Name: Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a S -citalopram (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Scopri la termostabilizzazione e cristallizzazione del trasportatore della serotonina umano con S-citalopram. Questo metodo consente studi strutturali ad alta risoluzione per comprendere i meccanismi di legame dei farmaci antidepressivi.

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Ringraziamo D. Cawley per aver generato anticorpi monoclonali. Ringraziamo A. Penmatsa e K. Wang per aver condiviso le idee e le competenze sviluppate dal trasportatore della dopamina. L. Vaskalis per l'assistenza con le figure, H. Owen per l'aiuto con la preparazione del manoscritto e altri membri del laboratorio di Gouaux per utili discussioni. J.A.C. ha il supporto di una borsa di studio post-dottorato Banting del Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. è supportato dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Siamo particolarmente grati a Bernie e Jennifer LaCroute per il loro generoso sostegno, nonché per il finanziamento del NIH (5R37MH070039). E.G. è un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute.

<ol><li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li>
<li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solute+carrier+6+family+of+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li>
<li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li>
<li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li>
<li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li>
<li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688(2015).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li>
<li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+membrane+protein+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li>
<li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+%28EGFP%29+in+BALB%2Fc+mice%3A+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li>
<li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability%3A+a+crystallographer%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li>
<li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Determinazione della struttura delle proteine di membrana con tecniche biofisiche rimane un&#39;impresa scoraggiante per molti trasportatori clinicamente significativi, recettori e canali 11. Qui condividiamo esperienza dettagliata sviluppato per la determinazione della struttura del trasportatore della serotonina umano legato a S -citalopram. Prevediamo che questi metodi saranno utili per determinare strutture di SERT in altri stati conformazionale, nonché strutture di altre proteine ​​di membrana difficili. Inoltre, le tecniche biochimiche descritte qui possono essere utilizzati anche per la funzione di SERT purificata detersivo e un ambiente lipidico quasi native studiare. SERT cristallizzazione incernierato sullo sviluppo di diversi strumenti e tecniche. In primo luogo, i miglioramenti nel trasportatore stabilità termica prodotte varianti SERT che sono stati ben educati in varie micelle detergenti Dopo l&#39;estrazione del trasportatore dalle membrane 6. In secondo luogo, l&#39;usodel -citalopram ad alta affinità ligando S in tutta la purificazione e cristallizzazione ulteriormente migliorato la stabilità e ridurre l&#39;eterogeneità conformazionale. In terzo luogo, lo sviluppo del sistema di espressione BacMam 7 consentito per la produzione di grandi quantità di SERT in un breve periodo di 2 settimane, facilitando sia l&#39;immunizzazione e cristallizzazione. Infine, lo sviluppo di strategie per selezionare gli anticorpi ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D consentiti per la scoperta di anticorpi 8B6 che promuove imballaggio ben ordinata di complessi SERT-anticorpo in cristalli. Ci sono un certo numero di passaggi critici e reagenti nonché problemi comuni che spesso si verificano durante il protocollo. In primo luogo, la generazione di alta titolo virale SERT P2 può essere problematico. Aggiunta di basse concentrazioni di virus P1 per generare virus P2 come descritto in questo protocollo solito attenua questo problema, e nei casi in cui il titolo del virus P2 è bassa, virus P3 può essere fatta usinvirus g ad una MOI di 0,0001. I virus con un titolo inferiore a 1 x 10 8 particelle virali / ml non devono essere utilizzati e quasi sempre luogo a basse rese di proteine. Per l&#39;espressione, HEK293S GnTI - le cellule sono stati scelti in quanto mancano N -acetylglucosaminyltransferase I attività e, quindi, non può sintetizzare complessi -glycans N, invece produrre solo alta mannosio N -glycans. Unirà Endoh N linked glicosilazione di alte glicani mannosio in due siti a ciclo extracellulare 2 (EL2), lasciando un -acetylglucosamine N attaccato al asparagina. Digestione di N -linked zuccheri riduce l&#39;entropia superficie EL2 che rischia importante per la cristallizzazione. Per la generazione di anticorpi, il SERT IC deve essere utilizzato per l&#39;immunizzazione. GFP è altamente immunogenica 12 e non deve essere utilizzato come tag di fusione per generare anticorpi poiché è difficile da rimuovere completamente SEC. La N- flessibile e C-terminale di SERT anche non eranoincluso nel costrutto per evitare anticorpi contro queste regioni. I topi possono essere immunizzati con 30 mcg di proteine ​​ricostituita; continuare topi immunizzanti fino elevate concentrazioni sieriche di anticorpi possono essere rilevati e produrre cellule ibridomi come descritto 13. Un costrutto termostabilizzato è di solito la scelta migliore per l&#39;immunizzazione; se il trasportatore è ben educati e mantiene l&#39;attività biologica dopo la purificazione, questo è spesso sufficiente a sollevare gli anticorpi. L&#39;anticorpo 8B6 è stata sollevata contro WT SERT. Per cristallizzazione, solo le frazioni di picco da SEC contenenti complesso monodisperse come giudicato da FSEC dovrebbero essere combinati e concentrati. cristalli SERT-8B6 crescono in una ristretta gamma di condizioni e ci sono una serie di passaggi che dovrebbero essere adottate per risolvere i problemi specificamente legati alla crescita dei cristalli SERT. Tris base regolato con HCl non deve essere usato nella soluzione serbatoio, poiché questo buffer non supporta la crescita di cristalli; è quindi critico utilizzare al posto di Tris regolato con NaOH. cristalli SERT crescere in un intervallo di concentrazione ristretta di PEG 400, quindi se i cristalli non crescono o in presenza di tanti piccoli cristalli, sarebbe consigliato anche un piccolo aumento o una diminuzione della concentrazione di PEG 400. Inoltre, l&#39;acido additivo 6-amminoesanoico è stato utilizzato anche nella schermata ottimizzata per migliorare nucleazione. Il rapporto goccia di proteine: soluzione bene è anche un fattore determinante per la crescita dei cristalli. Goccia rapporti di 1,5 - 2: 1 sono raccomandati, con rapporti goccia più vicino a 2: 1 tipicamente sostenere la crescita di cristalli più grandi 3-dimensionale. Infine, l&#39;uso di basso profilo piastre da 24 pozzetti è anche fondamentale verso la crescita dei cristalli, presumibilmente a causa di modifiche del tasso di diffusione del vapore. Un approccio alternativo al metodo SPA è stato sviluppato per schermo per i mutanti che stabilizzano il trasportatore della serotonina topo in una conformazione di cocaina-bound utilizzando un filtro saggio di 5 vincolante. Per contro, il ba SPAsaggio SED consente di passi sequenziali di riscaldamento seguito da determinazione della frazione di SERT, che rimane legato al ligando. Così, questo consente la rapida determinazione della temperatura di fusione da un piccolo numero di campioni. Il metodo SPA si basa sulla disponibilità di un radiomarcato ligando ad alta affinità e se non sono noti ligandi che legano con affinità submicromolari allora sarà necessario un approccio alternativo. Molti altri metodi sono comunemente usati per misurare la stabilità della proteina come legame di coloranti fluorescenti e calorimetria 14, ma sono a basso throughput e sono sia in grado di misurare direttamente la funzione o richiedono grandi quantità di proteine. Se non è possibile utilizzare il metodo SPA, un approccio alternativo ad alta produttività è un FSEC basato termostabilità Assay 15 (FSEC-TS), dove il campione viene riscaldato seguita dalla separazione della frazione del trasportatore rimanente. FSEC-TS è un approccio utile per accedere comportamento cromatografico e lo stato oligomerico ed è apstrumento complementare owerful che può essere utilizzato insieme al metodo di SPA. Un confronto tra i vari sistemi di espressione della proteina comune è stato anche trovato per favorire l&#39;uso di cellule di mammifero per l&#39;espressione del SERT 16 e non sorprende questo è probabile che il caso di molte proteine di origine mammifera. I metodi che abbiamo usato per l&#39;espressione sono stati adattati per il SERT, ma è probabile facilmente adattabile. Condizioni che favoriscono alti livelli di espressione devono essere attentamente identificati variando il tempo di espressione, temperatura, concentrazione di virus, e la presenza di inibitori delle istone deacetilasi quali butirrato di sodio. In genere privilegiamo purificazione di affinità in un detergente a catena lunga come C12M insieme con CHS prima della ricostituzione di mantenere alta affinità di legame ligando. Ricostituzione mediante assorbimento idrofoba è una tecnica mite che abbiamo trovato per essere efficace per molti altri trasportatori e recettori. Se questonon ha esito positivo, la rimozione di detergenti con elevate concentrazioni micellari critiche per dialisi, diluizione o SEC può essere impiegato 17 purché l&#39;antigene è sufficientemente stabile in tali detergenti. Nei casi in cui non vengono rilevati anticorpi adeguati, abbiamo quasi sempre il problema è dovuto alla perdita di funzione o denaturazione dell&#39;antigene e in tali casi ci eseguita con successo nuove vaccinazioni con particolare attenzione alla biochimica delle proteine. Infine, leganti e anticorpi che si legano con alta affinità dovrebbero costituire la base per un esperimento di cristallizzazione razionalmente pianificata e sfruttando una variante termostabile, si può programmare una più ampia gamma di condizioni variando le proprietà dei diversi detergenti. Inoltre, la cristallizzazione in un mesofase lipidico 18 o utilizzando bicelle 19 dovrebbero sempre essere considerati come alternativa alla cristallizzazione in micelle. Questi principi e metodi possono essere utilizzati con una certa modificationi per molte altre proteine ​​transmembrana che sono difficili da esprimere e purificare da altri host di espressione, e sarà particolarmente utile per la determinazione della struttura dei bersagli di farmaci ad alta affinità.

Il trasportatore della serotonina (SERT) è una proteina di membrana integrale che facilita il trasporto della serotonina attraverso le membrane cellulari 1. SERT appartiene ad una famiglia di neurotrasmettitori sodio Symporters (SSN), che comprende anche la dopamina e noradrenalina trasportatori 2. SERT è il bersaglio molecolare di antidepressivi e anti-ansia farmaci ampiamente prescritti che agiscono per inibire in modo competitivo il trasporto della serotonina 3. SERT sfrutta il cotrasporto energeticamente favorevole di sodio per rimuovere neurotrasmettitore dalla fessura sinaptica. Caratterizzazione estesa del sistema serotoninergico ha dimostrato che i cambiamenti nel metabolismo della serotonina sembrano influenzare praticamente tutti i processi neurologici, tra cui umore, il sonno, il dolore, la cognizione, e l&#39;aggressione comportamenti 4. Funzione SERT può essere modificato attraverso l&#39;uso di antidepressivi e selettivo della ricaptazione della serotonina (SSRI), come S -citalopram, nonché da psychostimulanti e farmaci di dipendenza come l&#39;anfetamina e -methylamphetamine N 3,4-methylenedioxy- o &quot;ecstasy&quot; 1,2. SSRI sono estremamente importanti per il trattamento di disturbi dell&#39;umore, ma la base strutturale preciso per la loro azione non è ben compreso. WT SERT è instabile in micelle detergenti, impedendo in tal modo il progresso verso una (3D) struttura tridimensionale del SERT 5,6. Recentemente, abbiamo sviluppato varianti di SERT, che sono robusta stabile in una vasta gamma di detergenti e mantenere l&#39;attività SSRI 6 vincolante. Queste varianti SERT termostabili sono stati selezionati usando un test stabilità termica a base di prossimità scintillazione. Qui si descrive un procedimento per la generazione di anticorpi ad alta affinità che possono legarsi SERT e la purificazione e cristallizzazione di SERT termostabile, in complesso con l&#39;anticorpo e S -citalopram. Questo protocollo presuppone che il SERT e 8B6 geni sono stati successoy clonato in vettori BacMam 7 e insetti di espressione, rispettivamente. Per generare anticorpi, cDNA codificante residui 73-616 di WT SERT è stato clonato in vettore BacMam con un Strep II tag C-terminale (SERT IC). Per la schermata termostabilità, residui SERT 73-616 con GFP C-terminale, Strep II, e 10-His tag (SERT TC) è stato utilizzato. Mutazioni puntiformi individuali sono stati generati in background SERT TC. Per il protocollo di cristallizzazione, la proteina di fusione SERT-GFP è stato utilizzato con TWIN-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] e 10-Le sue etichette, portando i mutanti termostabili, Y110A, I291A, e T439S e le mutazioni di cisteine superficie C554A, C580A e C622A (SERT CC). Sequenze trombina scissione (LVPRGS) sono stati anche inseriti nel SERT CC dopo Q76 e T618 per consentire la rimozione della N- e C-termini. Il plasmide codificante la 8B6 Fab è stato progettato per esprimere sia il pesante e leggeracatene dell&#39;anticorpo con GP67 sequenze secrezione sotto il controllo di due promotori poliedrina separati. Il C-terminale della catena pesante dell&#39;anticorpo 8B6 è stato etichettato con un 8-His tag e un sito di trombina scissione è stato inserito tra la catena pesante e il tag.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &beta;-D-galattopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-tiogalattopiranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Reagente di trasfezione Sf9</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 media</td></tr><tr><td>di espressione Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>S-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Colesteril hemmisuccinato</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerolo</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipidi A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Cervello lipidi polari</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Resina di assorbimento idrofobica</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Utilizzato come anticorpo secondario per Western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltosio, neopentyl glycol</td>, <td>Anatrace</td><td>NG310</td>, <td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr>, <tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td>, <td>Disponibile presso gli autori</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERTIC, Disponibile presso gli autori</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTTC, Disponibile presso gli autori</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTCC, Disponibile presso gli autori</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris è utilizzato per la preparazione di serbatoi di cristallizzazione</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>acido 6-amminoesanoico</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Reagente di trasfezione polimerica per cellule mamaliane</td></tr><tr><td>Rame HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>blocco riscaldante per test di termostabilità</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, blocco termico per piastre PCR</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtro per siringa</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtraggio da 1 L</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale a fondo piatto da 2 L</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale deflettore da 2 L</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Agitatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Resina Strep-Tactina</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Resina di affinità per streptococco</td></tr><tr><td>Estrusore Lipidi</td><td>settentrionali Sistema di</td><td></td><td></td></tr><tr><td>imaging Li-Cor</td> Sistema di imaging <td>Odyssey</td><td></td><td>western blot Colonna</td></tr><tr><td>XK16 Colonna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>utilizzata per la purificazione di Strep-Tactina e Talon</td></tr><tr><td>Concentratore di proteine MWCO da 100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore di proteine MWCO da 30 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Superose 6 (10/300)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Utilizzato per FSEC</td></tr><tr><td>Apparecchio a flusso tangenziale</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &; m filter cella a flusso tangenziale</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa Concentratore a flusso tangenziale</td><td>MWCO Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resina</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag affinity resina utilizzata per la purificazione Fab</td></tr><tr><td>1 mL Colonna HiTrap SP</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Scambiatore cationico utilizzato per la purificazione Fab</td></tr><tr><td>Colonna Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Utilizzato per la separazione SEC della</td></tr><tr><td>piastra VDXm a 24 pozzetti</td> SERT-8B6 <td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti da 18 mm</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di virus Virocyt</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HiTrap SP</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertralina</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; s</em&gt; -citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Il trasportatore della serotonina è un trasportatore di sodio e cloruro-coupled che &quot;pompe&quot; serotonina extracellulare in cellule. S -citalopram è un farmaco usato per trattare la depressione e l&#39;ansia legandosi al trasportatore della serotonina con alta affinità, il blocco della ricaptazione della serotonina. Qui riportiamo una procedura efficace e una serie di strumenti per stabilizzare, espresso, purificare, e cristallizzare serotonina complessi trasportatore-anticorpo legato a S -citalopram e altri antidepressivi. Le mutazioni che stabilizzano il trasportatore della serotonina sono stati identificati usando un saggio di legame -citalopram S. Trasportatore della serotonina espressa in baculovirus-trasdotte HEK293S GnTI - cellule, è stata ricostituita in proteoliposomi e utilizzato per aumentare gli anticorpi ad alta affinità. Abbiamo sviluppato una strategia per scoprire anticorpi che sono utili per studi strutturali. è stato anche istituito un approccio diretto per l&#39;espressione di frammenti di anticorpi nelle cellule Sf9.Complessi Transporter-anticorpo purificato mediante questa procedura sono ben educati e facilmente cristallizzano, la produzione di complessi con S -citalopram che diffract raggi X per 3-4 risoluzione A. Le strategie sviluppate qui possono essere utilizzati per determinare la struttura di altre proteine ​​di membrana impegnativi.

Una libreria di mutanti puntiformi nei precedenti SERT TC è stato creato allo schermo per thermostabilizing mutazioni. mutanti individuali sono stati generati utilizzando mutagenesi standard. Il protocollo di screening utilizza trasfettate cellule HEK293S e uno schermo stabilità termica a base di vicinanza scintillazione all&#39;identità rapidamente mutazioni utili per la cristallizzazione come illustrato nella figura 1A. I valori di tracciato Tm rispetto al limite [3 H] citalopram a temperatura ambiente rivela costruzioni con elevati livelli di termostabilità e di espressione adatti per la purificazione della proteina (Figura 1B). Tre mutanti (Y110A, I291A, e T439S) sono stati combinati per generare una costruzione altamente stabile (Figura 1C). Termostabilità è anche correlata con una maggiore stabilità in brevi detergenti catena necessari per la cristallizzazione del complesso SERT-Fab. L&#39;espressione su larga scala di SERT umano per mezzo di baculovirus-TRansduced HEK293S GnTI - cellule può richiedere meno di 2 settimane e può produrre quantità milligrammo, come illustrato nella Figura 2A. Uso della proteina SERT CC GFP-tagged permette SERT essere convenientemente seguita durante espressione e purificazione mediante fluorescenza (Figura 2B). La nostra strategia di purificazione coinvolto 1) solubilizzazione del SERT legato a S -citalopram da HEK293S GnTI - cellule in C12M in presenza di CHS come un lipide di stabilizzazione; 2) legame di SERT ad una matrice di affinità Strep; 3) la rimozione delle proteine ​​contaminanti da ampi lavaggio; e 4) eluizione del SERT funzionale con tampone contenente desthiobiotin (Figura 2C). La proteina eluita è in gran parte privo di altre proteine rilevabili di Coomassie blu colorazione e monodisperse come giudicato da FSEC (Figura 2D, E). Una strategia simile è stata presa per purificare SERT con un tag Strep II che è stato utilizzato per reconstitution e l&#39;immunizzazione (Figura 3A, B). L&#39;incorporazione di SERT nel proteoliposomi aumenta la emivita plasmatica e la stabilità del SERT e migliora la probabilità di isolamento di anticorpi ad alta affinità. Inoltre, l&#39;inclusione di lipide A, un componente della parete cellulare batterica, serve come un potente adiuvante 9. liposomi multilamellari sono stati preparati con l&#39;aggiunta di tampone ad una miscela di lipidi essiccati in tubi di vetro e risospese in tampone. Estrusione dei liposomi attraverso filtri di dimensione dei pori 200 nm produce monodisperse sospensioni liposomiali unilamellari. I liposomi vengono poi saturati con detergente seguita dall&#39;aggiunta di SERT purificato detergente. Infine, il detersivo viene rimosso mediante aggiunta di resina di assorbimento idrofoba al lipide: miscela detergente. Ulteriori ligando deve essere aggiunto al campione ricostituito per selezionare gli anticorpi che riconoscono la conformazione legato antidepressivo. La presenza dei SERT nelle proteoliposomi deve essere confermata dasolubilizzare un piccolo campione con SDS-PAGE carico dye o C12M e in esecuzione su SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D). linee cellulari derivate da ibridomi che esprimono anticorpi SERT possono essere sottoposti a screening per leganti ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D. Queste proprietà sono cruciali per il successo finale di cristallizzazione, come l&#39;anticorpo deve rimanere saldamente legato a una regione strutturato per promuovere imballaggio di cristallo di omogenei, domini ben ordinate. Nella prima fase, vengono identificati anticorpi che riconoscono regioni non strutturati. SERT è denaturato e cancellato su una membrana di nitrocellulosa; anticorpi che si fissano SERT denaturato saranno occidentale-positivi e probabilmente riconoscere epitopi lineari. Nella Figura 4A, mostriamo 2 esempi di anticorpi che sono occidentali-positivi e probabilmente non utile a promuovere crystallogenesis. Nella Figura 4B, i restanti anticorpi occidentale-negativi vengono incubate con 100 nM SERT-GFP e separati daFSEC. Gli anticorpi che si legano SERT si sposterà il picco GFP-positivi ad una posizione precedente. I complessi SERT-anticorpo può essere diluito ulteriormente in un detergente per determinare se essi possono legarsi con affinità nanomolari seguita da analisi da FSEC. Aggiunta di risultati serotonina a cambiamenti conformazionali il trasportatore e quindi gli anticorpi possono essere nuovo controllo per determinare se possono riconosce specificamente la conformazione SSRI-bound. In Figura 4C, gli anticorpi sono mostrati di impegnare SERT in presenza di serotonina, dimostrando che l&#39;epitopo (s) non cambiano dal SSRI al substrato stato legato. Infine, nella Figura 4D combinazioni di anticorpi sono testati per la loro capacità di legare epitopi distinti, determinando un ulteriore spostamento verso sinistra. Qui il 15B8 o 8A11 anticorpi riconoscono un epitopo che è diverso da 8B6. L&#39;anticorpo 8B6 è stato scelto per ulteriori analisi strutturale basato sullo screening di cristallo preliminare con papaina treaTed Fab. I geni della 8B6 Fab sono stati clonati in un insetto vettore di espressione cellulare. Fab può essere espresso e secreto dalle cellule Sf9 crescono in sospensione. Il 8B6 Fab può essere purificato dal surnatante delle cellule Sf9 da His-tag affinità (Figura 5A, B) e la cromatografia a scambio cationico (Figura 5C, D) con conseguente proteina che appare privo di contaminanti su gel SDS-PAGE. Nella Figura 5E, ricombinante 8B6 Fab è mostrato di legarsi SERT e viene utilizzato in successivi esperimenti biochimici e biofisici. L&#39;affinità purificato SERT CC viene digerito con trombina e Endoh e miscelato con 8B6 Fab per formare un complesso in presenza di S -citalopram. Il complesso transporter-anticorpo viene quindi separato dalla SEC in C8M (Figura 6A) e le frazioni di picco contiene sia SERT e Fab come mostrato mediante SDS-PAGE (Figura 6B). Uso di C8M è cruciale per la formazione di cristalli probabilmente perchéil detersivo catena corta permette una migliore imballaggio tra le molecole nel reticolo cristallino. FSEC è impiegato per determinare quale frazioni devono essere aggregate per la cristallizzazione (figura 6C); frazioni che non sono monodisperse e / o contengono grandi quantità di SERT libero o Fab non dovrebbero essere combinati. Prism cristalli SERT-anticorpo forma possono essere coltivate in presenza di S -citalopram utilizzare questo protocollo per impiccagione diffusione del vapore goccia (Figura 7A). I cristalli risultanti diffrangono i raggi X per una risoluzione di 3,15 Å 10 (Figura 7B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figura 1: scintillazione di prossimità basati termostabilità Assay A.. Sommario del protocollo per lo screening termostabilità in presenza di [3 H] citalopram. B. Massima bound [3 </sup&gt; H] citalopram in funzione della temperatura di fusione apparente (Tm). Le linee tratteggiate rappresentano i valori per il trasportatore WT. I 3 mutanti più termostabili sono etichettati. Zona grigia rappresenta mutanti che hanno meno del 10% di [3 H] citalopram rispetto al WT e valori Tm così imprecise vincolante causa di un basso. C segnale-rumore. Curve termostabilità per WT SERT TC e le prime 3 mutanti. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figura 2: Panoramica dei mammiferi eterologa espressione della proteina A.. Panoramica schematizzato della generazione di virus BacMam ed espressione di SERT in HEK293S GnTI -. Le cellule B. HEK293S GnTI - cellule che esprimono il SERT CC (fluorescenza GFP) C.. Profilo di eluizione del SERT CC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 mm) D.. Analisi di affinità purificato SERT CC su 4 - gel 15% SDS-PAGE E.. FSEC di affinità purificato SERT CC rilevato da GFP fluorescenza (eccitazione: 480 nm; emissione: 510 nm). Il picco eluizione a 15 mL è SERT (#) e 18 ml è GFP gratuita (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figura 3: Rappresentante affinità purificazione e Ricostituzione del SERT IC.. Schema di generazione di anticorpi. &lt;strong&gt; B. Profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione per affinità di SERT IC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 mm) C. Analisi di affinità purificato e ricostituito SERT su un 4 - gel 15% SDS-PAGE D.. FSEC di SERT solubilizzato dopo la ricostituzione. La fluorescenza dei residui di triptofano è stato utilizzato per rilevare SERT (Eccitazione: 280 nm; emissione: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figura 4:. Analisi dei rappresentanti SERT anticorpi A. Lo screening di anticorpi da Western Blot. Circa 1 mg di SERT CC con o senza GFP è stato applicato ad un 4 - 15% SDSgel PAGE e cancellato su una membrana di nitrocellulosa. Binding è stato rilevato utilizzando un anticorpo di capra anti-topo coniugata con IR Dye. 2G4 e 10F2 sono occidentali positivo. B. Il legame di anticorpi a 100 nM SERT GFP-tagged e l&#39;individuazione da FSEC rilevato utilizzando GFP fluorescenza. C. Il legame di Fabs selezionati e 100 nm SERT GFP-tagged in presenza di 1 mm serotonina. D. Il legame di 8A11 o 15B8 Fabs al Sert-8B6 Fab. Picchi minori eluizione a 18 mL sono GFP gratuito. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figura 5: Purificazione Rappresentante del 8B6 Fab da cellule Sf9 A.. profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab da His-tag affinità chromatograp<html> hy. Verde traccia rappresenta la concentrazione di imidazolo, 0 - 50% (0 - 250 mm) B.. Non riducente e riducendo gel SDS-PAGE dopo His-tag purificazione di affinità. Proteine che corre vicino a 50 kDa non è ridotta Fab (#) e specie minori a 25 kDa è ridotta Fab (*). C. profilo Elution osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab mediante scambio cationico visualizzando un singolo picco simmetrico che eluisce con un gradiente di cloruro di sodio lineare. Verde traccia rappresenta la concentrazione di NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mm) D. Analisi della 8B6 Fab su un gel SDS-PAGE 12,5% dopo purificazione mediante scambio cationico. E. Binding della 8B6 Fab 10 Nm SERT GFP-tagged, rilevato utilizzando la fluorescenza della GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6: Rappresentante del gel filtrazione Cromatografia del Complesso SERT-8B6 in presenza di S -citalopram A.. Gel profilo filtrazione eluizione di purificato complesso SERT-8B6. cima principale eluizione a 11,5 mL è il complesso SERT-8B6. Picco a 15 - 17 ml contiene GFP e Fab B.. Analisi del purificato complesso SERT-8B6 su un 4 - gel SDS-PAGE 15%. Le posizioni dei SERT e le catene pesanti e leggere dei Fab sono indicati da un trattino. C. FSEC delle frazioni di dimensioni separate. complessi SERT-8B6 sono stati rilevati utilizzando la fluorescenza del triptofano. Frazione 17 contiene una quantità maggiore di SERT che non ha complesso con Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7: La cristallizzazione del Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. La microscopia ottica di parallelepipedo cristalli a forma del complesso SERT-8B6 dopo 2 settimane di crescita. Barra della scala è uguale a 200 micron. B. cristalli SERT-8B6 diffrangono i raggi X per 3.15 Å. anello blu rappresenta 3.15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Tabella 1:. Una schermata di cristallizzazione per il Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Cliccate qui per scaricare questa tabella.</a>

Questo manoscritto descrive come schermo per thermostabilizing mutazioni, purificare il trasportatore della serotonina umano, generare anticorpi ad alta affinità, e cristallizzare il complesso trasportatore della serotonina-anticorpo legato alla antidepressivo della droga S -citalopram. Questo protocollo può essere adattato allo studio di altri trasportatori di membrana impegnativi, recettori e canali.

Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un trasportatore sufficientemente stabile per studi strutturali e utilizzare questo trasportatore modificato per produrre cristalli che diffrangano a elevata risoluzione mediante cristallografia a raggi X. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia strutturale, come ad esempio come risolvere la struttura di proteine di membrana che rappresentano importanti bersagli farmacologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata per selezionare una conformazione legata al farmaco mediante un saggio funzionale.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui trasportatori di neurotrasmettitori, può essere applicato anche a recettori, canali e proteine solubili, che legano piccole molecole con elevata affinità. Ri-sospendere accuratamente le cellule HEK293S GnTI negative trattate con tripsina nel DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino fino a una densità di 0,5 milioni di cellule per millilitro in un serbatoio per pipetta monouso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di cellule in ogni pozzetto di una piastra rivestita con poli-D-lisina.Risospendere le cellule nel serbatoio della pipetta dopo aver riempito ogni piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 8% di anidride carbonica. Sostituire il mezzo cellulare un'ora prima della transvezione.Preparare i complessi del reagente di transvezione del DNA mescolando 450 nanogrammi di DNA con 45 microlitri di DMEM privo di siero per ciascun costrutto nel background cert TC da analizzare. Aggiungere quindi 1,6 microlitri del reagente di transvezione a 45 microlitri di DMEM privo di siero e mescolare. Aggiungere immediatamente la soluzione del reagente di transvezione diluita alla soluzione di DNA e mescolare.Non mescolare le soluzioni in ordine inverso. Attendere da 10 a 15 minuti prima di aggiungere 20 microlitri della miscela di DNA del reagente di trasvezione a quattro dei pozzetti. Incubare le cellule con 200 nanomolari di citalopram e 25 microlitri di TBS per cinque minuti a temperatura ambiente.Per solubilizzare le cellule, aggiungere 25 microlitri di C12M a otto millimoli, CHS a un millimolare e cocktail di inibitori della proteasi in TBS. Incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 50 microlitri di TBS contenenti citalopram triziato a 20 nanomolari, albumina sierica bovina allo 0,1% e milligrammi per millilitro di perle per saggio di prossimità scintillometrica con affinità per il tag istidinico o perle SPA, in tre pozzetti per ogni costrutto.Per l'ultimo pozzetto, aggiungere la stessa soluzione TBS, ma integrata con 100 micromolar di sertralina per determinare il legame non specifico. Assicurarsi che le SPA Beads con affinità per il tag his siano ben miscelate prima di aggiungerle alla piastra a 96 pozzetti. Misurare il legame di citalopram triziato mediante un contatore a scintillazione a 96 pozzetti a temperatura ambiente, con un tempo di conteggio di un minuto per pozzetto.Continuare a contare le piastre fino a quando i conteggi totali raggiungono una fase di plateau a circa 36 ore. Dopo la misurazione, riscaldare le piastre per 15 minuti in un blocco riscaldante con coperchio riscaldato a 33 gradi Celsius. Misurare nuovamente il legame del citalopram triziato dopo il riscaldamento.Ripetere questi passaggi modificando il passo di riscaldamento. Regolare le temperature di riscaldamento in base alla temperatura di fusione apparente della proteina bersaglio e alla stabilità termica della costrutto più stabile. Continuare a riscaldare le piastre finché tutti i costrutti non presenteranno conteggi specifici bassi.Coltivare cellule HEK293S GnTI negative in sospensione a 37 gradi Celsius con il 8% di anidride carbonica e l'85% di umidità su un agitatore a 130 giri al minuto e in mezzo di coltura 293 integrato con il 2% di siero fetale bovino. Infettare 10 litri di cellule con il virus P2 a una molteplicità di infezione di due e a una densità di tre milioni di cellule per millilitro. Da 12 a 16 ore dopo l'infezione, aggiungere il butirrato di sodio fino a una concentrazione di 10 millimolari partendo da una soluzione madre di un molare.48-60 ore dopo l'infezione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 ×g per 15 minuti. Rimuovere il soprannatante. Risospendere le cellule in 150 millilitri di TBS con 2 micromolari di escitalopram o altri inibitori del SERT.le cellule da 10 litri di coltura in acqua calda a circa 30 gradi Celsius e risospendere le cellule passandole rapidamente attraverso una pipetta da 10 millilitri fino a ottenere una sospensione omogenea. Aggiungere tutte le cellule in un becher con una barretta magnetica e aggiungere tutta la soluzione detergente alle cellule sotto costante agitazione. Solubilizzare le cellule a quattro gradi Celsius per un'ora con agitazione.Centrifugare il lisato a 8.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il soprannatante in provette pulite per ultracentrifuga e scartare il pellet. Successivamente, centrifugare il soprannatante a 100.000 ×g per un'ora in un'ultracentrifuga.Dopo l'ultracentrifugazione, filtrare il sopranatante attraverso un filtro da 0,2 micron e scartare il pellet. Successivamente, far passare il lisato su 10 millilitri di resina di affinità strep impacchettata in una colonna, utilizzando una pompa peristaltica equilibrata con il buffer di lavaggio. Quindi, collegare una colonna di affinità strep a un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni e lavare la colonna a due millilitri al minuto con 66 millilitri di buffer di lavaggio.Eluire la proteina purificata nel stesso tampone di lavaggio supplementato con destiobiotina 5 millimolare a 0,5 millilitri al minuto utilizzando 33 millilitri di tampone. Raccogliere frazioni da un millilitro. Le frazioni del picco saranno di circa 10 millilitri.Per formare i complessi anticorpo-trasportatore, digerire innanzitutto la proteina purificata durante la notte a temperatura ambiente con trombina per rimuovere i marcatori e con Endo H per la deglicosilazione. Concentrare la proteina fino a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro e un volume di 250-300 microlitri utilizzando un concentratore proteico per centrifuga con cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton. Mescolare la proteina SERT concentrata con 8B6 Fab in un rapporto molare di uno a 1,2 in un volume inferiore a 500 microlitri.Centrifugare la miscela a 100.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo la centrifugazione, raccogliere il soprannatante contenente il complesso SERT Fab e scartare il pellet. Separare il complesso mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni su colonna a esclusione dimensionale.Equilibrare con TBS supplementato a 0,5 millilitri al minuto. Prima della cristallizzazione, concentrare le frazioni di picco ottenute dalla separazione del complesso fino a due milligrammi per millilitro utilizzando un concentratore proteico per centrifuga con cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton. Un'assorbanza di due UA a 280 nanometri corrisponde a un milligrammo per millilitro.Aggiungere ulteriori Fab in un rapporto di uno a 0,05 complesso rispetto a Fab libera. Aggiungere anche 10 micromolar di citalopram libero S. Dopo la centrifugazione del campione, raccogliere il soprannatante contenente il complesso SERT-Fab e scartare il pellet.Impostare una schermata in pozzetti sospesi da 24 pozzetti a quattro gradi Celsius secondo la tabella uno nel protocollo del testo. Pipettare 500 microlitri di ciascuna soluzione reservoir in una piastra da 24 pozzetti a profilo basso con sigillante applicato in ogni pozzetto. Pipettare 1,5, 1,75 e due microlitri del complesso SERT Fab su un coprioggetto in vetro siliconato da 18 millimetri.Quindi pipettare un microlitro di soluzione del serbatoio sopra il campione proteico. I cristalli singoli appariranno entro circa tre giorni e cresceranno fino a 100-175 micrometri dopo 14 giorni. Qui vengono mostrati risultati rappresentativi per lo screening della stabilità termica in presenza di citalopram triziato.I valori della temperatura di fusione riportati rispetto al legame massimo mostrano mutanti con elevata termostabilità ed espressione. Qui vengono mostrate le curve di termostabilità per il SERT TC di tipo selvaggio e i tre migliori mutanti, Y110A, I291A e T439S. Questa immagine al microscopio mostra cellule HEK293S GnTI negative che esprimono SERT CC con fluorescenza verde presente sulla membrana cellulare.La cromatografia a esclusione dimensionale con rilevamento della fluorescenza di SERT CC mostra un picco principale a 15 millilitri. L'analisi mediante SDS-PAGE mostra un'unica specie proteica per lo più priva di contaminanti. Viene mostrata una separazione rappresentativa di complessi anticorpo-trasportatore mediante cromatografia a esclusione dimensionale.Il picco principale eluito a 11,5 millilitri conteneva sia SERT che Fab, come mostrato su un gel SDS-PAGE. La microscopia ottica del complesso anticorpale SERT legato allo S-citalopram dopo due settimane di crescita mostra cristalli a forma prismatica di circa 100-175 micron. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare mutazioni che stabilizzano una proteina di membrana in una conformazione legata a un ligando e di come impostare schermate di cristallizzazione con complessi proteina-anticorpo.Quando si tenta di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i ligandi sono necessari per la stabilizzazione del complesso ternario di SERT (SERT TC) e sono essenziali per la cristallizzazione del complesso chiuso di SERT (SERT CC). Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle condizioni psichiatriche, poiché SERT rappresenta il bersaglio molecolare di molti farmaci antidepressivi. Dopo aver seguito questa procedura, la funzione di SERT purificato può essere caratterizzata mediante metodi biochimici e biofisici.

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