative che possono essere possibile in futuro, tra perfusione decellularization per la bioingegneria reni o la somministrazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing in dosi elevate per innescare il rene per il trapianto. Durante il tempo della perfusione, il rene può essere manipolato, funzione renale può essere valutata, e vari farmaci somministrati. Dopo la procedura, il rene può essere trapiantato o trasformati per la biologia molecolare, l&#39;analisi biochimica, o al microscopio. Questo articolo descrive il perfusato e la tecnica chirurgica necessaria per la perfusione ex vivo di reni mouse. Dettagli dell&#39;apparato perfusione sono date e dati sono presentati mostra la vESPONSABILITÀ di preparazione del rene: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, e delle urine dati come, microscopio elettronico di trasmissione funzionali dei diversi segmenti del nefrone come letture morfologiche, e le macchie occidentali di proteine ​​di trasporto dei diversi segmenti del nefrone come lettura molecolare.

Con il metodo descritto, isolati reni mouse possono rimanere vitali per almeno 1 ora. Abbiamo testato la vitalità del tessuto dopo 1 ora di perfusione continua con funzionale (flusso ematico renale e la resistenza vascolare, analisi dei gas del sangue del deflusso venoso, velocità di filtrazione glomerulare, urinario frazionata Na + e K + escrezione, e nelle urine osmolalità) e morfologica (elettronico a trasmissione microscopia, TEM) metodi in quattro reni di tipo ...

L&#39;isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. I buffer e tecnica chirurgica sono descritte in dettaglio.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è analizzare la funzione renale isolata in un rene di topo perfuso ex vivo. Escludendo l'influenza della pressione sanguigna, degli ormoni o del sistema nervoso autonomo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali della Nefrologia.Fornisce informazioni sul funzionamento dell'organo isolato e rappresenta uno strumento elegante per lo studio del danno renale acuto. Il principale vantaggio del IPK è che la funzione organica viene studiata in assenza di influenze sistemiche. Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico, utilizzando forbici, eseguire una laparotomia media dal pube allo sterno.Aprire innanzitutto la pelle, quindi i muscoli addominali. Successivamente, rimuovere gli intestini e posizionarli sul lato sinistro del topo, lateralmente rispetto all'addome. Ora, liberare la vescica dal tessuto connettivo ed esporre entrambi gli ureteri e l'uretra.Per queste procedure, posizionare tutti i legami utilizzando suture 5-0. Il primo legame da posizionare è intorno all'uretere sinistro. Chiuderlo saldamente con un nodo chirurgico doppio.Successivamente, posizionare una legatura intorno all'uretra utilizzando la stessa tecnica. Quindi, posizionare una legatura a laccio intorno all'intera vescica, ma lasciarla non annodata. Con i primi tre punti in sede, utilizzare forbici a occhiello per praticare un'incisione lunga un millimetro nella vescica.In questa incisione, inserire una cannula realizzata con due centimetri di tubo PE-50. Ora chiudere il legaccio che assicura la vescica, fissando la cannula. Con la vescica già cannulata, recidere ora l'uretere sinistro e l'uretra a valle dei legacci.La vescica dovrebbe ora essere attaccata solo all'uretere destro e dovrebbe muoversi liberamente. Successivamente, rimuovere i tessuti connettivi e il grasso che circondano l'aorta addominale. Quindi posizionare delle legature attorno al punto mediano dell'aorta esposta e appena al di sotto del diaframma, tra l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco.Mantenere anche ciascuno di questi lassi. Successivamente, posizionare una legatura attorno all'arteria mesenterica superiore. Ora, posizionare una terza legatura attorno all'aorta direttamente al di sotto dell'arteria renale destra e al di sopra dell'arteria renale sinistra.Questa è la legatura numero sette. Infine, posizionare una legatura attorno al pacchetto della vena caudale. Posizionare ora una pinza tra la legatura numero sette e la biforcazione dell'arteria renale sinistra.Quindi, effettuare una piccola incisione nell'aorta, caudalmente al legaccio sette, avendo cura di non recidere la parete dorsale e allargare l'apertura con un dilatatore vascolare. Inserire nell'apertura una cannula PE-50 lunga due centimetri e precedentemente affusolata, spingendo la punta appena all'interno della pinza. Successivamente, aprire la pinza.Successivamente, spingere in avanti la punta dell'ago fino a raggiungere la giunzione tra l'arteria renale destra e l'aorta. Ora chiudere il legaccio sette, quindi chiudere il legaccio al punto medio dell'aorta addominale. Procedere aprendo il torace con le forbici, dissezionando il diaframma.Quindi, con un singolo taglio, separare l'aorta, la vena cava, il cuore e i nervi vegetativi. Ora, iniziare il controllo della pressione della pompa di perfusione e mantenere la pressione media tra 80 e 100 millimetri di mercurio. Ora, chiudere i tre legami rimanenti non ancora legati intorno al pacchetto dell'aorta e della vena caudale.Utilizzando le forbici, liberare il rene destro dal tessuto connettivo circostante e rimuoverlo dalla capsula adiposa. Tagliare l'aorta in senso prossimale al legamento tra l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco. Successivamente, tagliare l'arteria mesenterica superiore in senso distale al legamento intorno all'arteria mesenterica superiore.Ora, rimuovere il fascio di vasi di sostegno del rene, facendo attenzione a non tagliare i vasi stessi. Successivamente, tagliare il fegato nel punto di connessione con il rene, lasciando una piccola parte di fegato attaccata ad esso, in modo che la vena cava rimanga aperta grazie a questa porzione. Il passo successivo consiste nel rimuovere il fascio renale dal topo.Ora, lasciare il rene nella camera e rimuovere il topo. All'attaccatura tra fegato e rene, posizionare una legatura a laccio. Quindi, cannuilare la vena cava con una linea venosa e chiudere la legatura a laccio.Il rene dovrebbe ora essere posizionato stabilmente nella scatola. Il deflusso venoso attraverso la linea venosa dovrebbe iniziare immediatamente. Il deflusso urinario inizierà dopo circa tre minuti.La peristalsi dell'uretere dovrebbe iniziare immediatamente e rimanere stabile per almeno un'ora. Chiudere la scatola. La preparazione è ora completata e dovrebbe rimanere valida per almeno un'ora.Dopo aver applicato il metodo descritto su topi C57 black 6, è stata valutata la vitalità tissutale di quattro reni dopo un'ora di perfusione continua. La pressione è stata mantenuta costantemente a 100 millimetri di mercurio. Il flusso del perfusato e la resistenza vascolare sono rimasti stabili in tutti e quattro i reni.La velocità di filtrazione glomerulare è stata valutata mediante la clearance della inulina marcata con FITC, destinata ad aumentare nel tempo ma non in modo significativo. L'escrezione frazionaria di sodio e potassio è stata valutata dopo 55 minuti di perfusione. Questi parametri sono aumentati rispetto alla situazione in vivo.Dopo 55 minuti, la molalità delle urine non superò l'osmolalità del deflusso venoso. I reni furono quindi fissati e la loro ultrastruttura fu valutata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I glomeruli nei segmenti S1 dei tubuli prossimali apparivano per lo più inalterati.Alcuni, ma non tutti, segmenti S2 e S3 dei tubuli prossimali nelle anse di Henle spesse che non erano vicini ai fasci vascolari mostravano segni di danno organico. Un'analisi più approfondita ha rivelato che i tubuli contorti distali e i dotti collettori non presentavano segni di necrosi. Nel complesso, i reni rispecchiavano quanto riportato per reni isolati perfusi di ratto.Dopo aver eseguito questa procedura, si possono effettuare sui tessuti analisi come l'imaging o analisi di proteine o RNA per ottenere ulteriori informazioni.

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