Name: Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri un modello in vitro per studiare la trasformazione cellulare indotta da KSHV nelle cellule endoteliali. Questo metodo permette di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica e identificare nuove strategie terapeutiche contro il sarcoma di Kaposi.

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Questo lavoro è stato supportato da K12 HD068322 (SCM); CA179921 R01 e P51 OD011092 (AVM); e premio 14PRE20320014 da America Heart Association (SB).

Nota: tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite in condizioni di BSL-2.
 1. preparazione di KSHV Stock <ol><li>buffer di preparare TNE: sciogliere 292,24 mg di EDTA in ddH 2 O, portare a 225 mL e regolare a pH 8. Sciogliere mg 605,7 Tris in ddH 2 O portare a 225 mL e regolare a pH 8. EDTA e Tris soluzioni combinate, aggiungere 4,38 g NaCl, regolare il volume finale di 500 mL, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C .</li>
	<li>Cultura il KSHV-positivo, la linea EBV-negativi di cellule di linfoma primario di effusione BCBL-1 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in RPMI completato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e antimicrobici per circa 1 a 1.2 x 10 6 cellule per mL.</li>
	<li>Per indurre la produzione di KSHV, dividere Culture 1:2 con mezzo fresco e aggiungere Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) a una concentrazione finale di 20 ng/mL e incubare le colture per 5 giorni. In alternativa, trattare le cellule con butirrato del sodio (NaB; 0,1 mM) per 3 giorni per indurre la replicazione litica.</li>
	<li>Per raccogliere le particelle virali, prima di centrifugare il surnatante a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule e trasferire i surnatanti in provette di freschi della cultura.</li>
	<li>Per chiarire ulteriormente il supernatante in modo da evitare il trasferimento di detriti cellulari, centrifugare a 2.500 x g per 10 min a 4 ° C. 
	Nota: in alternativa alla centrifugazione ad alta velocità per la chiarifica dei surnatanti, filtrazione attraverso una sterile 0,45 µm filtro possa essere eseguita. Abbiamo osservato un calo significativo nel titolo mediante filtrazione; di conseguenza, eseguiamo regolarmente la seconda fase di centrifugazione invece.</li>
	<li>Successivamente, sovrapposizione di 5 mL di soluzione di saccarosio di 25% nel buffer di TNE con circa 30 mL di surnatante in 6 tubi di ultracentrifuga della cultura chiarificato.</li>
	<li>Centrifuga equilibrato tubi a 75.000 x g per 2 ore a 4 ° C sotto vuoto.</li>
	<li>Decantare il supernatante di coltura e macchia il bordo di ogni tubo per rimuovere quanto più soluzione supernatante e saccarosio come possibile, quindi risospendere il pellet di virus, che potrebbe non essere visibile, in 150 µ l di tampone TNE.</li>
	<li>Virus in piscina tutti risospesa, mescolare bene e congelare 25 aliquote di µ l a -80 ° C .</li>
</ol> 2. Trasduzione della CE con E6 ed E7 Papillomavirus Genes Nota: usiamo ordinariamente matracci di cultura del tessuto standard per la coltivazione EC. primaria Tuttavia, se insoddisfacente crescita della CE si ottengono quindi l'uso di matracci di cultura commerciale dovrebbe essere considerato.
<ol><li>Cultura primaria umana dermico microvascolare o linfatico CE in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 nel mezzo di crescita CE (EGM; contiene sostanza basale di CE [EBM] completato con EGM-2 BulletKit [contenente FBS, idrocortisone, fattore di crescita del fibroblasto umano-B, fattore di crescita vascolare CE, fattore di crescita insulino-simile-1, acido ascorbico, fattore di crescita epiteliale umano, antibiotici ed eparina]) in un matraccio di cultura cellulare T75 a circa 50% confluenza.</li>
	<li>Per trasduzione, cultura PA317 LXSN 16E6E7 cellule 24 , 35 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in DMEM completati con 10% FBS e antimicrobici in un Matraccio di cultura cellulare T150 fino a quando essi sono circa 90% confluenti. Quindi incubare per una notte in 16 mL di terreno.</li>
	<li>Chiarire il mezzo PA317 mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la EGM dalle cellule EC cultura e sovrapposizione con 12 mL di terreno PA317 chiarificato e incubare per 4 h. 
	Nota: Centrifugazione 16 mL di medium condizionato a 300 x g per 5 min risultati in una compatta a pellet che non è disturbato dalla successiva rimozione accurata di 12 mL di surnatante chiarificato. Tuttavia, se il trasferimento delle PA317 LXSN 16E6E7 cellule di colture primarie di CE è una preoccupazione (la linea cellulare di imballaggio rapidamente diventerà troppo grande per CE), filtrazione del surnatante condizionato attraverso un filtro da 0,45 µm prima del trasferimento può eseguire.</li>
	<li>Sostituire 6 mL di terreno PA317 con EGM fresco e incubare per una notte.</li>
	<li>Refeed CE con 12 mL EGM fresco e incubare un ulteriore 48 h.</li>
	<li>Per sub-cultura della CE, rimuovere il mezzo e lavare con 12 mL di PBS senza cationi e aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica commerciale (ad esempio, TrypLE) di e incubare a 37 ° C per 3 min.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare risultante in EGM fresco e dividere in modo uniforme in 3 x T75 boccette con un volume finale di 12 mL EGM per fiaschetta.</li>
	<li>Per selezionare per CE trasformata con E6 ed E7, aggiungere G418 ad una concentrazione finale di 200 µ g/mL per due passaggi, dopo il quale la CE trasdotte può essere placcata per infezione o congelata in azoto liquido.</li>
</ol> 3. Infezione della CE trasdotte con KSHV <ol><li>il giorno prima dell'infezione vendemmia CE a digestione enzimatica utilizzando la soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra. Risospendere le cellule in 1 mL di EGM. Utilizzare 5 µ l di cellule per preparare una diluizione 1/10 in blu di Trypan. Contare celle in tensione utilizzando un emocitometro e seme 2,5 x 10 5 cellule vive in 2 mL di EGM per pozzetto in piastre a pozzetti 6.</li>
	<li>Il giorno di infezione, EGM di rimuovere e lavare le cellule con 3 mL di PBS con calcio e magnesio per pozzetto e quindi aggiungere 2 mL EBM. 
	Nota: È indispensabile utilizzare EBM anziché EGM durante l'infezione, poiché l'eparina in EGM inibiscono la associazione di particelle virali per e successiva infezione di destinazione EC.</li>
	<li>Di infettare le cellule con KSHV, aggiungere brodo di virus di 5 a 20 µ l a ciascun pozzetto e ricciolo piatto per mescolare. Per cellule infettate da mock, aggiungere un volume equivalente di tampone TNE in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Centrifugare le piastre a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente e poi incubare le piastre a 37 ° C per 90 min.</li>
	<li>Se l'obiettivo dello studio è di indagare gli eventi iniziali che richiedono un'infezione virale sincrona, ad esempio, eventi precoci nell'infezione de novo, rimuovere l'inoculo virale a questo punto. Sciacquare e le cellule con 2 mL di refeed EGM fresco. In caso contrario, aggiungere 2 mL EGM e incubare le colture durante la notte.</li>
	<li>Refeed cellule con 2 mL EGM il giorno dopo l'infezione e quindi ogni altro giorno.</li>
	<li>Quando le cellule sono circa 90% confluenti, vendemmia a digestione enzimatica con soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra, quindi le cellule da tre pozzi in un T75, rilevando il numero di passaggio totale e il passaggio della piscina post-infezione.</li>
	<li>Espandere mock - e KSHV-infettato CE 1:3 divisioni per almeno due passaggi ulteriori, momento in cui le cellule possono essere utilizzate in esperimenti o congelate in azoto liquido. 
	Nota: Come con la scissione della CE trasformata con E6 ed E7, culture di manutenzione delle cellule infettate di derisione e KSHV dovrebbero essere diviso prima di raggiungere la confluenza (~ 85-90%).</li></ol>
 4. confermando l'infezione con KSHV dall'immunofluorescenza Nota: rilevamento di KSHV latenza-collegata nucleare antigene (LANA-1/ORF73) fornisce una misura quantitativa affidabile di infezione. Gli anticorpi anti-LANA sono disponibili in commercio.
<ol><li>Il giorno prima della colorazione, piastra due pozzetti ciascuna con mock - o KSHV-infettati CE su una piastra a 24 pozzetti a 1 x 10 5 cellule per bene in 1 mL EGM e incubare per una notte.</li>
	<li>Cellule di lavare due volte con 500 µ l di PBS più calcio e magniseum. Lavare per 30 s su una piattaforma oscillante.</li>
	<li>In un di cappa esternamente-Refriggerato, fissare le cellule con 500 µ l di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 plus siero di capra 0,02% in PBS più cationi).</li>
	<li>Bloccare le cellule con 500 µ l di siero di capra del 2% in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Etichetta un pozzetto di mock - o KSHV-infettati CE con 200 µ l di anticorpo primario diluito 01:100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker. Incubare i rimanenti due pozzi a 200 µ l di tampone di lavaggio solo.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Etichetta tutti i quattro pozzi con 200 µ l di anticorpo secondario diluito 1: 100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Ad ogni pozzetto applicare 20 µ l di montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti e valutare che macchia usando un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	<li>Determinare l'infezione percentuale di cellule infettate da KSHV contando il numero di nuclei di LANA-positivi in almeno 200 cellule. Infezione con ricombinante KSHV-Bac16 può essere monitorato anche tramite osservazione di culture per l'espressione della GFP.</li>
</ol>

Oncogenesi sono un processo multifasico che aggira precauzioni importanti all'interno di un organismo36. Come lesione KS esistano lungo uno spettro di infiammazione cronica al veri sarcomi, delucidazione di alcuni processi patofisiologici mediata da KSHV richiede che alcuni studi condotti in modelli di coltura cellulare che supportano la trasformazione9. Va notato che la perdita di inibizione da contatto e la crescita ancoraggio-dipendente, fenotipi indicativi di trasformaz...

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore di angioproliferative multi-focale che interessano siti cutanei, mucosi e viscerali che si sviluppa più comunemente nella cornice di soppressione immune avanzata1. Sono state descritte quattro forme epidemiologiche: classic, una forma indolent che colpisce in genere persone anziane del patrimonio Mediterraneo e del Medio Oriente; iatrogena, derivando dal trattamento con farmaci immunosoppressori dopo trapianto dell'organo; epidemia, un cancro didefinizione; ed endemiche, una forma di HIV-indipendente comune nei bambini nelle regioni endemiche in Africa. Con l'avvento dei regimi della droga anti-retrovirale combinazione efficace per il trattamento dell'HIV, KS epidemica è molto meno comunemente diagnosticato in paesi in via di sviluppo. Tuttavia, le forme clinicamente aggressive endemiche ed epidemiche rimangono tra i più comunemente cancri diagnosticati in molti paesi africani2,3,4. Pertanto, l'identificazione di farmaci mirati a patogenesi efficaci per il trattamento di KS è una priorità di ricerca.
Istologicamente, KS lesioni sono caratterizzate da neovascolarizzazione abbondante ma anormali, per cui le cellule dell'alberino di origine CE formano reti vascolari discontinuo5. Questi vasi anomali ("fessure vascolari") consentono lo stravaso di eritrociti, che danno lesioni loro colore caratteristico. Inoltre, le lesioni contengono numerosi leucociti che caratterizzano l'infiammazione cronica (cioè, linfociti, macrofagi e plasmacellule). Regressione delle lesioni KS dopo ricostituzione immunitaria è stata descritta, suggerendo che KS ha caratteristiche di una lesione iper-proliferative sia un vero tumore6,7,8,9.
Il herpesvirus KS (KSHV), l'agente causativo di KS, è stato identificato nel 199410. Da allora molti in vitro coltura cellulare sono stati sviluppati modelli per attivare studi di patogenesi, comprese le cellule espiantati da materiale di biopsia del tumore e primaria o CE esprimendo la telomerasi è infettato da KSHV in vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nessuno dei modelli attualmente disponibili completamente ricapitola il microambiente tumorale di KS, ma tutti hanno contribuito conoscenze preziose per la nostra comprensione del pathobiology dell'infezione di KSHV. A differenza del altri noto cancerogeno herpesvirus umano virus di Epstein - Barr (EBV), KSHV non prontamente trasforma le cellule in cultura seguendo de novo infezione19,20,21, 22. Tuttavia, questa limitazione è stata superata da transducing CE primaria umana del mescolato origine microvascolare o linfatico con la E6 ed E7 geni da papillomavirus umano tipo 16 prima dell'infezione con KSHV23,24 . Espressione di questi oncogeni esogeni aumenta notevolmente il potenziale trasforma di KSHV in vitro in parte fornendo ulteriore inibizione del retinoblastoma proteina e p5323,24. Questo metodo di trasduzione CE ha permesso più laboratori di identificare le alterazioni chiave nell'host espressione genica delle cellule che sono indotte dall'infezione di KSHV e che sembrano facilitare KS cella sopravvivenza e proliferazione25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. i protocolli descritti nel presente documento sono semplici e altamente riproducibile e comporterà la generazione di pari età e passaggio CE KSHV-infettati e controlli mock-infettati che possono essere coltivati per lontano più di cellule primarie e saranno consentire per l'indagine sui meccanismi oncogenici impiegato da KSHV. Anche se il protocollo include un metodo per la produzione di tipo selvaggio KSHV dalla linea cellulare linfoma primario di effusione BCBL-1, CE E6/E7-immortalata anche sono altamente suscettibili di infezione con BACmid ricombinante derivato KSHV-BAC1630. Protocolli per la preparazione di BAC16 sono descritti altrove33,34.

<table><tbody><tr><td>Cellule BCBL-1</td><td>Programma di reagenti NIH AIDS</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>cellule PA317</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali microvascolari dermiche neonatali</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Medio basale</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Avanzato Biotecnologie</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLETMExpress, senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS con calcio e magnesio</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello in vitro per lo studio della trasformazione cellulare da herpesvirus sarcoma di kaposi

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore insolito composto di proliferazione delle cellule dell'alberino che è iniziato da infezione delle cellule endoteliali (CE) con KSHV e si sviluppa più spesso nella regolazione di immunosoppressione. Nonostante decenni di ricerca, il trattamento ottimale di KS rimane definito male e gli esiti clinici sono particolarmente sfavorevoli nelle impostazioni di risorse limitate. Le lesioni KS sono guidate da angiogenesi patologica, infiammazione cronica e oncogenesi e vari in vitro modelli di coltura cellulare sono stati sviluppati per studiare questi processi. KS deriva dalle cellule di KSHV-infettati di origine endoteliale, così le cellule CE-stirpe di fornire i più appropriati in vitro surrogati del precursore delle cellule dell'alberino. Tuttavia, perché CE hanno una durata limitata in vitro , e come i meccanismi oncogenici impiegati da KSHV sono meno efficaci di quelli di altri virus cancerogeno, è stato difficile valutare i processi di trasformazione primaria o telomerase-immortalized EC. Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di romanzo cultura basata su CE che prontamente supporta la trasformazione dopo l'infezione con KSHV. Espressione ectopica dei geni E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 consente estesa cultura di pari età e passaggio mock - e KSHV-infettati CE e supporta lo sviluppo di un veramente trasformato (cioè, cancerogeno) fenotipo in colture di cellule infette . Questo modello altamente riproducibile e trattabile di KS ha facilitato la scoperta di diverse vie di segnalazione essenziale ad alto potenziale per la traduzione in contesti clinici.

La morfologia della primaria CE è classicamente descritto come "ciottoli", e questa morfologia non è alterata dall'espressione del papillomavirus E6 ed E7 geni (Figura 1A). Espressione dei geni E6 ed E7 da solo non induce un fenotipo trasformato; così, le cellule sono suscettibili di contattare inibizione e cesseranno dividendo dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. Le cellule saranno tuttavia proliferare e ricrescere alla confluenza su trypsinization e ricromat...

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare un mock abbinato all'età e al passaggio nelle cellule endoteliali infette da KSHV per consentire lo studio dei cambiamenti associati a KSHV nell'espressione genica della cellula ospite, comprese le alterazioni che guidano la trasformazione maligna nel contesto di controlli appropriati. Questo metodo può aiutare a definire i principali cambiamenti fisiopatologici nella biologia delle cellule ospiti che portano ai tumori associati a KSHV, identificando così nuovi bersagli terapeutici per la prevenzione o il trattamento delle malattie. Il vantaggio principale di questo sistema è che la trasformazione maligna delle cellule endoteliali in seguito all'infezione da KSHV avviene rapidamente e in modo riproducibile, consentendo lo studio degli eventi precoci nel processo oncogenico con cellule di controllo abbinate all'età e al passaggio.Sebbene questo modello di oncogenesi virale possa fornire informazioni sullo sviluppo del sarcoma di Kaposi, può essere applicato anche ad altri tipi di cancro. Poiché il sarcoma di Kaposi è un tumore vascolare, le implicazioni di questo modello di coltura cellulare si estendono alla comprension

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Biologia

Fattori cellula ospite giocano un ruolo critico nella creazione e mantenimento di sarcoma di Kaposi (KS). Delineiamo metodi per identificare i fattori cellula ospite alterato nelle cellule DMVEC KSHV-infetti, e nel tessuto tumorale KS. Geni cellulari alterato da virus servirà come potenziale bersaglio (s) per nuove terapie.

Identificare i geni disregolazione indotta da sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV)

Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

Un metodo di osservazione singole molecole di DNA in cellule vive è descritto. La tecnica si basa sul legame di una proteina fluorescente etichettato repressore lac di siti di legame ingegnerizzati nel DNA di interesse. Questo metodo può essere adattato per seguire molti DNA ricombinanti in cellule vive nel tempo.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Fonte: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. Un modello in vitro per lo studio della trasformazione cellulare da parte del virus dell'herpes del sarcoma di Kaposi. J. Vis. Exp.(2017)Questo video dimostra la trasduzione retrovirale di cellule endoteliali primarie con gli oncogeni HPV16 E6/E7. Gli oncogeni integrati inattivano i soppressori tumorali p53 e Rb, prolungando la durata della vita cellulare. La selezione con G418 arricchisce le cellule trasdotte, producendo colture endoteliali...

Immortalizzazione di cellule endoteliali tramite trasduzione retrovirale di oncogeni virali

Descriviamo un protocollo per misurare la produzione di citochina antivirale in topi infettati con un modello herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) che è strettamente correlata alla associato al sarcoma herpesvirus di Kaposi umano (KSHV) e virus di Epstein-Barr (EBV). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali di topo (MEF), abbiamo valutato la produzione di citochina antivirale sia in vivo e ex vivo. "Ricostituzione" l'espressione di componenti...

Dissezione Innate Immune Signaling in Evasion virale di produzione di citochine

Abbiamo stabilito un protocollo di ibridazione fluorescente in situ per la rilevazione di un genoma del virus DNA persistente all'interno di sezioni tissutali di modelli animali. Questo protocollo permette studiando processo di infezione da codetection del genoma virale, i suoi prodotti di RNA e proteine ​​virali o cellulari all'interno delle cellule singole.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Gli astrociti fenotipicamente wild-type e le cellule staminali neurali raccolte da topi ingegnerizzati con alleli oncogenici condizionali e trasformati tramite ricombinazione virale Cre-mediata possono essere utilizzati per modellare la patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo mediante iniezione ortotopica di cellule trasformate in cervelli di compagni di cucciolata singenici e immunocompetenti.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Descriviamo un protocollo che utilizza la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) per visualizzare più RNA herpesvirali all'interno di cellule umane lytically infette, sia in sospensione che aderenti. Questo protocollo include la quantificazione della fluorescenza producendo un rapporto nucleocitoplasmatica e può essere esteso per la visualizzazione simultanea di proteine ospite e virali con immunofluorescenza (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Questo protocollo descrive l'istituzione di un modello murino portatore di tumori per monitorare la progressione del tumore e l'angiogenesi in tempo reale mediante la doppia bioluminescenza.

Doppia bioluminescenza Imaging della progressione tumorale e dell'angiogenesi

Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Questo protocollo descrive un sistema in vitro per modellare l'infezione de novo litica dell'herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi utilizzando virioni derivati da BAC16. Il metodo consente di studiare la replicazione e la diffusione virale precoce. La produzione di virus infettivi è quantificata mediante saggi di unità infettive basate su GFP e PCR in tempo reale di genomi virali incapsulati.

Determinazione e quantificazione dell'infezione litica de novo da herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi libero da cellule

Scopri un modello in vitro per studiare la trasformazione cellulare indotta da KSHV nelle cellule endoteliali. Questo metodo permette di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica e identificare nuove strategie terapeutiche contro il sarcoma di Kaposi.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

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