Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale via Carotide interna

L'obiettivo generale di questa tecnica chirurgica è quello di fornire sostanze esogene nel cervello del topo senza penetrare nel cranio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze riguardanti l'azione di farmaci, agenti patogeni ed esosomi nel cervello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che provoca un trauma minimo all'animale, preserva l'integrità della rete neuronale e raggiunge alte concentrazioni della sostanza nel cervello.

Inizia somministrando isoflurano mescolato con ossigeno per anestetizzare il topo in una camera di induzione. Dopo l'induzione dell'anestesia, trasferire l'animale sulla superficie chirurgica sotto uno stereomicroscopio e posizionare il cono nasale per mantenere un piano chirurgico di anestesia. Assicurarsi che la frequenza respiratoria sia di circa una o due respire al secondo senza ansimare.

Inoltre, assicurarsi che l'animale non reagisca alla stimolazione dei baffi o a un pizzicamento delle dita dei piedi. Utilizzare un tampone sterile per applicare una goccia di lubrificante oftalmico su ciascun occhio per prevenire la secchezza. Dopo aver rasato il sito chirurgico con un rasoio, preparare l'area con etanolo al 70% e clorexidina.

Mentre guardi attraverso lo stereomicroscopio, usa le forbici chirurgiche e le pinze per creare un'incisione sulla linea mediana nel collo da sopra lo sterno a sotto la mascella. Usa una pinza per separare accuratamente il tessuto adiposo e connettivo per esporre la trachea. Quindi posiziona un oggetto morbido e rotondo di circa zero virgola cinque centimetri di diametro sotto la parte posteriore del collo per estendere il collo ed esporre ulteriormente l'area.

Quindi, separare il tessuto attorno alla trachea usando ganci o un divaricatore tissutale. Sul lato sinistro della trachea, separare con cura il tessuto connettivo per esporre l'arteria carotide comune sinistra, o CCA. Usando una pinza, rimuovere con cura tutto il tessuto connettivo per esporre la biforcazione CCA all'inizio delle arterie carotidi esterne e interne.

Una volta che l'ECA e l'ICA sono esposti, utilizzare una pinza per posizionare un segmento di sutura di nylon di un centimetro sotto l'arteria carotide esterna. Quindi posizionare un secondo segmento di un centimetro. Quindi fare un nodo permanente nel punto più alto possibile dell'ECA.

Nel punto più basso possibile dell'ECA, immediatamente sopra la biforcazione CCA, fare un nodo più sciolto e rimovibile. Quindi utilizzare le clip del recipiente per chiudere il CCA nel punto più basso possibile e per chiudere l'ICA. Chiudere correttamente l'arteria carotide interna prima di praticare un piccolo taglio nell'arteria carotide esterna previene il sanguinamento.

Ora, usando le forbici a molla per microdissezione, fai un taglio di due millimetri nell'ECA tra i due nodi. È importante mantenere i tagli piccoli, poiché un taglio grande causerà la fuoriuscita della sostanza da infondere. Assemblare il sistema di infusione collegando sei pollici di tubo capillare a una siringa di tubercolina contenente 250 microlitri della sostanza da infuso.

Quindi inserire delicatamente la punta del tubo capillare nell'incisione dell'ECA. Continua ad avanzare la punta fino a raggiungere la metà tra la biforcazione e la clip sul CCA. Annodare il nodo ECA inferiore.

Verificare che il nodo sia sufficientemente largo da consentire la fluidità capillare e sufficientemente stretto da evitare perdite. Quindi, rimuovere la clip dall'ICA. Applicare delicatamente una pressione sul pistone della siringa, consentendo l'infusione della sostanza a circa 10 microlitri al secondo.

Dopo l'infusione della sostanza in esame, riposizionare la clip sull'ICA. Rimuovere delicatamente il tubo capillare. Quindi, legare completamente il nodo ECA inferiore.

Rimuovere la clip dall'ICA e dal CCA. Quindi rimuovere il divaricatore o i ganci per fazzoletti e il cuscino. Pulire l'area da suturare con soluzione fisiologica sterile, quindi chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon.

Dopo aver somministrato un agente antinfiammatorio e analgesico approvato per alleviare il disagio post-operatorio, posizionare l'animale in una gabbia su un termoforo per almeno un'ora e monitorare il recupero. Questo istogramma dimostra il rilevamento dell'HIV mediante PCR in tempo reale sette giorni dopo l'infusione virale attraverso l'arteria carotide interna sinistra. Come previsto, i livelli del virus sono più alti nell'emisfero sinistro.

Questa immagine in immunofluorescenza mostra una sezione del cervello di topo raffigurante il tag GFP CD63, un marcatore esosoma, dopo l'infusione di vescicole extracellulari attraverso l'arteria carotide interna. Le vescicole extracellulari che esprimono CD63, mostrate in verde, sono associate al microvaso cerebrale del topo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie neurodegenerative per esplorare le interazioni tra farmaci, agenti patogeni ed esosomi nei topi.