Name: Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per lanalisi TEM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Impara a preparare campioni con basso numero di cellule per l'analisi TEM. Questo metodo utilizza cellule staminali ematopoietiche e garantisce risultati qualitativi e quantitativi riproducibili per la ricerca biomedica.

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Ringraziamo il Nucleo di Ricerca Patologica per l'assistenza con gli studi di analisi al microscopio elettronico presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Il lavoro è stato sostenuto dal NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 a MDF).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato animale istituzionale a Research Foundation dei bambini di Cincinnati. Per questo studio, le cellule staminali ematopoietiche sono state isolate dal midollo osseo di topi C57BL / 6 inbred invecchiato 2 - 4 mesi. Separazione delle cellule usando FACS dopo colorazione di BM con diversi produttori di superficie tra Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 e CD34 è stato utilizzato per la depurazione delle HSC in base a Lin- Sca-1 + Flt3 c-Kit + - strategia di gating - CD34 come protocollo standard descritto prima delle 8. ATTENZIONE: Diverse sostanze chimiche altamente tossiche vengono utilizzati durante questa procedura. Questi sono tossico per inalazione e contatto con la pelle. Si prega di indossare guanti ed indumenti protettivi. Lavori in cappa mentre si lavora con queste sostanze chimiche. 1. cellule, la fissazione, colorazione e pre-embedding <ol><li> Ordina 10.000 cellule staminali ematopoietiche (utilizzando Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategia; LT-HSC popolazione) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 600 microlitri di Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM) con il 10% di siero fetale bovino usando FACS. </li><li> Spin down CSE smistate a 1000 xg per 10 min in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga utilizzando una centrifuga con benne oscillanti. Rimuovere medio aspirando delicatamente e lasciare 200 microlitri di media nei tubi ad ogni passo. In questa fase, il pellet cellulare rimane invisibile nel tubo. </li><li> Fissare le cellule aggiungendo 0,2 ml di soluzione di fissativo 2x a temperatura ambiente (RT) per 1 ora 1,9. <ol><li> Rendere la soluzione fissativa fresca prima dell&#39;uso. Al 1x, la soluzione è composta da 3% paraformaldeide e 2,5% glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato. </li></ol></li><li> Centrifugare le cellule a 1.000 xg per 10 min a 30 ° C utilizzando una centrifuga con secchi swing-out. </li><li> Lavare le cellule con 600 ml di buffer di 0,1 M cacodilatomediante centrifugazione e lasciare tampone 200 microlitri nel tubo dopo centrifugazione. </li><li> Macchiare le cellule fissate aggiungendo 200 ml di 2 mg / ml soluzione di Evans blu in tampone cacodilato e incubare per 20 minuti a RT. Le cellule saranno di colore blu. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 600 ml di 0,1 M tampone cacodilato mediante centrifugazione e lasciare tampone 200 microlitri nel tubo ogni volta. </li><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 0,5 ml. Centrifugare a 1000 xg per 10 minuti usando una centrifuga da tavolo. Rimuovere tampone delicatamente senza disturbare l&#39;ora visibile minuscola pellet cellulare, e lasciare tampone 50 microlitri nel tubo. </li><li> Aggiungere 200 mg bassa fusione agarosio a 5 ml di 0,1 M tampone cacodilato nel tubo 15 ml di una soluzione di agarosio al 4%. Sciogliere l&#39;agarosio trasferendo il tubo di acqua bollente in una bottiglia di vetro da 100 ml e mantenere tiepida fino all&#39;uso. </li><li> Aggiungere 200 ml di 4% basso punto di fusione agarosio sciolti in 0,1 M cacodylaTE buffer per la sospensione di cellule in provetta da 0,5 ml e subito centrifugare a 1000 xg per 10 min a 30 ° C utilizzando una tabella centrifuga superiore. </li><li> Dopo la conferma che le cellule in pellet al fondo del tubo 0,5 ml in agarosio semi-solido dopo la centrifugazione, trasferire immediatamente il tubo a 4 ° C o ghiaccio per 20 minuti per solidificare l&#39;agarosio. Questo passaggio è molto critica, come un piccolo pellet di cellule visibile in questa fase si ottiene una buona ammasso di cellule al microscopio elettronico. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;agarosio solidificato contenente il pellet dal tubo di plastica Petri 35 millimetri contenente tampone con un 27 ago G 3,10. </li><li> Tagliare le agarosio solidificati contenenti il ​​pellet cellulare in un unico pezzo di circa 1 - 2 mm con un bisturi. Trasferire il pezzo agarosio contenente il pellet di cellule in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Lavare 2 - 3 volte con 600 ml di tampone 0,1 M cacodilato aggiungendo e rimuovendo buffer utilizzando pipetta senza centrifugazione. Utilizzare questo pezzo agarosio contenente il pellet di cellule per il passaggio successivo. In questa fase, il campione può essere conservato a 4 ° C per una notte prima di passare alla fase successiva. </li></ol> 2. Osmification, disidratazione, Embedding <ol><li> Rimuovere il tampone cacodilato dal tubo 1,5 ml con il pellet cellulare contenente agarosio usando una pipetta. Aggiungere 1,0 ml di 1% tetrossido di osmio (OSO 4), soluzione in una cappa aspirante, e incubare per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Lavare tre volte con 600 ml di 0,1 M tampone cacodilato e trasferire il campione di 20 ml di vetro scintillazione fiala con un tappo. </li><li> Elaborare il campione per la disidratazione, l&#39;infiltrazione e l&#39;inclusione in resina (per esempio, LX-112) con modifiche di serie dei seguenti soluzioni in un piatto 6 bene. Spostare il pezzo agarosio cellula-pellet con pinze. <ol><li> Immergere il campione in 25% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione in 50% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione nel 75%etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione in 95% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione in 100% di etanolo a temperatura ambiente per 15 minuti, due volte. </li><li> Immergere il campione in etanolo: resina (3: 1) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Immergere il campione in etanolo: resina (1: 1) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Immergere il campione in etanolo: resina (1: 3) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Immergere il campione in resina pura a temperatura ambiente per 60 minuti, due volte. </li></ol></li><li> Trasferire il campione al fondo della punta piramidale stampo di gomma a forma di indicatori accuratamente pinza e aggiungere resina più pura sulla parte superiore del campione per riempire lo stampo. Incubare il campione a 60 ° C per 72 ore per la polimerizzazione della resina. </li><li> Rimuovere la piramide di resina polimerizzata dagli stampi torcendo lo stampo in gomma. Un piccolo gruppo di cellule nero dovrebbe essere visibile nella piramide di resina polimerizzata, come descritto in precedenza 7. Fissare la piramide di resina polimerizzata sul cilindro di montaggio con cianoacrilato. </li></ol><ol><li> Tagliare il blocco piramide con una lama di rasoio e un coltello di diamante dopo il montaggio del blocco un ultra-microtomo. Effettuare un breve forma trapezoidale larga con la parte superiore e la parte inferiore del blocco paralleli tra loro e con i lati uniformemente angolati. Questa forma della piramide aiuta per sezionamento seriale. </li><li> Inoltre, tagliare il blocco di tutto il pellet cellulare con il coltello diamante e rimuovere le sezioni di plastica attorno al pezzo agarosio pellet cellulare. </li><li> Tagliare 1 sezioni micron utilizzando un ultra-microtomo. Spostare il 1 sezioni micron dalla barca acqua per un vetrino utilizzando uno strumento ciglia e uno strumento ciclo metallo come precedentemente riportato 7. sezioni di trasferimento su scivoli e scivoli di trasferimento al piatto caldo (37 ° C) per l&#39;asciugatura. </li><li> Aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina per le sezioni usando una siringa dotata di 0,22 micron filtro e incubare per 3 min. Sciacquare i vetrini con acqua distillata e let sezioni asciugare. Verificare con un microscopio ottico per identificare la posizione delle celle. </li><li> Tagliare sezioni ultrasottili (70-100 nm) utilizzando un coltello di diamante. Spostare 2 - 3 sezioni su griglie di 200 maglia dalla barca acqua ad una piastra di Petri di vetro utilizzando uno strumento di ciglia. </li><li> Trasferire il piatto di vetro Petri contenenti griglie con sezioni ad una piastra calda a 30 ° C per asciugare sezioni per 30 min. </li><li> Macchiare le griglie con gocce di 1% acetato di uranile a temperatura ambiente per 10 minuti e poi sciacquare in acqua distillata 6 - 8 volte. Colorazione con Reynolds citrato di piombo, a temperatura ambiente per 5 minuti e sciacquare in acqua distillata 6 - 8 volte. Trasferire il piatto di vetro Petri contenente le griglie ad una piastra calda a 37 ° C per asciugare sezioni. </li><li> Analizzare sezioni con un microscopio elettronico, a 80 kV 7. </li></ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
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<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
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<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo consente l&#39;analisi TEM sul numero di cellule bassi, utilizzando Evans colorazione blu e agarosio l&#39;incorporamento di localizzare un piccolo pellet di cellule durante la disidratazione, embedding resina e sezionamento processi. Importante, mantiene raggruppamenti cellulari insieme e conserva la ultra-struttura cellulare, che è opportuno esaminare più celle per la quantificazione dei dati. In studi TEM, un pellet di cellule contenente milioni di cellule è spesso necessari...

Dettagli Ultra-strutturali e sub-organelli delle cellule sono stati rivelati principalmente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) studi da tessuti o pellet cellulari 1,2. pezzi solidi di tessuti possono essere facilmente utilizzati per studi di microscopia elettronica. Tuttavia, TEM analizza 1,3 su cellule in sospensione rimangono una sfida e rendono necessario il numero di cellule alte, vale a dire, milioni di cellule. A causa di questo, analisi ultra-strutturali delle popolazioni cellulari rare in sospensione, ad esempio, cellule staminali ematopoietiche (CSE), non sono facilmente valutati. Molteplici tentativi di analisi TEM da campioni scarse utilizzando cytospin o monostrato approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal limitato numero di celle. Pertanto, il requisito di un elevato numero di cellule limita l&#39;uso di questo potente strumento per comprendere i dettagli ultrastrutturali subcellulari di popolazioni di cellule rare. Una limitazione fondamentale per studi TEM con un numero limitato di cellules in sospensione è la localizzazione delle cellule per la lavorazione e quindi, studi TEM da cellule limitati con particolare piccole dimensioni rimangono impegnativo. Diversi approcci alternativi sono stati adottati per contrastare questa limitazione: la BSA / bisacrylamide (BSA-BA) polimerizzazione mediata di sospensione cellulare, la colorazione delle cellule con un colorante per renderli visibili su un supporto sottile pellicola tra cui lamelle, e TEM analizza dalle preparazioni cytospin 4-6. Tuttavia, il successo molto limitato è stato raggiunto, come molto poche cellule sono stati trovati in sezioni dopo ultra-sezionamento. La sfida principale di identificare cellule sparse persiste perché il monostrato cellulare rimane per lo più invisibile nel gel solidificato per il sezionamento. Inoltre, la preparazione cytospin delle cellule può alterare la loro organizzazione cellulare dovuta alla diffusione delle cellule e la fragilità della struttura cellulare. Quindi, questi inconvenienti intrinseci giustificano un nuovo approccio per eseguire studi TEM da popolazioni di cellule rare con piùconsistenza. Per superare questo problema, abbiamo descritto un nuovo metodo di preparazione del campione e alternativa a studi TEM da popolazioni di cellule rare 7. Qui riportiamo un efficiente protocollo di preparazione del campione per eseguire TEM da campioni biologici scarse con risultati qualitativi e quantitativi consistenti. Evans blu colorazione è stata eseguita dopo la fissazione di localizzare un piccolo pellet di cellule dalle cellule basso numero, cioè, staminali emopoietiche del midollo osseo 10.000 e le cellule progenitrici che altrimenti sarebbero rimaste invisibili, e il pellet è stato incorporato in agarosio prima processi di disidratazione e resina embedding. Questo metodo raggruppa insieme le cellule e permette l&#39;analisi efficiente della ultrastruttura e l&#39;organizzazione subcellulare di cellule staminali ematopoietiche (identificato come Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -, HSC), un 0.2 rara - popolazione di cellule 0,5% nel midollo osseo. Questo pro sperimentaleprotocollo può essere utile per effettuare studi ultra-strutturali e di ottenere risultati quantitativi in ​​molte popolazioni rari ma molto importanti.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide 20% Microscopia elettronica acquosa Soln</td><td>Scienze</td><td>15713</td><td>CAUTION Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, utilizzare la cappa aspirante.</td></tr><tr><td>Gluteraldeide 70% Microscopia elettronica acquosa Soln</td><td>Scienze</td><td>16350<</td><td>strong>CAUTION Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, utilizzare la cappa aspirante.</td></tr><tr><td>Tampone cacodiladato</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>12300</td><td>Preparare un tampone cacodeladato 0,1 M (pH 7,4) in acqua distillata, conservare a 4 °C. <forte>ATTENZIONE</forte> Irritante per inalazione o contatto con la pelle, indossare guanti e lavorare in cappa aspirante.</td></tr><tr><td>Evans Blue&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>tetraossido di osmio</td><td>Scienze 19130</td><td>1 g in 50 ml di tampone cacodeladato 0,1 M per fare il 2% di OsO4 stock, <forte>ATTENZIONE</forte> Molto tossico per inalazione o contatto con la pelle, forte ossidante, indossare indumenti protettivi, protezione per gli occhi, utilizzare cappa aspirante.</td></tr><tr><td>Kit di inclusione LX-112 (LADD&reg;)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (anidride dodecenilsuccinica)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mescolare 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 insieme e poi aggiungere 1,4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (anidride metilica nadica)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Resine epossidiche Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td><forte>ATTENZIONE</forte> Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, indumenti protettivi, utilizzare una cappa aspirante.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetilamminometil)fenolo)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di piombo Reynolds (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>ATTENZIONE Tossico per inalazione, evitare il contatto con la pelle o gli occhi.</td></tr><tr><td>Acetato di uranile (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>ATTENZIONE Tossico per inalazione, evitare il contatto con la pelle o gli occhi.</td></tr><tr><td>Mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composizione: NaCl, NaHCO3, HEPES, glucosio, Ca, Mg, zolla piruvato ecc. Per dettagli https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>stampo a punta piramidale</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>cilindri di montaggio</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtomo&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 griglie mesh (nikil)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico</td><td>Hitachi modello H-7650&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software del motore di acquisizione delle immagini</td><td>AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica da 35 mm</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super colla Cianoacrilato</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da</td><td></td><td></td><td></td>barba</tr><tr><td>Fiale di scintillazione in vetro&nbsp;</td><td>Fisher scientifico&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento</td><td></td><td></td><td></td>per ciglia</tr><tr><td>Strumento per anello in metallo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l&#39;analisi tem

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce i dettagli della organizzazione cellulare e ultrastruttura. Tuttavia, l&#39;analisi TEM di popolazioni di cellule rare, in particolare le cellule in sospensione come le cellule staminali ematopoietiche (CSE), rimane limitata a causa della necessità di un elevato numero di cellule durante la loro preparazione. Ci sono alcuni approcci cytospin o monostrato per analisi TEM da campioni scarse, ma questi approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal numero limitato di cellule. Qui, un approccio alternativo e innovativo per la preparazione del campione negli studi TEM è descritto per le popolazioni di cellule rare che consente l&#39;analisi quantitativa. Un numero relativamente basso di cellule, cioè, 10.000 CSE, è stato utilizzato con successo per l&#39;analisi TEM rispetto ai milioni di cellule tipicamente utilizzati per gli studi TEM. In particolare, Evans blu colorazione è stata eseguita dopo paraformaldeide-glutaraldeide (PFA-GA) la fissazione di visualizzare la minuscola cella pellasciare, che ha facilitato l&#39;incorporamento in agarosio. Grappoli di numerose cellule sono stati osservati nelle sezioni ultrasottili. Le cellule hanno una morfologia ben conservato, ei dettagli ultra-strutturali dei mitocondri Golgi complesse e diverse erano visibili. Questo protocollo efficiente, semplice e riproducibile permette la preparazione del campione da un numero di cellule basso e può essere utilizzato per l&#39;analisi qualitativa e quantitativa TEM su popolazioni di cellule rare da campioni biologici limitate.

Un protocollo efficace e coerente per la preparazione dei campioni per effettuare analisi TEM dal basso numero di cellule è descritto. Post-fissazione colorazione con blu di Evans e il trasferimento di cellule in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga ha aiutato a visualizzare la minuscola pellet cellulare 7. Osmification con tetrossido di osmio in agarosio ha portato ad un rilevamento facile del pellet cellulare buio durante la disidratazione e incorporamento. <p class="j...

Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni con un basso numero di cellule per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l&#39;analisi TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare campioni con un numero ridotto di cellule per eseguire l'analisi in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) in modo efficiente e riproducibile. Questo metodo può contribuire a rivelare tutte le strutture delle cellule reali e a ottenere condizioni fisiologiche più accurate nel campo biomedico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che da un numero ridotto di cellule è possibile ottenere risultati sia qualitativi che quantitativi in maniera riproducibile.Per iniziare, utilizzare un ordinatore cellulare per separare 10.000 cellule staminali ematopoietiche, o HSC, in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 600 microlitri di mezzo di Iscove modificato di Dulbecco con 10% di FBS. Utilizzando una centrifuga con rotorini oscillanti, centrifugare le HSC separate a 1.000 × g per 10 minuti.Utilizzare un'aspirazione delicata per rimuovere tutto il mezzo tranne 200 microlitri. Per fissare le cellule, aggiungere 0,2 mL di soluzione fissativa fresca al doppio della concentrazione (2X) e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, aggiungere 600 microlitri di tampone cacodilato 0,1 molare per lavare le cellule.Centrifugare nuovamente le cellule, questa volta a 30 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto tranne 200 microlitri di tampone e aggiungere 200 microlitri di blu di Evans a due milligrammi per millilitro nel tampone cacodilato, quindi incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per colorare le cellule. Utilizzare 600 microlitri di tampone cacodilato 0,1 molare per lavare le cellule tre volte.Quindi risospendere le cellule nei rimanenti 200 microlitri di tampone prima di trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 0,5 mL. A questo punto il pellet dovrebbe essere visibile nella provetta. Utilizzando una centrifuga da banco, centrifugare le cellule a 1.000 × g per 10 minuti.Quindi rimuovere delicatamente il tampone senza disturbare il piccolo pellet cellulare ora visibile, lasciando 50 microlitri di tampone nel tubo. Preparare una soluzione di agarosio al 4% aggiungendo 200 milligrammi di agarosio a basso punto di fusione a cinque millilitri di tampone cacodilato 0,1 molare in un tubo da 15 mL. Sciogliere l'agarosio trasferendo il tubo nell'acqua bollente contenuta in una bottiglia di vetro da 100 mL.Aggiungere 200 microlitri della soluzione di agarosio al tubo della sospensione cellulare. Centrifugare immediatamente a 1.000 ×g e a 30 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver verificato che le cellule si sono sedimentate nell'agarosio semisolido sul fondo del tubo, trasferire immediatamente il tubo a 4 gradi Celsius, o sul ghiaccio, per 20 minuti per far solidificare l'agarosio.Utilizzando un ago da 27 gauge, trasferire con attenzione l'agarosio solidificato, contenente il pellet cellulare, in una piastra di Petri in plastica da 35 mL contenente tampone cacodilato 0,1 molare. Con un bisturi, tagliare l'agarosio solidificato contenente il pellet cellulare in un unico pezzo di circa uno-due millimetri. Successivamente, trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 mL.Aggiungere 600 microlitri di tampone cacodilato 0,1 molare e lavare il pellet cellulare in agarosio utilizzando una pipetta per aggiungere e rimuovere il tampone. Rimuovere il tampone dal pellet cellulare in agarosio e, sotto cappa aspirante, indossando abbigliamento protettivo e guanti, aggiungere un millilitro di soluzione al 1% di tetrossido di osmio. Incubare il pellet cellulare a quattro gradi Celsius per un'ora.Dopo l'incubazione, lavare il campione tre volte. Trasferirlo in un vial di vetro da 20 mL con tappo. Successivamente disidratare il campione utilizzando una serie di etanolo.Quindi infiltrare il campione in concentrazioni crescenti di resina LX 112 in etanolo prima di incubarlo due volte in resina al 100% per 60 minuti ogni volta. Utilizzando pinzette, trasferire con cura il campione sul fondo di uno stampo di gomma a forma di punta piramidale e aggiungere resina pura sopra il campione per riempire lo stampo. Incubare il campione a 60 gradi Celsius per 72 ore per polimerizzare la resina.Una volta che la resina è polimerizzata, rimuoverla dagli stampi ruotando lo stampo di gomma. Un piccolo aggregato nero di cellule dovrebbe essere visibile nella piramide di resina polimerizzata. Utilizzare cianoacrilato per fissare la piramide di resina polimerizzata su un cilindro di montaggio per la sezionatura.Dopo aver montato il blocco su un ultramicrotomo, utilizzare una lametta e un coltello al diamante per sagomare il blocco piramidale, ottenendo una forma trapezoidale corta e larga con la parte superiore e quella inferiore del blocco parallele tra loro e i lati uniformemente inclinati. Quindi, utilizzare il coltello al diamante per rifinire il blocco intorno al pellet cellulare e rimuovere le sezioni di plastica circostanti il campione di pellet cellulare in agarosio. Con l'ultramicrotomo, tagliare sezioni di un micrometro e utilizzare uno strumento a ciglio e un anello metallico per spostare le sezioni dalla vaschetta d'acqua a un vetrino.Quindi posizionare i vetrini su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius per farli asciugare. Utilizzando una siringa con un filtro da 0,22 micrometri, aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina alle sezioni e incubare per tre minuti. Successivamente, risciacquare i vetrini con acqua distillata e lasciare asciugare le sezioni.Dopo l'essiccazione, esaminare i preparati al microscopio ottico per identificare la posizione delle cellule. Successivamente, utilizzare un coltello di diamante per tagliare sezioni ultratenui. Quindi, con uno strumento a ciglio, trasferire due o tre sezioni su griglie da 200 mesh dalla barchetta d'acqua e posizionarle in una capsula di Petri di vetro.Trasferire la piastra con le griglie su una piastra riscaldante a 30 gradi Celsius per 30 minuti per asciugare le sezioni. Aggiungere gocce di acetato di uranile al 1% e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per colorare le griglie. Successivamente, risciacquare con acqua distillata da sei a otto volte.Colorare con citrato di piombo di Reynolds a temperatura ambiente per cinque minuti prima di risciacquare da sei a otto volte. Trasferire la capsula di Petri in vetro contenente le griglie su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius per asciugare le sezioni. Infine, analizzare le sezioni con un microscopio elettronico a 87 chilovolt.Qui mostrate a basso ingrandimento sono sezioni semisottili colorate con blu di toluidina provenienti da blocchi contenenti un piccolo pellet cellulare che confermano un aggregato di cellule. Questa immagine ad alto ingrandimento mostra la morfologia intatta delle cellule. Questa figura rappresenta un campo d'insieme dell'aggregato cellulare ottenuto da sezioni ultrasottili colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e analizzate mediante microscopia elettronica.Qui è mostrato un singolo CSC, che dimostra come la morfologia e l'ultrastruttura delle cellule siano state ben preservate. Una microfotografia elettronica altamente dettagliata di un singolo CSC, ottenuta con un ingrandimento maggiore, mostra le ultrastrutture intracellulari. Inoltre, immagini ad alto ingrandimento hanno catturato la struttura e l'integrità ben preservate di organelli subcellulari come i mitocondri.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore; per quanto riguarda la colorazione blu avanzata, l'incapsulamento in agarosio e il successivo normale trattamento per microscopia elettronica a trasmissione, occorreranno da cinque a sei giorni se eseguiti correttamente. Pertanto, dopo aver visto questo video, si avrà una buona comprensione di come preparare campioni a partire da cellule reali per l'analisi al MET.

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