Metodo di consegna diretta segmentale intra-epatico utilizzando un modello di fegato di ratto Hilar morsetto

L'obiettivo generale di questo modello unico di morsetto ilare del fegato di ratto è quello di consentire lo studio dell'impatto di molecole farmacologiche di interesse nel migliorare il danno da ischemia e riperfusione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del trapianto di fegato su quali molecole possono essere infuse direttamente nel fegato per aiutare a mediare il danno da ischemia e riperfusione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la molecola di interesse viene iniettata direttamente nella vena porta, riducendo il volume di distribuzione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trapianto di tutti gli organi, in quanto consente di testare le molecole che potrebbero essere aggiunte ai perfusi d'organo per la riduzione del danno da ischemia e riperfusione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale a causa delle piccole dimensioni del ramo della vena porta utilizzato per l'incannulamento. Inizia confermando il livello appropriato di sedazione pizzicando le dita dei piedi, quindi posiziona il ratto su un tappetino riscaldante sotto un microscopio da dissezione e trattieni gli arti.

Successivamente, praticare un'incisione cutanea addominale sulla linea mediana dal pube allo xifoide, seguita da un'incisione simile nel peritoneo lungo la linea alba. Entra nell'addome, facendo attenzione a non danneggiare la vescica o l'intestino, e rilascia il fegato dal peritoneo anteriormente vicino al processo xifoideo. Praticare un'incisione trasversale attraverso la pelle e il peritoneo al bordo inferiore del lobo destro del fegato e utilizzare una pinza per zanzare curva per ritrarre il processo xifoideo.

Utilizzare divaricatori costali per aprire le costole il più lontano possibile dalla linea mediana e tagliare i legamenti falciformi, frenici e gastrici. Quindi utilizzare tamponi di cotone sterili inumiditi per sollevare il fegato e tagliare i legamenti aggiuntivi se necessario per accedere alla porta. Utilizzando una garza inumidita con soluzione salina, ruotare visceralmente il fegato, quindi rimuovere il tessuto connettivo lasso sovrastante l'ilo porta e il tessuto connettivo lasso sovrastante la lunghezza della vena porta.

Usando una pinza, spingere attraverso il tessuto connettivo lasso posteriore alla vena porta sinistra, all'arteria e al dotto biliare per creare una finestra e circondare liberamente i vasi con una sutura di Potts 4-0. Quindi eliminare il tessuto connettivo lasso sovrastante il ramo posteriore fino alla vena porta del rene destro. Successivamente, utilizzare una siringa da insulina per prelevare 0,5 millilitri di sangue dalla vena cava inferiore e trasferire il sangue in una piccola fiala.

Centrifugare il campione e raccogliere il siero in una nuova fiala per il congelamento rapido in azoto liquido. Tagliare due pezzi di sutura 7-0. Posiziona il primo anello 7-0 attorno alla vena porta sinistra il più lontano possibile medialmente e usa un morsetto per zanzare curvo per ritrarre la vena.

Posizionare un secondo anello 7-0 legato in modo lasco sul ramo posteriore della vena porta vicino alla sua intersezione con la vena porta. A questo punto, caricare la pompa di infusione con una siringa da cinque millilitri contenente tre millilitri di reagente in soluzione fisiologica allo 0,9% e adescare il tubo. Utilizzare una pinza microchirurgica per afferrare la vena porta distale per ridurre il sanguinamento durante l'incannulamento e utilizzare piccole forbici microchirurgiche per praticare un foro di 0,5 millimetri nella vena tra la sutura 7-0 e la sua intersezione con la vena porta.

Utilizzando un catetere 27-0, incannulare il sistema venoso portale sinistro, inserendo il catetere oltre la biforcazione delle vene portanti sinistra e destra. Infondere un millilitro di soluzione fisiologica normale per confermare il posizionamento della cannula e osservare che i lobi laterali e mediani sinistri del fegato sbollentano. Valutare manualmente che il catetere sia oltre il decollo della vena porta destra, ma non oltre il decollo della vena porta che alimenta il lobo mediano, quindi stringere la sutura di Potts, fissare il catetere con la sutura 7-0 e rimuovere il morsetto dalla vena porta distale.

Iniziare immediatamente l'infusione di due millilitri del reagente di interesse in un periodo di erogazione di 15 minuti, con monitoraggio continuo dei segni vitali dell'animale durante l'infusione. Un'ora dall'inizio del tempo ischemico, rimuovere la sutura di Potts e il catetere, quindi serrare la sutura 7-0 sul ramo posteriore alla vena porta. Due ore dopo l'inizio della riperfusione, prelevare lentamente 0,5 millilitri di sangue dalla vena cava inferiore, seguito da un lento trasferimento a goccia del sangue in una nuova fiala.

Applicare una leggera pressione per fermare l'emorragia dalla vena, se necessario. Quindi centrifugare il sangue e congelare metà del siero per l'elaborazione a valle, come appena dimostrato. Al punto finale sperimentale, incidere il diaframma in un cerchio e recidere qualsiasi tessuto connettivo aggiuntivo che rimane collegando il fegato alla cavità peritoneale.

Raccogli il fegato e ottieni quattro grandi campioni dai lobi sinistro e mediano e quattro grandi campioni dal lobo destro. Quindi posizionare i campioni in fiale etichettate singolarmente e congelare i tessuti in azoto liquido per la lavorazione a valle. La misurazione dell'alanina aminotransferasi sierica in animali con soluzione fisiologica normale e con PEG-SOD ha dimostrato una differenza significativa tra i livelli di espressione degli enzimi epatici di controllo sierico e quelli sperimentali degli enzimi epatici animali a 120 minuti dopo la riperfusione.

L'espressione della malondialdeide tissutale nel lobo destro non ilare non mostra una differenza significativa tra il gruppo di controllo e quello sperimentale. Il lobo sinistro post-ilare e il lobo di riperfusione, tuttavia, dimostrano un livello significativamente più elevato di espressione della malondialdeide tissutale rispetto al lobo di controllo non riperfuso, non infuso e al lobo destro infuso di PEG-SOD. Lo stesso modello si osserva anche per l'espressione del glutatione nei tessuti.

L'analisi del western blot indica un aumento del livello di espressione della caspasi-3 scissa nel lobo sinistro dopo clamp ilare e riperfusione che è diminuito negli animali trattati con infusione di PEG-SOD, differenze che sono confermate come significative dalla densitometria. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre ore e 30 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottenere una trazione sostanziale sul ramo della vena porta per l'incannulamento quando si posiziona il morsetto della vena porta distale.

Una volta padroneggiata questa procedura, può essere utilizzata per esplorare l'impatto di una varietà di sostanze farmacologiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incannulare il sistema venoso portale sinistro.