Induzione di ictus ischemico e di ischemia-riperfusione nei topi mediante la tecnica di occlusione dell'arteria Medio e visualizzazione di Infarct Area

L'obiettivo generale di questa procedura chirurgica è quello di indurre ufficialmente e in modo affidabile l'ictus ischemico lasciando intatta l'arteria cerebrale esterna. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'ictus, come l'impatto del trattamento sulla gravità dell'ictus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che dopo l'induzione dell'ictus, l'arteria cerebrale esterna rimane disponibile per infondere il trattamento direttamente nell'emisfero interessato.

Posizionare un topo anestetizzato con isoflurano sulla superficie chirurgica preparata e inserire un cono nasale per somministrare isoflurano miscelato con ossigeno. Assicurarsi che la frequenza respiratoria sia di circa una o due respire al secondo senza ansimare. Inoltre, assicurarsi che l'animale non mostri una reazione alla stimolazione dei baffi o al riflesso del pedale.

Metti una goccia di lubrificante oftalmico su ciascun occhio, utilizzando un tampone sterile per evitare che si secchino durante la procedura. Dopo aver rasato l'area dell'incisione, disinfettare accuratamente l'area chirurgica utilizzando etanolo al 70% e una soluzione a base di clorexidina. Tenere l'animale su una superficie chirurgica calda sotto uno stereomicroscopio.

Successivamente, utilizzando forbici chirurgiche e pinze, eseguire un'incisione superficiale della linea mediana nel collo da sopra lo sterno a sotto la mascella. Usando una pinza, separa accuratamente i tessuti adiposi e connettivi per esporre la trachea. I tessuti dovrebbero separarsi facilmente e naturalmente su entrambi i lati.

Quindi posizionare un cuscino o un altro oggetto rotondo di circa 0,5 centimetri di diametro sotto la parte posteriore del collo per estendere il collo ed esporre ulteriormente l'area per l'intervento chirurgico. Aprire l'incisione utilizzando un divaricatore di tessuto o ganci. Quindi, sul lato sinistro della trachea, separare con cura il tessuto connettivo per esporre l'arteria carotide comune sinistra senza danneggiare i nervi vicini e le vene principali.

Quindi, inserisci le pinze curve sotto il CCA per perforare il tessuto connettivo e poi lasciale aprire lentamente per rilasciare il CCA. Staccare il CCA dal tessuto sottostante ed esporre la ramificazione superiore y dell'arteria cerebrale interna e dell'arteria cerebrale esterna. Una volta che il CCA è esposto, inserire tre segmenti di sutura di nylon sotto il CCA.

Assicurarsi che il CCA non sia attorcigliato, poiché ciò complicherebbe drasticamente l'inserimento della sutura. Quindi, nel punto più basso possibile, chiudere la sutura inferiore con un nodo permanente. Legare la sutura superiore appena sotto la ramificazione dell'ICA e dell'ECA utilizzando un nodo scorsoio rimovibile.

Quindi, lega la sutura centrale usando un nodo scorsoio rimovibile, ma tienila ben aperta. Quindi, utilizzando le forbici a molla per micro dissezione, creare una CCA di 0,2 millimetri tra le suture inferiore e centrale più vicine alla sutura inferiore. Usando una pinza, inserire la sutura MCAO nell'incisione CCA, guidandola verso la sutura superiore.

Quindi stringere delicatamente il nodo scorsoio della sutura centrale sul CCA in modo che limiti il flusso sanguigno attorno alla sutura MCAO, ma sia abbastanza largo da consentire alla sutura MCAO di muoversi liberamente. Ora svitare con cura la sutura superiore, assicurandosi che la sutura MCAO non scivoli fuori. Inserire la sutura MCAO di un paio di millimetri nell'ICA e poi richiudere la sutura superiore con un nodo scorsoio come prima.

Successivamente, guidare la sutura MCAO verso l'area di occlusione, prima instradandola nell'ICA oltre l'ECA, quindi assicurandosi che la sutura rimanga nell'ICA, bypassando l'arteria pterigopalatina. L'inserimento ha successo se c'è poco riflusso di sangue dall'incisione CCA e se il segno d'argento di nove millimetri si trova tra l'incisione CCA e la biforcazione dell'ICA e dell'ECA. Dopo l'occlusione riuscita, legare saldamente la sutura centrale e superiore, quindi infilare le suture nell'area dell'incisione.

Dopo aver rimosso il divaricatore o i ganci in tessuto e il cuscino, pulire l'area della sutura utilizzando soluzione fisiologica sterile su un batuffolo di cotone. Quindi chiudere la pelle con sutura di nylon. Posizionare il mouse in una gabbia pulita situata su un tappetino riscaldato per prevenire l'ipotermia e consentire l'accesso ad libitum all'acqua e al cibo ammorbidito.

Monitorare l'animale per segni di ictus per almeno 5-10 minuti. A seconda del protocollo di riperfusione ischemica, lasciare la sutura MCAO in posizione da 30 minuti a 120 minuti o più. Dopo aver anestetizzato l'animale come prima e rimosso i punti di sutura di chiusura della ferita, utilizzare una pinza e separatori di tessuti per riaprire l'incisione ed esporre il CCA.

Quindi rimuovere con cautela la sutura superiore e tirare delicatamente la sutura MCAO fino a quando la parte rivestita di silicone non si trova in corrispondenza del nodo centrale. Rifare la sutura del nodo superiore per evitare che il sangue scorra attraverso la sutura MCAO. Quindi sciogliere con cura il nodo centrale e tirare la sutura MCAO oltre il nodo superiore, mantenendola all'interno del CCA.

Chiudere ermeticamente il nodo superiore per bloccare il flusso sanguigno dell'arteria. Quindi, estrarre completamente la sutura MCAO e chiudere saldamente il nodo centrale. Chiudere la ferita e somministrare le cure post-operatorie come prima.

Questo schema mostra in blu l'area di occlusione risultante dalla procedura illustrata in questo video. L'area chirurgica si trova nella parte inferiore della figura, indicata dalla forma ovale, e il posizionamento della sutura è indicato da linee nere. Le immagini seguenti mostrano la posizione TTC delle sezioni cerebrali.

Questa immagine rappresenta la colorazione tipica dopo l'inserimento di sham. L'immagine è rappresentativa del danno tissutale causato da un MCAO di 60 minuti, seguito da 90 minuti di riperfusione. Un danno tissutale maggiore si osserva dopo 24 ore di riperfusione, dopo un MCAO di 60 minuti.

La colorazione immunofluorescente per il marcatore neuronale MAP2 consente la perdita neuronale a partire da 60 minuti di occlusione, seguita da 23 ore di riperfusione, da visualizzare chiaramente nell'immagine a destra. L'astrogliosi è visibile dopo colorazione immunofluorescente con GFAP. Nell'immagine a destra, le astroglia sono concentrate nell'area adiacente al danno tissutale nel cervello di riperfusione per ischemia, mentre un picchiettio diffuso di colorazione è visibile nel controllo operato dalla vergogna.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante monitorare il benessere dell'animale e il tempo di occlusione. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche come l'analisi del comportamento strano e l'immunofluorescenza per rispondere a ulteriori domande sul danno tissutale e sul recupero.