Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un trasportatore sufficientemente stabile per studi strutturali e utilizzare questo trasportatore modificato per produrre cristalli che diffrangano a elevata risoluzione mediante cristallografia a raggi X. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia strutturale, come ad esempio come risolvere la struttura di proteine di membrana che rappresentano importanti bersagli farmacologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata per selezionare una conformazione legata al farmaco mediante un saggio funzionale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui trasportatori di neurotrasmettitori, può essere applicato anche a recettori, canali e proteine solubili, che legano piccole molecole con elevata affinità. Ri-sospendere accuratamente le cellule HEK293S GnTI negative trattate con tripsina nel DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino fino a una densità di 0,5 milioni di cellule per millilitro in un serbatoio per pipetta monouso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di cellule in ogni pozzetto di una piastra rivestita con poli-D-lisina.

Risospendere le cellule nel serbatoio della pipetta dopo aver riempito ogni piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 8% di anidride carbonica. Sostituire il mezzo cellulare un'ora prima della transvezione.

Preparare i complessi del reagente di transvezione del DNA mescolando 450 nanogrammi di DNA con 45 microlitri di DMEM privo di siero per ciascun costrutto nel background cert TC da analizzare. Aggiungere quindi 1,6 microlitri del reagente di transvezione a 45 microlitri di DMEM privo di siero e mescolare. Aggiungere immediatamente la soluzione del reagente di transvezione diluita alla soluzione di DNA e mescolare.

Non mescolare le soluzioni in ordine inverso. Attendere da 10 a 15 minuti prima di aggiungere 20 microlitri della miscela di DNA del reagente di trasvezione a quattro dei pozzetti. Incubare le cellule con 200 nanomolari di citalopram e 25 microlitri di TBS per cinque minuti a temperatura ambiente.

Per solubilizzare le cellule, aggiungere 25 microlitri di C12M a otto millimoli, CHS a un millimolare e cocktail di inibitori della proteasi in TBS. Incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 50 microlitri di TBS contenenti citalopram triziato a 20 nanomolari, albumina sierica bovina allo 0,1% e milligrammi per millilitro di perle per saggio di prossimità scintillometrica con affinità per il tag istidinico o perle SPA, in tre pozzetti per ogni costrutto.

Per l'ultimo pozzetto, aggiungere la stessa soluzione TBS, ma integrata con 100 micromolar di sertralina per determinare il legame non specifico. Assicurarsi che le SPA Beads con affinità per il tag his siano ben miscelate prima di aggiungerle alla piastra a 96 pozzetti. Misurare il legame di citalopram triziato mediante un contatore a scintillazione a 96 pozzetti a temperatura ambiente, con un tempo di conteggio di un minuto per pozzetto.

Continuare a contare le piastre fino a quando i conteggi totali raggiungono una fase di plateau a circa 36 ore. Dopo la misurazione, riscaldare le piastre per 15 minuti in un blocco riscaldante con coperchio riscaldato a 33 gradi Celsius. Misurare nuovamente il legame del citalopram triziato dopo il riscaldamento.

Ripetere questi passaggi modificando il passo di riscaldamento. Regolare le temperature di riscaldamento in base alla temperatura di fusione apparente della proteina bersaglio e alla stabilità termica della costrutto più stabile. Continuare a riscaldare le piastre finché tutti i costrutti non presenteranno conteggi specifici bassi.

Coltivare cellule HEK293S GnTI negative in sospensione a 37 gradi Celsius con il 8% di anidride carbonica e l'85% di umidità su un agitatore a 130 giri al minuto e in mezzo di coltura 293 integrato con il 2% di siero fetale bovino. Infettare 10 litri di cellule con il virus P2 a una molteplicità di infezione di due e a una densità di tre milioni di cellule per millilitro. Da 12 a 16 ore dopo l'infezione, aggiungere il butirrato di sodio fino a una concentrazione di 10 millimolari partendo da una soluzione madre di un molare.

48-60 ore dopo l'infezione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 ×g per 15 minuti. Rimuovere il soprannatante. Risospendere le cellule in 150 millilitri di TBS con 2 micromolari di escitalopram o altri inibitori del SERT.

le cellule da 10 litri di coltura in acqua calda a circa 30 gradi Celsius e risospendere le cellule passandole rapidamente attraverso una pipetta da 10 millilitri fino a ottenere una sospensione omogenea. Aggiungere tutte le cellule in un becher con una barretta magnetica e aggiungere tutta la soluzione detergente alle cellule sotto costante agitazione. Solubilizzare le cellule a quattro gradi Celsius per un'ora con agitazione.

Centrifugare il lisato a 8.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il soprannatante in provette pulite per ultracentrifuga e scartare il pellet. Successivamente, centrifugare il soprannatante a 100.000 ×g per un'ora in un'ultracentrifuga.

Dopo l'ultracentrifugazione, filtrare il sopranatante attraverso un filtro da 0,2 micron e scartare il pellet. Successivamente, far passare il lisato su 10 millilitri di resina di affinità strep impacchettata in una colonna, utilizzando una pompa peristaltica equilibrata con il buffer di lavaggio. Quindi, collegare una colonna di affinità strep a un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni e lavare la colonna a due millilitri al minuto con 66 millilitri di buffer di lavaggio.

Eluire la proteina purificata nel stesso tampone di lavaggio supplementato con destiobiotina 5 millimolare a 0,5 millilitri al minuto utilizzando 33 millilitri di tampone. Raccogliere frazioni da un millilitro. Le frazioni del picco saranno di circa 10 millilitri.

Per formare i complessi anticorpo-trasportatore, digerire innanzitutto la proteina purificata durante la notte a temperatura ambiente con trombina per rimuovere i marcatori e con Endo H per la deglicosilazione. Concentrare la proteina fino a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro e un volume di 250-300 microlitri utilizzando un concentratore proteico per centrifuga con cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton. Mescolare la proteina SERT concentrata con 8B6 Fab in un rapporto molare di uno a 1,2 in un volume inferiore a 500 microlitri.

Centrifugare la miscela a 100.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo la centrifugazione, raccogliere il soprannatante contenente il complesso SERT Fab e scartare il pellet. Separare il complesso mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni su colonna a esclusione dimensionale.

Equilibrare con TBS supplementato a 0,5 millilitri al minuto. Prima della cristallizzazione, concentrare le frazioni di picco ottenute dalla separazione del complesso fino a due milligrammi per millilitro utilizzando un concentratore proteico per centrifuga con cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton. Un'assorbanza di due UA a 280 nanometri corrisponde a un milligrammo per millilitro.

Aggiungere ulteriori Fab in un rapporto di uno a 0,05 complesso rispetto a Fab libera. Aggiungere anche 10 micromolar di citalopram libero S. Dopo la centrifugazione del campione, raccogliere il soprannatante contenente il complesso SERT-Fab e scartare il pellet.

Impostare una schermata in pozzetti sospesi da 24 pozzetti a quattro gradi Celsius secondo la tabella uno nel protocollo del testo. Pipettare 500 microlitri di ciascuna soluzione reservoir in una piastra da 24 pozzetti a profilo basso con sigillante applicato in ogni pozzetto. Pipettare 1,5, 1,75 e due microlitri del complesso SERT Fab su un coprioggetto in vetro siliconato da 18 millimetri.

Quindi pipettare un microlitro di soluzione del serbatoio sopra il campione proteico. I cristalli singoli appariranno entro circa tre giorni e cresceranno fino a 100-175 micrometri dopo 14 giorni. Qui vengono mostrati risultati rappresentativi per lo screening della stabilità termica in presenza di citalopram triziato.

I valori della temperatura di fusione riportati rispetto al legame massimo mostrano mutanti con elevata termostabilità ed espressione. Qui vengono mostrate le curve di termostabilità per il SERT TC di tipo selvaggio e i tre migliori mutanti, Y110A, I291A e T439S. Questa immagine al microscopio mostra cellule HEK293S GnTI negative che esprimono SERT CC con fluorescenza verde presente sulla membrana cellulare.

La cromatografia a esclusione dimensionale con rilevamento della fluorescenza di SERT CC mostra un picco principale a 15 millilitri. L'analisi mediante SDS-PAGE mostra un'unica specie proteica per lo più priva di contaminanti. Viene mostrata una separazione rappresentativa di complessi anticorpo-trasportatore mediante cromatografia a esclusione dimensionale.

Il picco principale eluito a 11,5 millilitri conteneva sia SERT che Fab, come mostrato su un gel SDS-PAGE. La microscopia ottica del complesso anticorpale SERT legato allo S-citalopram dopo due settimane di crescita mostra cristalli a forma prismatica di circa 100-175 micron. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare mutazioni che stabilizzano una proteina di membrana in una conformazione legata a un ligando e di come impostare schermate di cristallizzazione con complessi proteina-anticorpo.

Quando si tenta di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i ligandi sono necessari per la stabilizzazione del complesso ternario di SERT (SERT TC) e sono essenziali per la cristallizzazione del complesso chiuso di SERT (SERT CC). Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle condizioni psichiatriche, poiché SERT rappresenta il bersaglio molecolare di molti farmaci antidepressivi. Dopo aver seguito questa procedura, la funzione di SERT purificato può essere caratterizzata mediante metodi biochimici e biofisici.