Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un'ampia area di substrato nanomodellato da piccoli stampi nanomodellati utilizzando una tecnica di punto semplice ed economica ma versatile. Questo metodo può aiutare a studiare la modulazione nanotopografica del substrato del fenotipo cellulare e della funzione a livello cellulare e molecolare, come l'espressione di proteine di adesione focale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice ed economica.

Per iniziare, preparare lo stampo in silicone silanizzato nel prepolimero PDMS, come descritto nel protocollo di testo. Mettere lo stampo in silicone silanizzato in una capsula di Petri da 60 millimetri. Versare il prepolimero PDMS sullo stampo in silicone nella capsula di Petri.

Mettere la capsula di Petri in un essiccatore di plastica e degassare per circa 10 minuti, fino a quando tutte le bolle scompaiono. Trasferire la capsula di Petri su una piastra calda e polimerizzare il prepolimero PDMS a 70 gradi Celsius per quattro ore. Staccare con cura lo stampo PDMS dallo stampo in silicone utilizzando una pinzetta.

Determinare l'orientamento dei nanopattern PDMS anisotropi, come i nanoreticoli, al microscopio ottico e contrassegnarlo sul retro degli stampi PDMS con un pennarello. Pulire il substrato di silicone con etanolo in una cappa aspirante, quindi asciugarlo con aria compressa. Rifilare le aree non modellate di ogni stampo PDMS con una lama.

Gli stampi PDMS devono essere allineati il più vicino possibile, ma senza toccare lo stampo circostante, per ridurre al minimo l'area non modellata e per evitare di toccare la deformazione del nanopattern quando viene applicata la forza del compressore. Posizionare lo stampo PDMS rifilato con il nanopattern rivolto verso il basso sul lato dello specchio del substrato di silicone, quindi allineare gli altri stampi vicino ma senza toccare gli stampi circostanti. È fondamentale cercare di polimerizzare il PDMS allo strato basale perché il PDMS non polimerizzato può fluire attraverso lo spazio tra i molteplici stampi e danneggiare i nanopattern.

Tuttavia, il PDMS completamente polimerizzato non è in grado di legare insieme più stampi. Per preparare uno strato adesivo PDMS, versare un grammo di prepolimero PDMS degassato su un vetrino pulito per formare uno strato di 0,5 millimetri di spessore. Cuocere lo strato PDMS a 100 gradi Celsius su una piastra calda per tre-cinque minuti.

Usa un ago per toccare lo strato e assicurati che lo strato sia parzialmente ma non completamente indurito. Posizionare lo strato PDMS sul retro degli stampi PDMS allineati, capovolgere rapidamente questo gruppo e trasferirlo sulla piastra riscaldante. Applicare una forza di compressione utilizzando un blocco metallico sulla parte superiore del gruppo per garantire un buon contatto tra lo strato adesivo PDMS e il retro degli stampi PDMS.

Polimerizzare lo strato adesivo PDMS a 100 gradi Celsius per un'ora. Spegnere la piastra riscaldante, rimuovere il blocco metallico e staccare lo stampo PDMS a punto singolo dal substrato di silicone. Per nanoimprimere lo stampo PDMS cucito nella piastra PS, posizionare la piastra PS in un distanziatore in alluminio impostato su un wafer di silicio da tre pollici.

Scaldare la piastra PS su una piastra calda a 250 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, posizionare lo stampo PDMS cucito, con i nanomotivi a faccia in giù, sulla piastra PS fusa. Quindi, posizionare una piastra di alluminio sul vetrino dello stampo PDMS cucito.

Applicare una pressione di compressione utilizzando blocchi metallici sulla piastra di alluminio e attendere tre minuti. Sollevare e sostituire il blocco metallico dalla piastra di alluminio e aumentare la pressione di compressione a 25 kilopascal. Quindi, ripetere questo passaggio con la pressione aumentata a 50 kilopascal.

Mantenere la temperatura della piastra riscaldante tra 240 e 250 gradi Celsius a una pressione costante di 50 kilopascal per 15 minuti. Spegnere la piastra riscaldante e raffreddare l'intera configurazione. Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura è inferiore a 50 gradi Celsius e staccare con cura lo stampo PDMS cucito dalla piastra PS.

Per nanoimprimere lo stampo PDMS su un film sottile PS, posizionare lo stampo PDMS cucito con la nanotopografia a faccia in giù sul film sottile PS, che viene posizionato su una piastra calda. Applicare una pressione di compressione di 12 kilopascal sullo stampo PDMS utilizzando blocchi metallici sulla slitta di vetro dello stampo PDMS. Aumentare la temperatura della piastra riscaldante a 180 gradi Celsius e mantenerla per 15 minuti.

Spegnere la piastra riscaldante e raffreddare l'intera configurazione. Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura è scesa sotto i 50 gradi Celsius e staccare con cura lo stampo PDMS cucito dalla pellicola PS. Utilizzando un punzone ad arco cavo in acciaio, tagliare i substrati PDMS nanomodellati in dischi per adattarli alla configurazione di una specifica piastra multipozzetto.

Quindi, utilizzare le pinzette per posizionare i dischi PDMS nei pozzetti della piastra multipozzetto. Sterilizzare i substrati PDMS utilizzando etanolo al 70% per 30 minuti. Successivamente, aspirare l'etanolo e farlo seguire dall'esposizione ai raggi UV per 30 minuti.

Lavare tre volte i substrati PDMS con soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato. Quindi, rivestire i substrati PDMS con la proteina della matrice extracellulare per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i substrati PDMS tre volte con PBS sterile, ciascuna per cinque minuti.

Sospendi le cellule di cancro del polmone umano A549 nel Modified Eagle Medium di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino e conta le cellule utilizzando un emocitometro. Piastra le cellule a una densità di semina di 2.000 cellule per centimetro quadrato sui substrati PDMS. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica per un giorno e osservarle in seguito.

Il nanopattern generato sulla piastra PS e il film sottile sono mostrati qui. Le frecce indicano il rialzo del polimero negli interstizi degli stampi PDMS cuciti. Queste immagini SEM dimostrano che i substrati di lavoro PDMS vengono trasferiti fedelmente dal nanopattern scritto con litografia a fascio di elettroni applicando la tecnica del punto.

Immagini SEM rappresentative di cellule A549 cresciute su nanoreticoli e nanopilastri sono mostrate qui. Le cellule mostrano una morfologia cellulare allineata sui nanoreticoli, mentre le cellule si diffondono in modo casuale sui nanopilastri. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare una vasta area di substrato nanomodellato cucendo più stampi nanomodellati definiti di piccole dimensioni.

Non dimenticare che lavorare con toluene e paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e indossare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati durante l'esecuzione delle procedure.