Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare un mock abbinato all'età e al passaggio nelle cellule endoteliali infette da KSHV per consentire lo studio dei cambiamenti associati a KSHV nell'espressione genica della cellula ospite, comprese le alterazioni che guidano la trasformazione maligna nel contesto di controlli appropriati. Questo metodo può aiutare a definire i principali cambiamenti fisiopatologici nella biologia delle cellule ospiti che portano ai tumori associati a KSHV, identificando così nuovi bersagli terapeutici per la prevenzione o il trattamento delle malattie. Il vantaggio principale di questo sistema è che la trasformazione maligna delle cellule endoteliali in seguito all'infezione da KSHV avviene rapidamente e in modo riproducibile, consentendo lo studio degli eventi precoci nel processo oncogenico con cellule di controllo abbinate all'età e al passaggio.

Sebbene questo modello di oncogenesi virale possa fornire informazioni sullo sviluppo del sarcoma di Kaposi, può essere applicato anche ad altri tipi di cancro. Poiché il sarcoma di Kaposi è un tumore vascolare, le implicazioni di questo modello di coltura cellulare si estendono alla comprensione di altri processi patologici guidati dall'angiogenesi patologica. Per iniziare, preparare e filtrare il tampone TNE sterilizzato come descritto nel protocollo di testo.

Quindi conservare la soluzione a quattro gradi Celsius. Coltura della linea cellulare di linfoma a versamento primario KSHV positivo EBV negativo BCBL-1 in un pallone T150 riempito con 60 millilitri di terreno RPMI. Mantenere le celle a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica per ottenere una sospensione di circa 1-1,2 volte 10-10 al sesto di cellule per millilitro.

Una volta raggiunta la densità corretta, dividere le cellule una o due con terreno fresco e aggiungere PMA a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro per indurre la produzione di KSHV. Quindi incubare le colture per cinque giorni. Dopo cinque giorni di incubazione, raccogliere le particelle virali facendo girare le sospensioni cellulari a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi trasferire i surnatanti in un nuovo tubo. Centrifugare nuovamente i surnatanti a 2.500 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Ora che è chiarito, sovrapporre cinque millilitri di soluzione di saccarosio al 25% in TNE con circa 30 millilitri di surnatante in sei provette per ultracentrifuga.

Centrifugare le provette bilanciate a 75.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius sotto vuoto. Una volta completata la centrifugazione, decantare il surnatante e tamponare il bordo di ogni provetta per rimuovere quanto più liquido possibile. Quindi risospendere il virus pellettato in 150 microlitri di tampone TNE e raggruppare tutti i campioni.

Mescolare accuratamente la sospensione raggruppata e dividerla in aliquote da 25 microlitri. Conservare il virus stock a meno 80 gradi Celsius. Coltura di cellule endoteliali dermiche o linfatiche umane primarie in terreno EGM in un pallone T75.

Mantenere la coltura cellulare a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica fino a raggiungere circa il 50% di confluenza. Prima della trasduzione delle cellule endoteliali, coltivare le cellule PA317 LXSN 16E6E7 in un pallone di coltura cellulare T150 riempito con 20 millilitri di DMEM a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica. Una volta raggiunta una confluenza di circa il 90%, sostituire il terreno della coltura cellulare di PA317 con 16 millilitri di terreno fresco e incubare le cellule durante la notte.

Dopo un'incubazione notturna, raccogliere il terreno dalla coltura cellulare di PA317 e chiarificarlo mediante centrifugazione a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Sostituire il terreno EGM da coltura di cellule endoteliali confluenti al 50% con 12 millilitri di terreno PA317 chiarificato. Incubare le cellule per quattro ore.

Quindi sostituire sei millilitri di terreno PA317 con sei millilitri di terreno EGM fresco e incubare le cellule durante la notte. Successivamente, rimuovere il terreno dalla coltura cellulare endoteliale e nutrire le cellule con 12 millilitri di EGM fresco. Continuare a incubare le cellule per altre 48 ore.

Per sottocoltivare le cellule endoteliali, rimuovere il terreno e lavare le cellule con 12 millilitri di PBS privo di cationi. Quindi aggiungere tre millilitri di una soluzione di dissociazione enzimatica commerciale e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Una volta pellettate, risospendere le cellule in terreno EGM fresco e dividere uniformemente la sospensione in tre matracci T75. Regolare il volume delle colture a 12 millilitri di EGM per pallone. Quindi aggiungere 200 microgrammi per millilitro di G418 per selezionare le cellule endoteliali trasdotte.

Raccogliere le cellule endoteliali trasdotte mediante digestione enzimatica come mostrato in precedenza. Risospendere il pellet di cellule endoteliali in un millilitro di terreno EGM. Quindi mescolare cinque microlitri di sospensione cellulare con 45 microlitri di soluzione di Trypan Blue e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro.

Seminare 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula vitale in due millilitri di terreno EGM per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Il giorno seguente, rimuovere il terreno EGM e lavare le cellule in ogni pozzetto con tre millilitri di PBS con calcio e magnesio. Quindi aggiungere due millilitri di terreno EBM a ciascun pozzetto.

Per infettare le cellule con KSHV, aggiungere da cinque a 20 microlitri di stock virale in ciascun pozzetto e agitare la piastra per mescolare le sospensioni. Aggiungere un volume uguale di tampone TNE a ciascun pozzetto contenente cellule finte infette. Dopo aver centrifugato la piastra a 400 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente, incubarla a 37 gradi Celsius per 90 minuti.

Quindi aggiungere due millilitri di terreno EGM a ciascun pozzetto e incubare le colture per una notte. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno EGM da ciascun pozzetto e sostituirlo con due millilitri di EGM fresco. Quando le cellule raggiungono una confluenza di circa il 90%, raccoglierle mediante digestione enzimatica come mostrato in precedenza.

Raggruppare le cellule da tre pozzetti in una fiaschetta T75 etichettata con il numero di passaggi totali nel passaggio dopo l'infezione. Prima del test o del congelamento, espandere le colture di cellule endoteliali simulate e infettate da KSHV dividendole da una a tre per almeno due passaggi aggiuntivi. Qui viene presentata un'immagine microscopica di cellule endoteliali finte e infette confluenti che rivelano il classico aspetto del ciottolo.

La divisione cellulare in queste cellule è inibita al contatto quando la coltura raggiunge la confluenza. Le cellule endoteliali infettate da KSHV sviluppano una morfologia allungata simile a un fuso che ricorda le cellule fusiformi del sarcoma di Kaposi. A differenza delle cellule finte infette, le cellule endoteliali infettate da KSHV continuano a proliferare anche quando raggiungono la confluenza, portando allo sviluppo di focolai cellulari multistrato.

Quando perdono il contatto con il substrato, le cellule endoteliali finte infette subiscono una morte cellulare apoptotica, anoikis, inoltre non formano colonie nell'agar molle. Al contrario, le cellule infettate da KSHV sono resistenti agli anoikis e alle colonie in crescita quando vengono coltivate in agar morbido. Lo sviluppo della morfologia a forma di fuso nelle cellule endoteliali infettate da KSHV è accompagnato dall'espressione della proteina di latenza virale ORF73 e, in misura minore, di un fattore di processività virale ORF59.

Quando sono state infettate con KSHV BAC16 marcato con una proteina fluorescente verde, le cellule endoteliali hanno sviluppato una morfologia a forma di fuso e dimostrano l'espressione di GFP confermando la relazione casuale tra l'infezione da KSHV nel fenotipo osservato. Dopo il suo sviluppo, questo modello di coltura cellulare ha aperto la strada ai ricercatori per valutare le alterazioni dell'mRNA della cellula ospite e dell'espressione proteica indotte dall'infezione da KSHV. Di conseguenza, sono stati identificati i principali meccanismi patogenetici alla base dell'oncogenesi mediata da KSHV che rappresentano bersagli terapeutici promettenti.

Non dimenticare che KSHV è un agente BSL-2 e deve essere maneggiato con adeguate procedure e pratiche di contenimento della biosicurezza.