Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l'analisi TEM

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare campioni con un basso numero di cellule per eseguire l'analisi TEM in modo efficiente e riproducibile. Questo metodo può aiutare a rivelare tutte le strutture delle cellule reali e un migliore contesto fisiologico in campo biomedico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che sia i risultati qualitativi che quelli quantitativi possono essere ottenuti da un basso numero di cellule in modo riproducibile.

Per iniziare, usa i fatti per selezionare 10.000 cellule staminali ematopoietiche, o HSC, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Contiene 600 microlitri di isocoves modificato con il 10% di FBS. Utilizzando una centrifuga con secchi oscillanti, centrifugare gli HSC selezionati a 1.000 volte G per 10 minuti.

Utilizzare l'aspirazione gentile per rimuovere tutto tranne 200 microlitri del terreno. Per fissare le cellule aggiungere 0,2 mL di soluzione fissativa a due X appena preparata e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi aggiungere 600 microlitri di tampone cacodilato molare 0,1 per lavare le cellule.

Centrifugare nuovamente le cellule, questa volta a 30 gradi Celsius. Quindi, dopo la centrifugazione e la rimozione di tutti i microlitri di tampone tranne 200, aggiungere 200 microlitri di due milligrammi per millilitro di blu di Evans in tampone di cacodilato e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per colorare le cellule. Utilizzare 600 microlitri di tampone cacodilato molare 0,1 per lavare le cellule tre volte.

Quindi risospendere le cellule nei restanti 200 microlitri di tampone prima di trasferire la sospensione della cellula in una provetta da 0,5 mL. A questo punto il pellet dovrebbe essere visibile nel tubo. Con una centrifuga da tavolo, centrifugare le celle a 1.000 volte G per 10 minuti.

Quindi rimuovere delicatamente il tampone senza disturbare il pellet di minuscole cellule ora visibile, lasciando 50 microlitri di tampone nel tubo. Preparare una soluzione di agarosio al 4%, aggiungendo 200 milligrammi di agarosio a basso punto di fusione a cinque millilitri di tampone cacodilato molare 0,1 in una provetta da 15 mL. Sciogliere l'agarosio trasferendo la provetta in acqua bollente in una bottiglia di vetro da 100 ml.

Aggiungere 200 microlitri di soluzione di agarosio al tubo della sospensione cellulare. Centrifugare immediatamente a 1.000 volte G e 30 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver confermato che le cellule sono state inserite nell'agarosio semisolido sul fondo della provetta, trasferire immediatamente la provetta a quattro gradi Celsius, o ghiaccio, per 20 minuti per solidificare l'agarosio.

Utilizzando un ago da 27 gauge, trasferire con cura l'agarosio solidificato, contenente il pellet cellulare, in una capsula di Petri di plastica da 35 ml contenente 0,1 tampone molare di cacodilato. Con un bisturi tagliare l'agarosio solidificato contenente la pallina cellulare in un unico pezzo di circa uno o due millimetri. Quindi trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.

Aggiungere 600 microlitri di tampone cacodilato molare 0,1 e lavare il pellet di cellule di agarosio utilizzando una pipetta per aggiungere e rimuovere il tampone. Rimuovere il tampone dal pellet della cella di agarosio e in una cappa aspirante, indossando indumenti protettivi e guanti, aggiungere un millilitro di soluzione di tetrossido di osmio all'1%. Incubare il pellet cellulare a quattro gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, lavare il campione tre volte. Trasferirlo in una fiala di vetro a scintillazione da 20 ml con tappo. Quindi disidratare il campione utilizzando una serie di etanolo.

Quindi infiltrare il campione in concentrazioni crescenti di resina LX 112 in etanolo prima di incubare in resina al 100% due volte per 60 minuti ogni volta. Usando una pinza, trasferisci con cura il campione sul fondo di uno stampo di gomma a forma di punta piramidale e aggiungi resina pura sopra il campione per riempire lo stampo. Incubare il campione a 60 gradi Celsius per 72 ore per polimerizzare la resina.

Quando la resina è polimerizzata, rimuoverla dagli stampi ruotando lo stampo in gomma. Un piccolo ammasso nero di cellule dovrebbe essere visibile nella piramide di resina polimerizzata. Utilizzare cianoacrilato per fissare la piramide di resina polimerizzata su un cilindro di montaggio per il sezionamento.

Dopo aver montato il blocco su un ultramicrotomo, utilizzare una lama di rasoio e un coltello diamantato per tagliare il blocco piramidale, creando una forma trapezoidale corta e larga con la parte superiore e inferiore del blocco parallele tra loro e con i lati uniformemente angolati. Quindi utilizzare il coltello diamantato per tagliare il blocco attorno al pellet della cella e rimuovere le sezioni di plastica attorno al pezzo di agarosio del pellet della cellula. Con l'ultramicrotomo, taglia sezioni di un micrometro e usa uno strumento per ciglia e un anello di metallo per spostare le sezioni dalla barca d'acqua a uno scivolo di vetro.

Quindi posizionare i vetrini su una piastra calda a 37 gradi Celsius per asciugarli. Utilizzando una siringa con filtro da 0,22 micrometri, aggiungere una goccia di soluzione di blu di teluatina alle sezioni e incubare per tre minuti. Quindi, con acqua distillata, sollevare i vetrini e lasciare asciugare le sezioni.

Dopo l'essiccazione, controllare le sezioni al microscopio ottico per identificare la posizione delle cellule. Quindi, usa un coltello diamantato per tagliare sezioni ultra sottili. Quindi, con uno strumento per ciglia, spostare due o tre sezioni su 200 griglie a maglie dalla barca d'acqua e posizionarle in una capsula di Petri di vetro.

Trasferire la pirofila con le griglie su una piastra calda a 30 gradi Celsius per 30 minuti per asciugare le sezioni. Aggiungere gocce di acetato di uranile all'1% e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per colorare le griglie. Quindi, usa acqua distillata per risciacquare da sei a otto volte.

Colorare con citrato di piombo Reynolds a temperatura ambiente per cinque minuti prima di risciacquare da sei a otto volte. Trasferire la capsula di Petri di vetro contenente le griglie su una piastra calda a 37 gradi Celsius per asciugare le sezioni. Infine, analizza le sezioni con un microscopio elettronico a 87 kilovolt.

Qui sono mostrate sezioni semisottili colorate di blu di toluidina da blocchi contenenti un minuscolo pellet di cellule che confermano un gruppo di cellule. Questa immagine con ingrandimento maggiore mostra la morfologia intatta delle cellule. Questa figura rappresenta un campo visivo del cluster cellulare da sezioni ultra sottili che sono state colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e analizzate mediante microscopia elettronica.

Qui è mostrata una singola HSC, che dimostra che la morfologia e l'ultra struttura delle cellule erano ben conservate. Una micrografia elettronica altamente dettagliata di ingrandimento più elevato di una singola HSC mostra le ultra strutture intracellulari. Inoltre, le immagini ad alto ingrandimento hanno catturato la struttura e l'integrità ben conservate degli organelli subcellulari come i mitocondri.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore, e per la colorazione blu avanzata, l'inclusione di agarosio e quindi la normale elaborazione TEM richiederà da cinque a sei giorni se eseguita correttamente. Quindi, dopo aver visto questo video, si ha una buona comprensione di come preparare campioni da una vera preparazione di cellule per l'analisi TEM.