Name: Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in In Vitro modelli di cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri come rilevare varianti di splicing aberranti associate alla resistenza ai farmaci in modelli di tumori solidi e malignità ematologiche. Questo metodo combina screening di citotossicità e analisi trascrittomica RNA-seq per migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base del fallimento della chemioterapia.

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Gli autori ringraziano il prof. J.J. McGuire, il prof. R. Kofler e il dr. K. Quint per aver fornito le linee cellulari resistenti utilizzate in questo lavoro. Lo studio è stato finanziato con sovvenzioni dalla Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (a JC, EG e RS), dalla fondazione KiKa (Children Cancer-free grant for AW), dalla Law Offices of Peter G. Angelos Grant dalla Mesothelioma Applied Research Foundation (a VEG e EG), dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), dall'Istituto Toscano Tumori (ITT), e Regione Toscana Bando FAS Salute (a EG).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive un nuovo approccio che combina tecniche di screening di citotossicità consolidate e potente trascrittomica NGS a base di analisi per identificare eventi di splicing differenziali in relazione alla resistenza ai farmaci. Analisi spettrofotometriche sono metodi high-throughput convenienti e affidabili per valutare la sensibilità ai farmaci in modelli tumorali in vitro e rappresentano la prima scelta per molti laboratori che effettuano proiezioni di citotossicità. Risoluzione dei problemi così come...

Nonostante i notevoli progressi nel trattamento del cancro, la resistenza delle cellule maligne alla chemioterapia, sia intrinseco o acquisito in seguito ad esposizione al farmaco prolungata, è il motivo principale per il fallimento del trattamento in una vasta gamma di leucemie e tumori solidi 1. Al fine di delineare i meccanismi alla base della resistenza ai farmaci, in modelli in vitro di linee cellulari sono stati sviluppati da selezione graduale di cellule tumorali resistenti agli agenti chemioterapici. Questa procedura imita i regimi utilizzati nelle impostazioni cliniche e permette quindi a un&#39;indagine approfondita dei meccanismi di resistenza rilevanti. Cellule resistenti che sopravvivono al trattamento sono poi distinti da cellule sensibili parentali utilizzando saggi di vitalità cellulare / citotossicità 2. In profili di resistenza ai farmaci in vitro di cellule primarie hanno dimostrato di essere significativamente correlata alla risposta clinica alla chemioterapia 3. High-throughput cytotosaggi tossicità costituiscono un metodo conveniente per determinare la sensibilità ai farmaci in vitro. Qui, la vitalità delle cellule è valutata per esempio 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromide - MTT assay 4, che si basa sulla conversione metabolica di alcuni substrati (cioè, sali di tetrazolio) in prodotti colorati, riflettendo così l&#39;attività mitocondriale di cellule. In alternativa, il contenuto di proteina cellulare può essere quantificata usando il saggio 5 sulforodamina B (SRB). Qui, il numero di cellule vitali è proporzionale alla densità ottica (OD) misurata ad una lunghezza d&#39;onda appropriata in uno spettrofotometro, senza bisogno di ampio e che richiede tempo procedure di conteggio delle cellule. L&#39;inibizione della crescita indotto da un certo farmaco chemioterapico può essere calcolato sulla base del diametro esterno dei pozzetti in cui le cellule sono state trattate con un agente di prova e comparati con il diametro esterno di cellule di controllo non trattate. Una curva dose-risposta è obtained tracciando concentrazioni di farmaco rispetto a percentuali di cellule vitali relativi alle cellule di controllo. Infine, la sensibilità ai farmaci può essere riportato come la concentrazione che provoca il 50% di inibizione della crescita cellulare rispetto alle cellule non trattate (IC 50). I meccanismi alla base della resistenza ai farmaci includono molte anomalie differenti, come alterazioni influenzano l&#39;espressione genica dei determinanti di attività di droga e il metabolismo cellulare. Queste lesioni molecolari, tra cui le mutazioni, aberrazioni ad un trascrizionale e livello post-trascrizionale, nonché regolazione epigenetica disturbato spesso colpiscono geni coinvolti sia nel metabolismo dei farmaci o apoptosi 6. Alternative splicing pre-mRNA e la sua regolazione intricata hanno recentemente ricevuto una notevole attenzione come un romanzo entità che possono dettare la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali 7. Fino al 95% dei geni umani sono splicing alternativo in cellule normali mediante questostrettamente regolamentato processo che produce molte isoforme di proteine ​​differenti dallo stesso gene. Splicing alternativo è spesso liberalizzato nel cancro e diversi tumori sono caratterizzati da splicing alterato di un numero crescente di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci (ad esempio, deossicitidina chinasi, sintetasi foli, o proteine multifarmaco resistenza) 6,8. Tuttavia, un&#39;analisi completa dei profili di giunzione delle cellule resistenti ai farmaci è dolorosamente carente. Pertanto, è imperativo sviluppare metodi high throughput per analisi alternative splicing. Questo potrebbe aiutare a sviluppare approcci terapeutici più efficaci. Durante l&#39;ultimo decennio, il rapido sviluppo delle tecnologie di prossima generazione di sequenziamento (NGS) ha arricchito la ricerca biomedica con nuove informazioni sui meccanismi molecolari che regolano regolazione dell&#39;espressione del genoma e il loro ruolo in vari processi biologici 9. RNA-sequenziamento (RNA-Seq) è un potente sub-applicazionedi NGS nel campo della trascrittomica. Esso consente una profilazione genome-wide (qualitativamente e quantitativamente) dei modelli di espressione di migliaia di geni contemporaneamente e ben si adatta per la caratterizzazione di nuovi mRNA codificanti così come lungo l&#39;RNA non codificante, miRNA, siRNA, e altri piccoli RNA classi (ad esempio, snRNA e Pirna) 10,11. RNA-Seq ha molti vantaggi rispetto alle tecnologie precedenti per la caratterizzazione del trascrittoma (ad esempio, Sanger sequenziamento e microarray di espressione). Essa non si basa su l&#39;annotazione del genoma esistente, ha un livello di singolo nucleotide di risoluzione e ha una gamma dinamica più ampia per la stima livello di espressione. In breve, il flusso di lavoro sperimentale di base di esperimenti di RNA-Seq è costituito da poliadenilato trascrizione (mRNA) la selezione e la frammentazione, seguita da conversione in cDNA, di costruzione di biblioteche e sequenziamento profondo, infine, massicciamente paralleli 12,13. A causa della rapida diminuzione della sequencincosti g Nel corso degli ultimi anni, l&#39;RNA-Seq sta gradualmente sostituendo le altre tecnologie e sforzi significativi sono stati fatti per migliorare i protocolli di preparazione biblioteca. Per esempio, è ora possibile per conservare le informazioni filo di trascritti di mRNA segnando il secondo filone di cDNA con deossiuridina trifosfato (dUTP) e, prima di amplificazione PCR, digerire il filo segnato con uracile-DNA-glycosilase (UDG). Questo processo aumenta la precisione di annotazione genica e stima dei livelli di espressione 14,15. L&#39;analisi e l&#39;interpretazione dei dati di RNA-Seq richiedono pacchetti software di calcolo complesse e potenti e la trasformazione delle condutture bioinformatici 16,17. In primo luogo, la cruda legge subiscono il controllo di qualità, eliminando artefatti tecnici e biologici e scartando (trimming) le sequenze che non raggiungono i requisiti di qualità rigorosi. Successivamente la legge per ogni campione sono mappati ad un genoma di riferimento e indicizzatoin gene-livello, esone livello o livello di trascrizione, per determinare l&#39;abbondanza di ciascuna categoria. A seconda dell&#39;applicazione, i dati ricercati sono poi calcolate attraverso modelli statistici per l&#39;identificazione di espressione allele-specifica, splicing alternativo, fusioni geniche e polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) 12. Infine, l&#39;analisi differenziale sul livello selezionato (cioè, l&#39;espressione genica o splicing alternativo) può essere utilizzata per confrontare campioni ottenuti in condizioni diverse. Analisi splicing differenziale descrive le differenze di utilizzo del sito di splicing tra i due campioni. Un numero crescente di pacchetti software dedicati a questo scopo sono disponibili sulla base di diversi modelli statistici, le prestazioni e l&#39;interfaccia utente 18. Tra questi, Mats (Analisi multivariata di Trascrizione Splicing) emerge come uno strumento di calcolo liberamente disponibile e preciso sulla base di un quadro statistico Bayesiano e progettati per rilevare diffeeventi di splicing renziale da entrambi i dati RNA-Seq singoli o accoppiati end. Partendo dai file allineate (.bam), STUOIE in grado di rilevare tutti i principali tipi di eventi alternativi di splicing (exon skipping, alternativa &#39;sito di splicing alternativo, 5&#39; 3 sito di splicing, esoni si escludono a vicenda e ritenzione di introni - anche vedi Figura 1). Innanzitutto, identifica software legge che supportano un certo evento giunzione, per esempio esone skipping e le classifica in due tipi. &quot;Inclusione legge&quot; (per l&#39;evento giunzione canonica) mappare all&#39;interno del esone indagato e abbracciare le giunzioni tra quella specifica esone e le due esoni fiancheggianti a monte ea valle. &quot;Skipping legge&quot; (per l&#39;evento di splicing alternativo) abbracciano la giunzione tra i due esoni fiancheggianti. Successivamente, MATS restituisce il livello di inclusione normalizzato per entrambi gli eventi canonici e alternativi e confronta i valori tra i campioni o condizioni. Infine, calcola P-value unnd false discovery rate (FDR) supponendo che la differenza nel rapporto variante di un gene tra due condizioni supera una soglia definita dall&#39;utente per ciascun evento splicing 19,34. A seguito di analisi di splicing differenziale in combinazione con RNA-Seq, una vasta validazione sperimentale è giustificato al fine di identificare i candidati veri positivi gene 18. Quantitative inversione trascritto-polymerase chain reaction (qRT-PCR) è il metodo più comunemente utilizzato e ottimale in validazione dei candidati ottenuti dalle analisi di RNA-Seq 20. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire una solida metodologia per indagare Profili di droga splicing di resistenza legate nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. Il nostro approccio utilizza RNA-Seq-based trascrittoma profili dei modelli di linee cellulari selezionate di tumori resistenti ai farmaci in combinazione con un metodo di qRT-PCR stabilito per la validazione dei geni candidati coinvolti nella resistenza ai farmaci. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; I modelli della linea di cellule di leucemia umana utilizzati in questo studio hanno incluso pediatrico cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) linea cellulare CSFR-CEM (CEM-WT), i suoi due glucocorticoidi (GC) resistente subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) e CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 e il metotrexato (MTX) Subline resistente CEM / R30dm 23. Anche se le attuali terapie a base di GC e MTX stabilire beneficio clinico in circa il 90% dei casi, la comparsa di GC-resistenza rappresenta ancora un problema irrisolto con un meccanismo molecolare chiaro. Per isolare sub-cloni GC-resistente, le cellule CEM-WT sono state coltivate in 1 micron dexametasone (Des) per 2 o 3 settimane. Subline MTX-resistente CEM / R30dm è stato sviluppato attraverso ripetuta a breve termine (24 ore) esposizione delle cellule CEM-WT a 30 micron MTX come mimica di protocolli clinici. È interessante notare che questa linea cellulare visualizzata anche una resistenza incrociata a Dex (risultati non pubblicati), per i quali il meccanismo non è del tutto chiaro. Il tum solidoo il modello studiato in questo studio è adenocarcinoma del dotto pancreatico, noto per la sua straordinaria refrattarietà alla chemioterapia. A questo scopo, abbiamo selezionato linea Panc-1 cellula e la sua gemcitabina resistente sub-clone Panc-1R ottenuta mediante incubazione continuo con 1 pM del farmaco 24. Qui si descrive un metodo per scoprire nuovi meccanismi alla base in vitro resistenza ai farmaci mediante la combinazione di tre protocolli: saggi di citotossicità colorimetrici per valutare la sensibilità ai farmaci nelle cellule leucemiche e cellule tumorali di tumori solidi, gasdotto RNA-Seq-based per identificare varianti di splicing nuovi legati alla la sensibilità ai farmaci / resistenza e RT-PCR e qRT-PCR per convalidare potenziali candidati.

<table><tbody><tr><td>Sulforhodamine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230162</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251399</td><td></td></tr><tr><td>CCRF-CEM</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>Panc-1</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto glucosio</td><td>Lonza, Basilea, Svizzera</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, USA</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino e vitello</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>penicillina G streptomicina solfato</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)-aminometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>MTT formazan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2003</td><td></td></tr><tr><td>Anthos-Elisa-reader 2001</td><td>Labtec, Heerhugowaard, Paesi Bassi</td><td></td><td>Spettrofotometro UV-Vis a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M0812-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA 100 ml</td><td>Lonza, Basilea, Svizzera</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Fiasche per colture cellulari 25 cm2</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania</td><td>82051-074</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per colture cellulari CELLSTAR 75 cm3</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (NaCl 0,9%)</td><td>B.Braun Melsungen AG, Germania</td><td>362 3140</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando rna-sequenziamento per rilevare novel splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; in vitro</em&gt; modelli di cancro

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

La resistenza ai farmaci rimane un problema importante nel trattamento del cancro sia per neoplasie ematologiche e tumori solidi. resistenza intrinseca o acquisita può essere causato da una serie di meccanismi, tra cui una maggiore eliminazione del farmaco, diminuito assorbimento di droga, l&#39;inattivazione di droga e alterazioni dei bersagli farmacologici. Dati recenti hanno mostrato che oltre dal noto genetica (mutazione, amplificazione) ed epigenetici (metilazione del DNA, istoni modificazioni post-traduzionali) modifiche, i meccanismi di resistenza ai farmaci potrebbe anche essere regolata da aberrazioni splicing. Si tratta di un settore in rapida crescita di indagine che richiede un&#39;ulteriore riflessione al fine di pianificare approcci terapeutici più efficaci. Il protocollo descritto in questo documento ha lo scopo di investigare l&#39;impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica di diversi modelli in vitro attraverso RNA-Seq e stabilireEd un qRT-PCR metodo basato per convalidare geni candidati. In particolare, abbiamo valutato la splicing differenziale di DDX5 e PKM trascrizioni. Il aberrant splicing rilevato dallo strumento computazionale MATS stato convalidato in cellule leucemiche, mostrando che le diverse varianti di splicing DDX5 sono espresse nelle cellule resistenti vs parentale. In queste cellule, abbiamo anche osservato un rapporto più elevato PKM2 / PKM1, che non è stato rilevato nel Panc-1 controparte gemcitabina-resistenti rispetto ai genitori Panc-1 le cellule, suggerendo un diverso meccanismo di farmaco-resistenza indotta dall&#39;esposizione gemcitabina.

I saggi di citotossicità descritti nel protocollo forniscono un metodo affidabile e robusto per valutare la resistenza delle cellule tumorali agli agenti chemioterapici in vitro. Per mezzo del saggio MTT, sensibilità alla Dex è stata determinata in quattro linee T-ALL cellulari, comprese le cellule parentali CEM-WT Dex-sensibili, e tre sublines Dex-resistenti: CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3. Due diversi intervalli di concentrazione dovevano essere utilizzati a causa della grande d...

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l&#39;impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è studiare l'associazione tra splicing aberrante e profili di resistenza ai farmaci in modelli in vitro di tumori solidi e malignità ematologiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della farmacologia molecolare e della resistenza alla chemioterapia, come ad esempio quali sono i meccanismi alla base della resistenza ai farmaci a livello post-trascrizionale? Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina un protocollo ben consolidato di screening citotossico con un'analisi trascrittomica basata sul sequenziamento di nuova generazione.Questa tecnica potrebbe portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base del fallimento della chemioterapia e migliorerà la rilevazione precoce della resistenza ai farmaci. Questo metodo può fornire informazioni sui determinanti a livello del genoma completo della resistenza ai farmaci in modelli di linee cellulari. Ma può anche essere applicato ad altri sistemi, come campioni primari di pazienti e xenotrapianti.La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Johan Fomirno, un tecnico del nostro laboratorio presso il Cancer Center Amsterdam. Per eseguire il saggio MTT su cellule leucemiche, preparare una piastra sperimentale a 96 pozzetti con fondo piatto. Riservare pozzetti per le concentrazioni del farmaco, per le cellule di controllo e per il mezzo di controllo senza cellule.Preparare una serie di diluizioni del farmaco dexametasona o dex. Aggiungere 30 microlitri di ogni diluizione di dex in un pozzetto appropriato della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi di includere ogni concentrazione in triplice replicato.Prelevare le cellule leucemiche in crescita esponenziale e ri-sospenderele alla concentrazione di semina ottimale. Aggiungere 120 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto contenente la soluzione del farmaco o il mezzo di crescita, e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 72 ore. Al termine del passaggio di incubazione, aggiungere 15 microlitri di reagente MTT in ogni pozzetto utilizzando una pipetta ripetitiva.Agitare la piastra per cinque minuti con un agitatore per piastre fino a un massimo di 900 agitazioni al minuto. Riposizionare le piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica in un incubatore per colture cellulari e incubare per altre quattro-sei ore. Al termine dell'incubazione, assicurarsi di risospendere accuratamente i cristalli di formazano poiché i valori di assorbanza dipendono da un'adeguata solubilizzazione del composto.Aggiungere 150 microlitri di isopropanolo acidificato in ogni pozzetto e mescolare accuratamente con una pipetta multicanale per ri-sospendere completamente tutti i cristalli di formazano. Utilizzando un lettore di micropiastre, determinare la densità ottica o OD a 540 e 720 nanometri per garantire una misurazione accurata correggendo l'OD di fondo. Per eseguire il saggio SRB su cellule di carcinoma pancreatico, preparare una piastra sperimentale a 96 pozzetti con fondo piatto. Seminare cellule di carcinoma pancreatico in fase di crescita esponenziale, in triplice replicato, in piastre a 96 pozzetti con fondo piatto alla densità appropriata in 100 microlitri di mezzo, utilizzando una pipetta multicanale.Aggiungere 100 microlitri di mezzo nei pozzetti contenenti solo mezzo e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per garantire un'adeguata adesione delle cellule alla piastra. Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione nel pozzetto appropriato della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Assicurarsi che ogni concentrazione sia eseguita in triplicato.Incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 72 ore. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di soluzione di TCA fredda nei pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Incubare le piastre per almeno 60 minuti a quattro gradi Celsius per precipitare e fissare le proteine sul fondo dei pozzetti.Svuotare la piastra rimuovendo il mezzo e asciugare brevemente su un fazzoletto di carta. Lavare cinque volte con acqua di rubinetto prima di svuotare la piastra e asciugare a temperatura ambiente. Aggiungere 50 microlitri di soluzione SRB per ogni pozzetto utilizzando una pipetta ripetitiva e colorare per 15 minuti a temperatura ambiente.Quindi, svuotare la piastra rimuovendo la colorazione con SRB. Dopo aver lavato la piastra quattro volte con acido acetico al 1%, svuotare la piastra e lasciarla asciugare a temperatura ambiente. Aggiungere 150 microlitri di soluzione di Tris per pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e mescolare per tre minuti su un agitatore per piastre fino a un massimo di 900 oscillazioni al minuto.Leggere la densità ottica a 540 nanometri. Centrifugare i campioni a 300 ×g per tre minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante, estrarre l'mRNA totale utilizzando colonne di centrifugazione con membrana di silice disponibili in commercio.Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA totale utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Per preparare la libreria di sequenziamento, utilizzare due microgrammi di mRNA totale per ogni campione. Seguire il protocollo di preparazione della libreria di mRNA secondo le istruzioni del produttore.Dopo aver raggruppato le librerie in un singolo campione fino a una concentrazione finale di 10 nanomoli per litro utilizzando un bioanalizzatore, impiegare un sistema di sequenziamento ad alto rendimento in modalità di lettura singola di 100 paia di basi. Progettare tutti i primer come descritto nel protocollo testuale. Per la sintesi del primo filamento di cDNA, impostare la trascrizione inversa di un microgrammo di RNA isolato in cDNA utilizzando 200 unità per microlitro di trascrittasi inversa del virus della leucemia murina di Moloney nel suo buffer di reazione diluito uno a cinque con acqua sterile.Per eseguire la reazione di RT-PCR, aggiungere un microlitro di cDNA alla miscela di reazione PCR e posizionare le provette nel termociclatore. Eseguire il programma come descritto nel protocollo testuale. Al termine della PCR, caricare i campioni in un gel di agarosio all'1% e far correre il gel in tampone TBE a 100 volt per circa 30 minuti in un sistema di elettroforesi.Per evitare contaminazioni incrociate, utilizzare punte con filtro durante l'esecuzione del saggio di qRT-PCR. Per eseguire la qRT-PCR, preparare il mix di reazione PCR con verde cianina per ciascuna variante di splicing specifica da rilevare, nonché per il gene di controllo. Caricare il mix master su una piastra bianca a 96 pozzetti e preparare duplicati per ogni campione.Aggiungere cinque microlitri di cDNA diluito 10 volte in acqua a ciascuna miscela prima di posizionare la piastra nel termociclatore. Le curve di inibizione della crescita determinate mediante saggio MTT per le cellule leucemiche e saggio SRB per le cellule di carcinoma pancreatico sono riportate qui. Le curve relative alle cellule resistenti alla desametasone e alle cellule resistenti alla gemcitabina sono spostate verso destra, indicando un'inibizione della crescita rispetto alle cellule sensibili parentali.La concentrazione e la qualità delle librerie di cDNA per tutte le linee cellulari vengono determinate mediante un chip DNA per bioanalizzatore. Gli elettroferogrammi mostrano picchi di fluorescenza a circa 300 pa, indicativi di una buona qualità per la successiva procedura di sequenziamento dell'RNA. Le letture brevi del gene candidato DDX5 possono essere visualizzate come grafici Sashimi, in cui le linee di collegamento rappresentano i giunti di splicing.Il trascritto di DDX5 mostra un uso differenziale dell'esone 12 nelle cellule di tipo selvatico CEM e CEM/R30dm rispetto alle linee cellulari resistenti ai glucocorticoidi, CEM-C3 e CEM-R5. I risultati del sequenziamento dell'RNA vengono confermati eseguendo la RT-PCR su geni selezionati, per i quali coppie di primer amplificano esoni situati a monte e a valle dell'esone alternativamente splicato. Qui viene mostrato lo splicing differenziale del gene DDX5.La quantificazione dei trascritti differenzialmente splicati mediante saggio qRT-PCR con primers inversi specifici per isoforma conferma la specifica riduzione dell'isoforma di splicing di DDX5 priva dell'esone 12 e di specifiche linee cellulari resistenti ai glucocorticoidi. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro settimane. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere i campioni di RNA sul ghiaccio per evitare la degradazione.Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'overespressione ectopica di una nuova variante di splicing. Questo permetterà di rispondere ad ulteriori domande riguardo l'impatto funzionale del profilo di splicing alternativo sulla resistenza ai farmaci. Questa tecnica può aprire la strada a ricerche nel campo della farmacologia molecolare per esplorare i determinanti a livello genomica della resistenza ai farmaci.

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La resistenza ai farmaci per terapie mirate è molto diffusa e la necessità di individuare meccanismi di resistenza - prima o dopo l'insorgenza clinica - è fondamentale per guidare le strategie alternative di gestione clinica. Qui, presentiamo un protocollo per accoppiare derivazione di linee farmaco-resistenti in vitro con sequenziamento per accelerare scoperta di questi meccanismi.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

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Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione

Qui, descriviamo un in situ di ibridazione test che consente la rivelazione sensibile e specifica delle sequenze più breve 50 nucleotidi con risoluzione del singolo-nucleotide a livello di singola cellula. L'analisi, che possono essere eseguita manualmente o automaticamente, può abilitare la visualizzazione delle varianti di splicing, brevi sequenze e mutazioni all'interno del contesto del tessuto.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

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Identificazione di splicing alternativo e poliadenilazione in dati di RNA-seq

Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5'-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell'inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.

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Scopri come rilevare varianti di splicing aberranti associate alla resistenza ai farmaci in modelli di tumori solidi e malignità ematologiche. Questo metodo combina screening di citotossicità e analisi trascrittomica RNA-seq per migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base del fallimento della chemioterapia.

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