La tecnica del rene perfusi mouse isolato

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare la funzione renale isolata in un rene di topo perfuso ex vivo. Escludendo l'influenza della pressione sanguigna, degli ormoni o del sistema nervoso autonomo. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave della nefrologia.

Dando l'interno alla funzione di organi isolati e fungendo da strumento elegante per studiare il danno renale acuto. Il vantaggio principale dell'IPK è che la funzione degli organi viene studiata in assenza di influenze sistemiche. Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico, utilizzando le forbici, eseguire una laparotomia media dalla cresta pubica allo sterno.

Prima apri la pelle e poi i muscoli addominali. Successivamente, rimuovi gli intestini e posizionali sul lato sinistro del topo, lateralmente all'addome. Ora, libera la vescica dal tessuto connettivo ed esponi sia gli ureteri che l'uretra.

Per queste procedure, posizionare tutte le legature utilizzando suture 5-0. La prima legatura da posizionare è intorno all'uretere sinistro. Chiudete bene con un doppio nodo chirurgico.

Quindi, posiziona una legatura attorno all'uretra usando la stessa tecnica. Quindi, posiziona una legatura lazo attorno a tutta la vescica, ma lasciala slegata. Con le prime tre suture in posizione, usa le forbici per gli occhi per praticare un'incisione lunga un millimetro nella vescica.

In questa incisione, posizionare una cannula composta da due centimetri di tubo PE-50. Ora chiudi la legatura che lacera la vescica, fissando la cannula. Con la vescica incannulata, tagliare ora l'uretere sinistro e l'uretra distale dalle legature.

La vescica dovrebbe ora essere attaccata solo all'uretere destro e dovrebbe muoversi liberamente. Quindi, rimuovere i tessuti connettivi e il grasso che circondano l'aorta addominale. Quindi posizionare le legature attorno al punto medio dell'aorta esposta e appena sotto il diaframma tra l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco.

Tenete anche ciascuno di questi allentati. Quindi, posiziona una legatura attorno all'arteria mesenterica superiore. Ora, posiziona una terza legatura attorno all'aorta direttamente sotto l'arteria renale destra e sopra l'arteria renale sinistra.

Questa è la legatura numero sette. Infine, metti una legatura attorno al pacchetto della vena caudale. Ora posiziona una pinza tra la legatura numero sette e la ramificazione dell'arteria renale sinistra.

Quindi, praticare una piccola incisione nell'aorta, caudale alla legatura sette, facendo attenzione a non tagliare la parete dorsale e allungare l'apertura con un dilatatore del vaso. Nell'apertura, inserire una cannula in PE-50 tirata di due centimetri, spingendo la punta appena nel morsetto. Quindi, aprire il morsetto.

Quindi, spingere la punta dell'ago cranialmente fino a raggiungere la giunzione dell'arteria renale destra e dell'aorta. Ora chiudi la legatura sette, quindi chiudi la legatura nel punto medio dell'aorta addominale. Procedere aprendo il torace con le forbici sezionando il diaframma.

Quindi, con un solo taglio, separare l'aorta, la vena cava, il cuore e i nervi vegetativi. Ora, avviare il controllo della pressione della pompa di perfusione e mantenere la pressione media tra 80 e 100 millimetri di mercurio. Ora, chiudi le tre legature libere rimanenti attorno all'aorta e al pacchetto della vena caudale.

Usando le forbici, liberare il rene destro dal tessuto connettivo circostante e liberarlo dalla capsula adiposa. Tagliare l'aorta prossimalmente alla legatura tra l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco. Quindi, tagliare l'arteria mesenterica superiore distalmente alla legatura attorno all'arteria mesenterica superiore.

Ora, rimuovere il fascio di vasi di supporto per i reni, facendo attenzione a non tagliare i vasi stessi. Quindi, taglia il fegato in corrispondenza della connessione con il rene, ma lascia una piccola parte del fegato attaccata ad esso, in modo che la vena cava sia tenuta aperta da esso. Il prossimo passo è rimuovere il fascio renale dal topo.

Ora, lascia il rene nella camera e rimuovi il topo. Alla connessione tra fegato e rene, posizionare una legatura lazo. Quindi, incannulare la vena cava con una linea venosa e chiudere la legatura del lazo.

Il rene dovrebbe ora essere posizionato stabilmente nella scatola. Il deflusso venoso attraverso la linea venosa dovrebbe iniziare immediatamente. Il deflusso dell'urina inizierà dopo circa tre minuti.

La peristalsi dell'uretere deve iniziare immediatamente e rimanere stabile per almeno un'ora. Chiudi la scatola. La preparazione è ora completa e dovrebbe rimanere vitale per almeno un'ora.

Dopo aver utilizzato il metodo descritto su topi C57 black 6, la vitalità tissutale di quattro reni è stata testata dopo un'ora di perfusione continua. La pressione è stata mantenuta a 100 millimetri continui di mercurio. Il flusso di perfusato e la resistenza vascolare sono rimasti costanti in tutti e quattro i reni.

La velocità di filtrazione glomerulare è stata valutata utilizzando la clearance dell'inulina FITC, destinata ad aumentare nel tempo, ma non in modo significativo. L'escrezione frazionata di sodio e potassio è stata valutata dopo 55 minuti di perfusione. Questi parametri sono aumentati rispetto alla situazione in vivo.

Dopo 55 minuti, la molalità degli orinatoi non superava l'osmolalità del deflusso venoso. I reni sono stati quindi fissati e la loro ultrastruttura è stata valutata con TEM. I glomeruli nei segmenti S1 dei tubuli prossimali apparivano in gran parte inalterati.

Alcuni, ma non tutti i segmenti S2 e S3 dei tubuli prossimali negli arti ascendenti spessi che non erano vicini ai fasci vascolari mostravano segni di danno d'organo. A un esame più attento, i tubuli contorti distali e i dotti collettori non mostravano segni di necrosi. Nel complesso, i reni rispecchiavano quanto riportato per i reni perfusi isolati nei ratti.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi di analisi come l'imaging o i fatti seguiti dall'analisi delle proteine o dell'RNA sul tessuto per ottenere ulteriori informazioni.