Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a S -citalopram

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare un trasportatore che sia sufficientemente stabile per gli studi strutturali e utilizzare questo trasportatore modificato per produrre cristalli che si defrangono ad alta risoluzione mediante cristallografia a raggi X. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale, come ad esempio come risolvere la struttura delle proteine di membrana che sono importanti bersagli farmacologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per selezionare da una conformazione legata al farmaco utilizzando un saggio funzionale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui trasportatori dei neurotrasmettitori, può anche essere applicato a recettori, canali e proteine solubili, che legano piccole molecole con elevata affinità. Risospendere accuratamente le cellule negative di GnTI HEK293S tripsonizzate in DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino a una densità di 0,5 milioni di cellule per millilitro in un serbatoio di pipette monouso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzetto di una piastra rivestita di poli-D-lisina.

Risospendere le cellule nel serbatoio della pipetta dopo aver riempito ciascuna piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius con l'8% di anidride carbonica. Sostituire il terreno cellulare un'ora prima della trasvezione.

Preparare i complessi di reagenti per la trasvezione del DNA mescolando 450 nanogrammi di DNA con 45 microlitri di DMEM privo di siero per ogni costrutto nel background TC certificato da sottoporre a screening. Quindi aggiungere 1,6 microlitri di reagente di trasvezione a 45 microlitri di DMEM senza siero e mescolare. Aggiungere immediatamente la soluzione diluita del reagente di trasvezione alla soluzione di DNA e mescolare.

Non mescolare le soluzioni nell'ordine inverso. Attendere da 10 a 15 minuti prima di aggiungere 20 microlitri della miscela di DNA del reagente di trasvezione in quattro dei pozzetti. Incubare le cellule con 200 nanomolari di citalopram e 25 microlitri di TBS per cinque minuti a temperatura ambiente.

Per solubilizzare le cellule, aggiungere 25 microlitri di C12M da otto millimolari, un CHS millimolare e un cocktail di inibitori della proteasi in TBS. Incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 50 microlitri di TBS con 20 citalopram triziato nanomolare, albumina sierica bovina allo 0,1% e milligrammi per millilitro del suo saggio di prossimità a scintillazione di affinità tag o SPA Beads, a tre pozzetti per ciascun costrutto.

Per l'ultimo pozzetto aggiungere la stessa soluzione TBS, ma integrare con sertralina 100 micromolari per determinare il legame non specifico. Assicurarsi che le perle SPA di affinità con tag his siano accuratamente miscelate quando le si aggiunge alla piastra a 96 pozzetti. Misurare il legame del citalopram triziato utilizzando un contatore a scintillazione a 96 pozzetti a temperatura ambiente con un tempo di conteggio di un minuto per pozzetto.

Continuare a contare le piastre fino a quando la conta totale non si stabilizza a circa 36 ore. Dopo la misurazione, riscaldare le piastre per 15 minuti in un blocco riscaldante con coperchio riscaldato a 33 gradi Celsius. Misurare nuovamente il legame con citalopram triziato dopo il riscaldamento.

Ripetere questi passaggi con la modifica della fase di riscaldamento. Regolare le temperature di riscaldamento in base alla temperatura di fusione apparente della proteina bersaglio e alla termostabilità del costrutto più stabile. Continua a riscaldare le piastre fino a quando tutti i costrutti non hanno un basso numero di conteggi specifici.

Coltivare HEK293S cellule GnTI minus in sospensione a 37 gradi Celsius con l'8% di anidride carbonica e l'85% di umidità su uno shaker a 130 RPM e 293 mezzi di espressione integrati con il 2% di siero fetale bovino. Infettare 10 litri di cellule con il virus P2 con una molteplicità di infezione di due e una densità di tre milioni di cellule per millilitro. Da 12 a 16 ore dopo l'infezione, aggiungere butirrato di sodio a una concentrazione di 10 millimolari da un ceppo molare.

Da 48 a 60 ore dopo l'infezione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 volte G per 15 minuti. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 150 millilitri di TBS con 2 escitalopram micromolare o altri inibitori del SERT.

le cellule da 10 litri di coltura in acqua tiepida a circa 30 gradi Celsius e risospenderle facendo passare rapidamente le cellule attraverso una pipetta da 10 millilitri fino ad ottenere un composto omogeneo. Aggiungere tutte le cellule in un becher con una barra di agitazione e aggiungere tutta la soluzione detergente alle celle mescolando. Solubilizzare le cellule a quattro gradi Celsius per un'ora mescolando.

Centrifugare il lisato a 8.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante in provette pulite da ultra centrifuga e scartare il pellet. Quindi centrifugare il surnatante a 100.000 volte G per un'ora in un'ultra centrifuga.

Dopo l'ultracentrifugazione, filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 micron e scartare il pellet. Successivamente, passare il lisato su 10 millilitri di resina di affinità per lo streptococco in una colonna utilizzando una pompa perisaltica bilanciata in tampone di lavaggio. Quindi collegare una colonna di affinità per lo streptococco a un sistema di cromatografia liquida di proteine veloci e lavare la colonna a due millilitri al minuto con 66 millilitri di tampone di lavaggio.

Eluire la proteina purificata nello stesso tampone di lavaggio integrato con cinque millimolari di destiobiotina a 0,5 millilitri al minuto utilizzando 33 millilitri di tampone. Raccogli frazioni di un millilitro. Le frazioni di picco saranno di circa 10 millilitri.

Per formare i complessi anticorpali trasportatori, prima digerire la proteina purificata durante la notte a temperatura ambiente con trombina per rimuovere i tag e Endo H per la deglicosilazione. Concentrare la proteina a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro e un volume da 250 a 300 microlitri utilizzando un concentratore di proteine da centrifuga con taglio del peso molecolare da 100 kilodalton. Miscelare la proteina SERT concentrata con 8B6 Fab a un rapporto molare da uno a 1,2 in un volume inferiore a 500 microlitri.

Centrifugare la miscela a 100, 000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante contenente il complesso SERT Fab e scartare il pellet. Separare il complesso utilizzando la cromatografia liquida di proteine veloci su una colonna di esclusione dimensionale.

Equilibralo con TBS integrato a 0,5 millilitri al minuto. Prima della cristallizzazione, concentrare le frazioni di picco dalla separazione del complesso a due milligrammi per millilitro utilizzando un concentratore di proteine da centrifuga con taglio del peso molecolare da 100 kilodalton. Un'assorbanza di due UA a 280 nanometri è pari a un milligrammo per millilitro.

Aggiungi ulteriore Fab con un rapporto di uno a 0,05 complesso alla Fab libera. Aggiungere anche 10 citalopram S libero da micromolari. Dopo aver centrifugato il campione, raccogliere il surnatante contenente il complesso SERT Fab e scartare il pellet.

Installa uno schermo a goccia sospeso a 24 pozzetti a quattro gradi Celsius secondo la tabella uno del protocollo di testo. Pipettare 500 microlitri di ogni soluzione del serbatoio in una piastra a 24 pozzetti a basso profilo con sigillante applicato a ciascun pozzetto. Pipettare 1,5, 1,75 e due microlitri del complesso SERT Fab su un vetrino di vetro siliconato da 18 millimetri.

Quindi pipettare un microlitro di soluzione del serbatoio sopra il campione proteico. I singoli cristalli appariranno entro circa tre giorni e cresceranno fino a 100-175 micrometri dopo 14 giorni. Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi per lo screening della termostabilità in presenza di citalopram triziato.

I valori della temperatura di fusione tracciati rispetto al massimo legame mostrano mutanti con elevata termostabilità ed espressione. Qui sono mostrate le curve di termostabilità per il SERT TC wild-type e i primi tre mutanti, Y110A, I291A e T439S. Questa immagine al microscopio mostra HEK293S cellule GnTI meno che esprimono SERT CC con fluorescenza verde presente sulla membrana cellulare.

La cromatografia ad esclusione dimensionale con rilevamento a fluorescenza di SERT CC mostra un picco maggiore a 15 millilitri. L'analisi mediante SDS-PAGE mostra una singola specie proteica in gran parte priva di contaminanti. Viene mostrata la separazione rappresentativa dei complessi di anticorpi trasportatori mediante cromatografia ad esclusione dimensionale.

Il picco maggiore, che elude a 11,5 millilitri, conteneva sia SERT che Fab, come mostrato su un gel SDS-PAGE. La microscopia ottica del complesso anticorpale SERT legato al citalopram S dopo due settimane di crescita mostra cristalli a forma di prisma di circa 100-175 micron. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come identificare le mutazioni che stabilizzano una proteina di membrana in una conferma legata al ligando e come impostare schermi di cristallizzazione con complessi di anticorpi proteici.

Quando si tenta di eseguire questa procedura è importante ricordare che i ligandi sono necessari per la stabilizzazione del SERT TC e sono essenziali per la cristallizzazione del SERT CC. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia delle condizioni psichiatriche perché il SERT è il bersaglio molecolare di molti farmaci antidepressivi. Seguendo questa procedura, la funzione del SERT purificato può essere caratterizzata utilizzando metodi biochimici e biofisici.