Name: Isolamento e coltura di cellule endoteliali primarie dalle arterie e vene Canine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Impara a isolare e coltivare cellule endoteliali primarie da vasi sanguigni canini. Questo metodo consente di ottenere culture pure per studiare malattie cardiovascolari e angiogenesi in vitro.

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Gli autori desiderano ringraziare Hans de Graaf e Tomas Veenendaal per la loro assistenza tecnica nella coltivazione delle CE.

Etica dichiarazione: I vasi sanguigni utilizzati in questo studio sono state raccolte come materiale in eccesso ottenuti da cadaveri freschi canino (n = 4) da cani sani eutanasia per altre ricerche non correlate (politica Università 3R). vasi sanguigni aberranti (shunt porto intra- e extra-epatiche, n = 1 ciascuno) sono state raccolte post mortem dopo consenso informato dei proprietari di cani presentati alla clinica universitaria per Animali da Compagnia di Università di Utrecht. 1. Isolamento e la coltura di cellule primarie Canine endoteliali <ol><li> Pre-coat 6 pozzetti con 2 ml / pozzetto 0,5% w / v di gelatina e lasciare per 2 ore in un incubatore con atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C. Rimuovere soluzione di gelatina in eccesso prima semina delle cellule primarie. </li><li> Asetticamente rimuovere il vaso sanguigno (s) di interesse (ad esempio, aorta, vena cava, vena porta) a partire da un fresco canino cadavere (Figura 1A). Mantenere l&#39;anatomia del sistema naveponendo pinze diritte su entrambe le estremità del vaso di interesse. Evitare manipolazioni inutili del tessuto con una pinza per evitare danni alle cellule endoteliali. <ol><li> Tagliare la nave bloccato su entrambe le estremità con le forbici chirurgiche e togliere dal cadavere. Trasporti in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) su ghiaccio. NOTA: Una lunghezza imbarcazione di circa 5 cm è preferito per questa procedura, ma quelli che misurano 1 cm fornirà anche abbastanza cellule per la cultura. </li></ol></li><li> Trasferire il vaso sanguigno di una capsula di Petri riempite con HBSS ghiacciata. Utilizzando le forbici chirurgiche, rimuovere eventuali tessuti aderenti e grasso dall&#39;esterno del recipiente, mantenendo il recipiente stesso intatta (Figura 1B). Assicurarsi che il vaso è ben visibile in ogni momento durante il taglio: tirare a parte il tessuto circostante con un morsetto o pinze per la visualizzazione ottimale. <ol><li> Chiudere tutti i rami della nave con legature (ad esempio, Polyglactin 3-0) e, successivamente, rimuoverlicon le forbici chirurgiche o un bisturi. </li></ol></li><li> Immettere cautela un&#39;estremità recipiente con curve pinza zanzara Halsted, bloccare la punta della pinza all&#39;altra estremità della nave e quindi ritrarre, invertendo lentamente il serbatoio finché è completamente esterno (Figura 1C-G). L&#39;esterno ora consiste dello strato di cellule endoteliali. Se si incontra difficoltà sulla invertendo il vaso, immergerlo in HBSS nuovamente per ridurre l&#39;attrito. </li><li> Posizionare suture a borsa di entrambe le estremità della nave per chiuderla completamente e per evitare l&#39;esposizione di qualsiasi tessuto vascolare non-endoteliale alla procedura di digestione (Figura 1H). Utilizzare le estremità legatura di manipolare la nave rovesciata. </li><li> Se la digestione e la cultura viene eseguita in seguito, cryopreserve la nave rovesciata prima del protocollo di digestione (passo 1,7). <ol><li> Posizionare il vaso rovesciato in una provetta Microbank ™ e riempire con colture cellulari congelamento media. Antigelo fino a -80 ° C con una co congelamentontainer. Conservare a -80 ° C se i vasi devono essere utilizzati entro una settimana. Per la conservazione a lungo termine, luogo cryovials a -180 ° C. Quando si esegue l&#39;isolamento CE, scongelare i cryovials rapidamente in un bagno d&#39;acqua (37 ° C) e collocare immediatamente in ghiaccio freddo HBSS. Procedere come indicato in 1.7. NOTA: Prendere in considerazione che la resa totale di EC dopo l&#39;isolamento sarà inferiore a causa della perdita di vitalità durante il processo di congelamento. </li></ol></li><li> Trasferire la nave verso un tubo da 50 ml e lavare due volte in HBSS per rimuovere gli eritrociti (o medio congelamento residua in caso di scongelamento) (Figura 1I). </li><li> Digerire il vaso in un tubo da 50 ml con una soluzione di 30 ml di collagenasi di tipo II (0,15 U / ml) e dispasi (0,15 U / ml) in cellule Canine endoteliali Growth Medium (CECGM) per 1 ora a 37 ° C con intermittente delicato agitazione. </li><li> Rimuovere il recipiente dal tubo e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 250 x g. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in un CECGMND seme 2 sospensione cellulare ml per bene (1 - 3 pozzi a seconda delle dimensioni nave). Coltivare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO 2 in aria e cambiare il terreno di coltura due volte a settimana. </li><li> Passaggio delle cellule quando una confluenza di 70 - si raggiunge l&#39;80%. <ol><li> Lavare le cellule con HBSS preriscaldata per rimuovere le cellule morte o non iscritti. Aggiungere 200 ml ricombinante enzima cellulare-dissociazione (1x) per ciascun bene e mettere di nuovo in incubatrice per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule sono staccati. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e fermare tripsinizzazione con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreni di coltura (CEGM) di cui 10% siero fetale di vitello (FCS). Centrifugare per 5 min a 250 x g. Continuare la cultura in un piatto di gelatina pre-verniciato o pallone. </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione <ol><li> Culture cellule endoteliali aortiche Canine (CnAOECs) e confrontare la morfologia delle linee cellulari primarie e commerciale due volte alla settimana con un microscopio. NOTA: Tegli tipico modello di crescita di cellule endoteliali in patch può essere meglio osservato quando viene raggiunta una confluenza di&gt; 70%. <ol><li> Culture CnAOECs in CECGM su una beuta T75 0,5% w / v di gelatina prerivestita. cellule Passage una volta alla settimana quando la confluenza è del 70 - 80%. <ol><li> Per passaging, lavare le cellule una volta con HBSS preriscaldata e aggiungere 1 ml ricombinante cella-dissociazione enzimatica (1x). Porre il pallone torna in incubatrice per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule sono staccati. Inattivare tripsina con l&#39;aggiunta di mezzo di coltura 10 ml (CEGM) incluso 10% FCS. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 250 xg, scartare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura 1 ml. </li><li> Prendete una aliquota di 10 microlitri di sospensione cellulare e diluire 1: 1 con il 0,4% trypan blu. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato, e piastra out 4.0 x 10 5 cellule vitali in un pallone nuovo T75. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato CECGM al pallone e coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO 2. </li></ol></li></ol></li><li> Isolare RNA dal passaggio 1 delle CaPECs coltivate e CnAOECs. <ol><li> Raccogliere almeno 1 x 10 3 cellule come pellet, aggiungere 20 ml di preparazione del campione reagente (SPR) e incubare per 1 min per lisare le cellule. Dopo l&#39;incubazione, raccogliere con attenzione il lisato cellulare contenente RNA totale e conservare a -70 ° C. </li></ol></li><li> Convertire mRNA in cDNA utilizzando un kit di sintesi di cDNA (ad esempio, iScript) seguendo le istruzioni del produttore. Conservare cDNA a 4 ° C fino a una settimana, oa -20 ° C per il lungo termine fino al momento di eseguire la qPCR. </li><li> Misurare l&#39;espressione del gene del CD31 marcatore endoteliale per confermare l&#39;origine delle cellule endoteliali. Eseguire l&#39;impostazione sperimentale e quantificazione utilizzando le linee guida precis MIQE 10. Per la normalizzazione, misurare l&#39;espressione di geni di riferimento GAPDH, RPS19, e B2MG 11. <ol><li> Preparare una diluizione di 10 volte del cDNA ottenuto in acqua priva di nucleasi. </li><li> Preparareuna diluizione di 4 volte da campioni di cDNA pool per la linea standard e utilizzare l&#39;acqua priva di nucleasi come un controllo non-modello. Diluire i campioni cinque volte per raggiungere una diluizione totale di 50 volte per le reazioni qPCR. Pipettare 10 microlitri reazioni in duplicato in un formato da 384 pozzetti con 4 ml di cDNA e 6 ml di fluoroforo mescolato con 20 pmol di retromarcia e primer forward (Tabella 1). </li><li> Impostare il programma a 95 ° C per 5 minuti per l&#39;attivazione polimerasi Taq, seguita da 39 cicli di 10 secondi a 95 ° C per la denaturazione, e 30 sec a Tm per la ricottura e l&#39;allungamento. La Tm di ogni primer è mostrato nella Tabella 1. </li><li> Eseguire la fusione curva di analisi eseguite dopo ogni corsa al fine di garantire un solo prodotto è amplificato. Normalizzare i livelli di espressione dei campioni con la quantità media relativa dei geni di riferimento, e calcolare il ΔCt se l&#39;efficienza reazione è compresa tra il 95% e il 105%. </li></ol></li><li> Valutare la funzionalità CE con un Angisaggio ogenesis. <ol><li> Aggiungere 10 ml di matrice extracellulare a ciascun pozzetto di una slitta pre-raffreddata angiogenesi e diffondere con un puntale per coprire la superficie del pozzetto. Mantenere la matrice extracellulare su ghiaccio ed evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria nel gel. Solidificare il gel ponendo il vetrino in una capsula di Petri con acqua imbevuto asciugamani di carta in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per 30 min. </li><li> Aggiungere 1,0 x 10 4 primario EC in 50 microlitri Endothelial Growth medio per pozzetto. Incubare il vetrino per 6 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Dopo 6 ore scattare fotografie con un ingrandimento 20x, avendo cura di includere l&#39;intera bene nell&#39;immagine. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Failure+Models%3A+Traditional+and+Novel+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Vasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy.</a> Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).</li>
<li>van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+liver+shunts+in+dogs+elucidate+pathways+regulating+embryonic+development+and+clinical+disorders+of+the+portal+vein%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein.</a> Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).</li>
<li>Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phosphorylation+of+the+mTORC2%2FAkt%2F4E-BP1+pathway+in+newly+derived+canine+hemangiosarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines.</a> BMC Vet. Res. 8 (1), 128(2012).</li>
<li>Boilson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circulating+progenitor+cells+in+left+ventricular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction.</a> Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinolysis+and+proliferative+endarteritis%3A+two+related+processes+in+chronic+infections%3F+The+model+of+the+blood-borne+pathogen+Dirofilaria+immitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124445(2015).</li>
<li>Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+radicals+mediate+endothelial+cell+damage+by+complement-stimulated+granulocytes.+An+in+vitro+model+of+immune+vascular+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage.</a> J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).</li>
<li>Aranguren, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+a+novel+transcription+factor+code+determining+the+human+arterial-specific+endothelial+cell+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature.</a> Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).</li>
<li>van Balkom, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+require+miR-214+to+secrete+exosomes+that+suppress+senescence+and+induce+angiogenesis+in+human+and+mouse+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells.</a> Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).</li>
<li>Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+%28HUVEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).</a> J. Vis. Exp. (3), e183(2007).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIQE+precis%3A+Practical+implementation+of+minimum+standard+guidelines+for+fluorescence-based+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments.</a> BMC Mol. Biol. 11, 74(2010).</li>
<li>Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+canine+reference+genes+for+accurate+quantification+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).</li>
<li>Heishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-214+and+MicroRNA-126+Are+Potential+Biomarkers+for+Malignant+Endothelial+Proliferative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases.</a> Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).</li>
<li>Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterisation+of+canine+mitral+valve+interstitial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells.</a> Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).</li>
<li>van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+congenital+portosystemic+shunts%3A+disconnections+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected.</a> The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).</li>
<li>Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+%28VEGF%29+levels+in+the+blood+serum+of+dogs+with+malignant+neoplasms+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Vet.+Hung%22%5BJournal%5D)">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity.</a> Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+study+of+hydralazine%2C+a+potential+anti-angiogenic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent.</a> Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

In studi incentrati sul canino EC linea primaria CnAOEC viene utilizzato per modellare le linee endoteliali del cane 3, 12, 13. Negli studi umani, la cultura HUVEC è ancora considerato il gold standard. Chiaramente, concentrandosi solo sulla EC derivate da cordone ombelicale è una restrizione fermo nella ricerca cardiovascolare. Le cellule endoteliali hanno una specifica pattern di espressione genica che determina le specifiche artero-venosa. Per tenere conto di queste differenze di vasi postnatale presentiam...

I cani vengono utilizzati come grande modello animale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e possono anche soffrire di innata (genetici) anomalie vascolari 1, 2. Per studiare queste malattie linee di cellule endoteliali commerciali sono spesso utilizzati per valutare la funzionalità delle cellule endoteliali (CE). Per i cani c&#39;è una linea commerciale delle cellule endoteliali a disposizione (CnAOEC), derivato da dell&#39;aorta canino. Questa linea cellulare è usato soprattutto in studi come normale controllo EC 3-5. Nella ricerca cardiovascolare umano linee di cellule endoteliali più comunemente usati sono cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC) e ombelicale umano Arteria cellule endoteliali (HUAECs) derivate dalla vena umana cordone ombelicale e delle arterie, rispettivamente. HUVECs sono stati usati come il golden standard nel campo della ricerca vascolare dal 1980 6. Essi sono considerati essere il sistema modello classico per studiare la funzione endoteliale e adattamento malattia. Le cellule endoteliali isolate da diversi vasi sanguigni variano in appearancE e funzionalità a causa di background genetico e l&#39;esposizione al microambiente 7. Inoltre, HUVEC e HUAECs derivano dal cordone ombelicale, una struttura vascolare sviluppo che potrebbero non pienamente mimici vasi sanguigni adulto rispetto alle condizioni a cui sono esposti e la risposta alla malattia. Quindi, traducendo Risultati trovati in HUVECs e HUAECs per le malattie cardiovascolari, in generale, è inadeguata. Quando si studia l&#39;adattamento e il comportamento degli adulti EC, EC primari dal vaso di interesse dovrebbero essere usati come un approccio più diretto. Per isolare queste cellule, sono stati riportati diversi metodi. Un metodo ampiamente descritto, che è anche usato per HUVEC, sta eliminando il recipiente con una soluzione digestione enzimatica 8. Questo si traduce spesso in contaminazione con non-EC come le cellule muscolari lisce e fibroblasti 9. Un altro metodo frequentemente utilizzato per l&#39;isolamento è la digestione enzimatica del tessuto nave tritato seguito da fluorescence-cellule attivate (FACS) basato su endoteliali Cluster indicatore di cella di differenziazione (CD) 31 7, 8. FACS ordinamento e successiva coltura cellulare richiede quantità relativamente elevate di cellule e non è quindi adatto per l&#39;isolamento di endotelio da piccoli vasi sanguigni. Abbiamo quindi finalizzata allo sviluppo di un nuovo metodo robusto per isolare una popolazione di cellule endoteliali puro da vari vasi sanguigni canine con elevata purezza. Per verificare l&#39;efficacia del nuovo metodo di isolamento, abbiamo isolato e ottenuto colture pure Canine endoteliali primarie cellulare (CAPEC) da diverse arterie e vene canini, grandi e piccoli. Questo metodo consente anche la cultura di cellule endoteliali provenienti da malati e / o vasi aberranti come innate shunt porto intra o extra-epatiche, una malattia comune nei cani 2. Il metodo permette l&#39;isolamento di altri tipi di cellule competenti della stessa nave, come le cellule muscolari lisce vascolari poiché la maggior parte della nave rimane intagire durante la procedura.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt</td> Solution <td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali canine&nbsp;</td><td>Applicazioni cellulari</td><td>Cn211-500</td><td></td></tr><tr><td>CnAOEC</td><td>Applicazioni cellulari</td><td>Cn304-05</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>SPR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8898</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento delle cellule di recupero</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12648-010</td><td>Tenere in ghiaccio prima dell'uso</td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche (Mayo o Metzenbaum)</td><td>B. Braun Medical</td><td>BC555R</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per zanzare&nbsp;</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB440R</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per zanzare curve</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB441R</td><td></td></tr><tr><td>polyglactin 3-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP311H</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio automatizzata</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di conteggio, doppia camera</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356231</td><td>Scongelare lentamente su ghiaccio</td></tr><tr><td>&micro;-Slide Angiogenesis</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr><tr><td>Endoteliale Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuot Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di cellule endoteliali primarie dalle arterie e vene canine

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Le malattie cardiovascolari sono studiate sia in medicina umana che veterinaria. Le cellule endoteliali sono state ampiamente utilizzate come modello in vitro per studiare la vasculogenesi, l'angiogenesi (tumorale) e l'aterosclerosi. L'attuale standard per la ricerca in vitro sulle cellule endoteliali umane (EC) è l'uso di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) e delle cellule endoteliali dell'arteria ombelicale umana (HUAECs). Per la ricerca sull'endotelio canino, è disponibile solo una linea cellulare (CnAOEC), derivata dall'endotelio aortico canino. Anche se attualmente non è completamente compresa, esiste una differenza tra le EC che originano dalle arterie o dalle vene. Per un approccio più diretto agli studi di funzionalità in vitro sulle CE, descriviamo un nuovo metodo per isolare le cellule endoteliali primarie canine (CaPEC) da una varietà di vasi. Questa tecnica riduce la possibilità di contaminazione con cellule a crescita rapida come i fibroblasti e le cellule muscolari lisce, un problema comune nei metodi di isolamento standard come il lavaggio del vaso con soluzioni enzimatiche o la macinazione del vaso prima della digestione del tessuto contenente tutte le cellule. La tecnica che descriviamo è stata ottimizzata per il modello canino, ma può essere facilmente utilizzata in altre specie come l'uomo.

Diversi vasi sanguigni sono stati sottoposti con successo al protocollo descritto isolamento (Figura 2). Era possibile sezionare e invertire aorta, vena cava, vena porta, e l&#39;arteria coronaria da cani sani (tutte le navi da ciascun cane, n = 4). Con le stesse EC approccio sono stati isolati da due shunt porto congenite (extraepatica e intraepatica, n = 1 ciascuno). Anche se dell&#39;aorta era facilmente invertita, segmenti dell&#39;aorta toracica sono stati più impeg...

Sono necessari nuovi metodi di isolamento delle cellule endoteliali primarie dai vasi sanguigni. Questo protocollo descrive una nuova tecnica che inverte completamente i vasi sanguigni di interesse, esponendo solo il lato endoteliale alla digestione enzimatica. La coltura di cellule endoteliali pure risultante può essere utilizzata per studiare le malattie cardiovascolari, la modellizzazione delle malattie e l'angiogenesi.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali primarie dalle arterie e vene Canine

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare e coltivare cellule endoteliali primarie da cani per studiare in vitro le malattie cardiovascolari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca cardiovascolare, come il comportamento delle cellule endoteliali durante l'angiogenesi, l'angiogenesi tumorale e l'aterosclerosi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è possibile ottenere e coltivare una popolazione pura di cellule endoteliali primarie anche da vasi sanguigni molto piccoli.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché l'inversione e la sutura del vaso possono sembrare complesse, ma in realtà sono facilmente apprendibili nella pratica. Per isolare e coltivare cellule endoteliali primarie canine o CAPECs, utilizzare gelatina allo 0,5% per pre-ricoprire piastre a sei pozzetti e incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per due ore. Dopo aver rimosso in modo asettico i vasi sanguigni di interesse da un cadavere canino seguendo il protocollo descritto nel testo, trasferire i vasi sanguigni in piastre di Petri riempite con HBSS freddo di ghiaccio.Quindi, utilizzando forbici chirurgiche, rimuovere qualsiasi tessuto aderente e grasso dall'esterno del vaso, assicurandosi che il vaso stesso sia sempre visibile durante il taglio e mantenendolo intatto. Utilizzare legature per chiudere eventuali rami del vaso, quindi rimuovere i rami con forbici chirurgiche o un bisturi. Con una pinza emostatica curva di Halsted, entrare con attenzione da un'estremità del vaso, stringere la punta della pinza all'altra estremità del vaso e quindi ritrarre lentamente, invertendo il vaso fino a quando non risulti completamente rivoltato, con lo strato di cellule endoteliali all'esterno.È importante mantenere il vaso sanguigno umido con HBSS per facilitare il processo di inversione. Successivamente, posizionare suture a borsa su entrambe le estremità del vaso per chiuderlo completamente ed evitare l'esposizione di qualsiasi tessuto vascolare non endoteliale alla digestione. Quindi, utilizzando i capi della ligatura per manipolare il vaso invertito, trasferire il vaso in una provetta da 50 millilitri e usare HBSS per risciacquarlo due volte, al fine di rimuovere gli eritrociti o il mezzo di congelamento residuo nel caso di scongelamento.Aggiungere 30 millilitri di collagenasi di tipo due e dispasi in mezzo di crescita per cellule endoteliali canine o CECGM e incubare il tubo a 37 gradi Celsius con agitazione delicata per digerire il vaso. Rimuovere il vaso dal tubo e centrifugare la sospensione cellulare a 250 ×g per cinque minuti. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in CECGM e seminare due millilitri della sospensione per pozzetto in uno a tre pozzetti, a seconda delle dimensioni del vaso.Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5%CO2 in aria e cambiare il mezzo di coltura due volte alla settimana. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 70-80%, utilizzare HBSS preriscaldato per rimuovere le cellule morte o non aderenti. Quindi aggiungere 200 microlitri di enzima ricombinante per la dissociazione cellulare in ogni pozzetto e reinserire la piastra nell'incubatore per cinque minuti o fino al distacco delle cellule.Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e arrestare la tripsinizzazione aggiungendo 10 millilitri di CECGM con FCS al 10%, centrifugare per cinque minuti a 250 ×g. Proseguire quindi la coltura in una piastra o fiala pre-ricoperta con gelatina. Per caratterizzare le cellule endoteliali aortiche canine o CnAOECs, coltivare le cellule in CECGM in una fiala T75 pre-ricoperta con gelatina allo 0,5%.Quando le CnAOEC raggiungono una confluenza del 70-80%, trattare le cellule con tripsina come mostrato in precedenza in questo video. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 250 ×g per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e utilizzare un millilitro di mezzo di coltura per risospendere le cellule.Diluire un'aliquote di 10 microlitri della sospensione cellulare in rapporto uno a uno con Trypan Blue allo 0,4%. Quindi utilizzare un contatore cellulare automatico per contare le cellule e seminare quattro volte 10 alla quinta cellule vitali in un nuovo fiasco T75. Aggiungere 10 millilitri di CECGM preriscaldato al fiasco e coltivare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5%CO2.Per isolare l'RNA dal primo passaggio di CAPECs e CnAOECs, raccogliere almeno una volta 10 alla tre cellule come pellet. Aggiungere 20 microlitri di reagente per la preparazione del campione e incubare per un minuto per lisare le cellule. Al termine dell'incubazione, conservare il campione a -70 gradi Celsius.Misurare l'espressione genica e valutare la funzionalità delle cellule endoteliali (EC) secondo il protocollo descritto nel testo. Utilizzando il protocollo dimostrato in questo video, è stato possibile dissezionare e invertire l'aorta, la vena porta, la vena cava e l'arteria coronarica da cani sani e da due shunt portosistemici congeniti. Tra una e due settimane dopo l'isolamento, cellule endoteliali aderenti erano visibili nella piastra di coltura.Le CAPEC provenienti dall'aorta, dalla vena cava e dalla vena porta avevano una forma poligonale, crescevano in colonie e raggiungevano una confluenza dell'80% dopo 10 giorni di coltura. In media, le cellule potevano essere mantenute per un massimo di otto passaggi, dopodiché smettevano di crescere. Come mostrato qui mediante qPCR, le cellule endoteliali isolate esprimevano il marcatore delle cellule endoteliali CD31.L'espressione nelle cellule endoteliali derivate dall'aorta, dalla vena cava e dalla vena porta di quattro cani ha mostrato un'espressione di CD31 paragonabile a quella di una coltura controllo di CnAOECs. Questa figura mostra che le CAPECs derivate dall'aorta, dalla vena cava e dalla vena porta hanno sviluppato ramificazioni sei ore dopo l'incubazione sulla lamella per angiogenesi. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in tre ore.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di lavorare in modo asettico. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come i saggi di angiogenesi possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio se il silenziamento genico o determinati farmaci influenzeranno il comportamento delle cellule endoteliali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare cellule endoteliali primarie dai vasi sanguigni, una tecnica che può essere applicata anche a vasi sanguigni normali e anomali di altre specie.

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