Name: Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Impara a produrre substrati nanopatterned di grandi dimensioni da stampi piccoli utilizzando la tecnica del punto con PDMS. Questo metodo semplice ed economico permette di studiare la modulazione nanotopografica del comportamento cellulare.

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Questo lavoro è stato in parte supportato da NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759 e Byars-Tarnay Endowment. Ringraziamo l'uso delle strutture di ricerca condivise della West Virginia University che sono supportate, in parte, da NSF EPS-1003907.

1. La replica del PDMS Stampo di uno stampo EBL <ol><li> Realizzare stampo in silicone 29 <ol><li> cappotto Spin 200 microlitri polimetilmetacrilato (PMMA) soluzione su un substrato 1 cm x 1 cm di silicio (Si) a 2.500 rpm per 1 min per formare una pellicola sottile. </li><li> Cuocere il film PMMA sul substrato di Si a 180 ° C per 2 min. </li><li> Scrivere il nanopattern disegnato sulla pellicola PMMA utilizzando un fascio elettronico focalizzato ad una dose di 300 uC / cm 2 zona. </li><li> Sviluppare la nanopattern PMMA in sviluppo per 80 sec. </li><li> Depositare lo nanopattern PMMA con uno strato di nichel di 50 nm di spessore usando un evaporatore E-fascio in uscita una tensione di 10 kV, corrente di emissione di 0,5 mA e una velocità di deposizione di 0,5 Å / sec. </li><li> Sollevare la parte PMMA in 20 ml di rimozione a 80 ° C per 20 min. </li><li> Reactive etch ioni (RIE) il nanopattern nel substrato di Si per ottenere uno stampo Si di profondità desiderata. NOTA: la miscela di gas di tetrafluoromethane (CF 4) / ossigeno (O 2) (90% / 10%) ad un plasma accoppiato induttivamente (ICP) potenza di 400 W e RIE potenza di 150 W viene utilizzato per incidere substrato di Si ad una profondità di 560 nm. </li></ol></li><li> muffa silanizzata Si <ol><li> Mettere un vetrino di vetro e lo stampo di Si in da 100 mm piatto di PS di Petri e trasferirle in un essiccatore di vetro situato in una cappa aspirante. </li><li> Goccia 10 ml 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sul vetrino. Attenzione: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane può causare corrosione della pelle e gravi lesioni oculari. Indossare dispositivi di protezione adeguati (DPI). </li><li> Coprire la piastra di Petri parzialmente. </li><li> Mantenere un essiccatore sotto vuoto per 5 ore in una cappa aspirante per completare la silanizzazione dello stampo Si. </li></ol></li><li> Preparare PDMS prepolimero <ol><li> Pesare 10 g di resina PDMS e 1,05 g vulcanizzante in una barca pesata monouso. </li><li> Mescolare il prepolimero PDMS accuratamente utilizzando un cucchiaio di plastica. </li><li> Degassare la prepolimero PDMS in un essiccatore di plastica sotto vuoto per circa 20 minuti fino a quando si osserva una miscela chiaro. </li></ol></li><li> Replicare stampi PDMS <ol><li> Mettere lo stampo Si silanizzata in 60 millimetri piastra di Petri. </li><li> Versare il prepolimero PDMS sullo stampo Si nella piastra di Petri. </li><li> Posizionare la piastra di Petri in un essiccatore di plastica e Degas per circa 10 minuti fino a quando tutte le bolle scompaiono. </li><li> Trasferire la piastra di Petri a una piastra e curare il prepolimero PDMS a 70 ° C per 4 ore. </li><li> Staccare lo stampo PDMS dallo stampo Si accuratamente utilizzando una pinzetta. NOTA: stampi PDMS possono essere conservati in condizioni ambiente per un massimo di una settimana. Dopo il trattamento, ci sono alcune molecole di resina PDMS non reticolato e agente indurente residui negli stampi PDMS 30. Le molecole a basso peso molecolare gradualmente diffondere fuori e si accumulano in superficie nel tempo. Questo influisce sulle proprietà topografiche e meccaniche della superficie PDMS 31. DIFla fusione non è significativo entro una settimana. </li></ol></li></ol> 2. cucitura di PDMS Stampi in una grande, Mold singolo <ol><li> Preparare multipli PDMS stampi ripetendo passo 1.4. NOTA: Pesare stessa quantità di miscela PDMS ogni momento di ottenere stampi PDMS di uguale spessore. </li><li> Determinare l&#39;orientamento anisotropi PDMS nanopatterns come nanogratings sotto un microscopio ottico e segnare sul retro degli stampi PDMS con un pennarello. NOTA: Non è necessario marcare l&#39;orientamento nanotopography isotropo come nanopillars. </li><li> Pulire un substrato di Si con etanolo in una cappa aspirante e asciugarlo con aria compressa. </li><li> Tagliare le aree nanostrutturata di ogni stampo PDMS con una lama. NOTA: Per gli stampi PDMS che verranno messi alla periferia dello stampo cucito, solo le aree nanostrutturata a contatto con altri dovrebbero essere tagliati fuori. </li><li> Mettere lo stampo PDMS rifinito con la nanopattern a faccia in giù sulato specchio del substrato di Si e quindi allineare altri stampi vicino a, ma non toccare lo stampo circostante (s). </li><li> Preparare uno strato adesivo PDMS <ol><li> Cast 1 g degassata PDMS prepolimero (resina PDMS e curare rapporto agente: 10: 1,05) su un vetrino pulito (7,5 cm × 2,5 cm) per formare uno strato dello spessore di 0,5 mm. </li><li> Cuocere lo strato PDMS a 100 ° C su una piastra per 3-5 min. Utilizzare un ago per toccare il livello e garantire che il livello è parzialmente ma non completamente guarita. NOTA: PDMS parzialmente indurito non può fluire come affinati prepolimero PDMS, ma è appiccicoso confronto con PDMS curato. </li></ol></li><li> Posizionare lo strato PDMS sul retro di PDMS stampi allineati e invertire rapidamente questa assemblea e trasferirlo alla piastra. </li><li> Applicare una forza di compressione (5 kPa) utilizzando un blocco di metallo sulla parte superiore del complessivo per assicurare un buon contatto tra lo strato adesivo PDMS e retro di stampi PDMS, e curare le PDMS strato adesivo a 100 ° C per 1 ora. &lt;br /&gt; NOTA: regolare accuratamente la posizione del blocco metallico per evitare l&#39;inclinazione del complesso. </li><li> Rimuovere il blocco di metallo e staccare il singolo, di stampo PDMS cucita dal substrato di Si. </li></ol> 3. Generazione di uno stampo master su PS substrati Nota: Lo stampo PDMS cucita immobilizzato su un vetrino può essere utilizzato per generare uno stampo master su un piatto di PS o un film sottile PS, da cui possono essere prodotti lavorativi substrati nanostrutturati. <ol><li> Generare uno stampo master su un piatto di PS <ol><li> Preparare un piatto di PS <ol><li> Essiccare i granuli PS in un forno sotto vuoto a 80 ° C per due giorni. </li><li> Preriscaldare una pressa a 230 ° C. </li><li> Assemblare una piastra di alluminio, un foglio di politetrafluoroetilene (PTFE) e il distanziatore di alluminio in un ordine dal basso verso l&#39;alto. </li><li> Carico 3,5 g pellets PS del distanziatore di alluminio con una apertura quadrata di 3 cm (L) × 3 cm (W) × 0,3 cm (H). NOTA: Il distanziatore è di circa 0.1 cm di spessore maggiore di stampi PDMS, e quindi il substrato finale nanostrutturati PS ha uno spessore di circa 0,1 cm. </li><li> Posizionare un altro foglio di PTFE e poi un altro piatto di alluminio sul distanziatore di alluminio. </li><li> Posizionare il gruppo nella macchina stampa. </li><li> Preriscaldare i pellet PS a 230 ° C per 30 min. </li><li> Applicare una pressione di compressione (0,1 MPa) sul gruppo per 5 min. </li><li> Rilasciare la pressione e poi riapplicare una pressione di compressione di 0,5 MPa sul gruppo. </li><li> Ripetere il passaggio 3.1.1.9 con un aumento di pressione di 0,5 MPa fino alla pressione desiderabile di 1,5 MPa è raggiunto. </li><li> Spegnere il riscaldatore della macchina pressa e raffreddarlo sotto i 70 ° C ad una pressione costante di 1,5 MPa. </li><li> Prendere l&#39;assieme e conservare la piastra di PS in stufa da vuoto a 80 ° C per evitare che l&#39;umidità rientrare la piastra PS. </li></ol></li><li> Nanoimprint lo stampo PDMS cucito in piatto di PS <ol><li> Posizionare la piastra di PS in un distanziale in alluminioimpostato su 3 pollici Si wafer. NOTA: Le dimensioni interne del distanziale sono uguali a quelli della lastra PS modo la piastra PS adatta a destra nel distanziatore. </li><li> Riscaldare la lastra PS su una piastra riscaldante a 250 ° C per 30 min. </li><li> Mettere lo stampo PDMS cucita con nanopatterns a faccia in giù sulla lastra PS fuso. NOTA: Un lato dello stampo PDMS è messo in contatto con la superficie della lastra PS primo e un altro lato si abbassa progressivamente a contatto con la superficie PS per evitare la formazione di bolle d&#39;aria all&#39;interfaccia. Attenzione: La superficie della piastra è caldo. Indossare thermogloves durante il processo nanoimprinting. </li><li> Inserire una piastra di alluminio sul vetrino dello stampo PDMS cucita. </li><li> Applicare una pressione di compressione (12,5 kPa) utilizzando blocchi di metallo sulla piastra di alluminio e attendere 3 min. NOTA: Assicurarsi che la piastra di alluminio non sia inclinato. </li><li> Sollevare e sostituire il blocco di metallo dalla piastra di alluminio e ioaumentare l pressione di compressione a 25 kPa. </li><li> Ripetere il passaggio 3.1.2.6 con la pressione aumentata a 50 kPa. NOTA: Questo passaggio è quello di rimuovere l&#39;aria intrappolata tra lo stampo PDMS e la piastra di PS. </li><li> Mantenere la temperatura della piastra tra 240 e 250 ° C sotto la pressione costante di 50 kPa per 15 min. </li><li> Spegnere la piastra e raffreddare l&#39;intero setup. NOTA: La ventola può essere utilizzato per accelerare il processo di raffreddamento. </li><li> Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura è inferiore a 50 ° C, e con attenzione staccare lo stampo PDMS cucita dalla piastra di PS. NOTA: Il substrato PS ha le nanopatterns inversa e può essere usato come stampo master per produrre lavoro PDMS substrati. </li></ol></li></ol></li><li> Generare uno stampo master su un film sottile PS <ol><li> Preparare una sottile pellicola PS <ol><li> Sciogliere 1 g PS in 10 ml di toluene in una cappa aspirante. Attenzione: Toluene può causare irritatio pellen e gravi lesioni oculari, e possono provocare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta. Indossare adeguato DPI. </li><li> Spin-coat soluzione PS 1 ml su un wafer 2-in a 2.500 rpm per 1 min per formare ~ 1 micron di spessore PS film sottile. </li><li> Evaporare toluene dal film impostando il film PS su Si wafer in una cappa aspirante per 3 giorni. </li><li> Ricuocere il film sottile PS in stufa da vuoto a 80 ° C per una notte. </li></ol></li><li> Nanoimprint lo stampo PDMS su una sottile pellicola PS <ol><li> Mettere lo stampo PDMS cucita con nanotopography a faccia in giù sul film sottile PS, che è impostato su una piastra. </li><li> Applicare una pressione di compressione di 12 kPa sullo stampo PDMS utilizzando blocchi di metallo sul lato di vetro dello stampo PDMS. </li><li> Aumentare la temperatura della piastra riscaldante a 180 ° C e mantenere per 15 min. Attenzione: La pellicola PS fuso può funzionare come lubrificante. Prestare attenzione per evitare che i blocchi di metallo di scivolare fuori. </li><li> Spegnere la piastrae raffreddare l&#39;intero setup. NOTA: La ventola può essere utilizzato per accelerare il processo di raffreddamento. </li><li> Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura scende al di sotto di 50 ° C, e attentamente staccare lo stampo PDMS cucita dal film PS. NOTA: Il film nanostrutturati PS servirà come uno stampo maestro per produrre substrati PDMS di lavoro. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento Nota: le cellule epiteliali umane sono coltivate sulle nanotopographies rappresentativi per dimostrare la modulazione nanotopographical di diffusione delle cellule. <ol><li> Cast substrati lavoro PDMS dallo stampo matrice generata da entrambi Fase 3.1 o 3.2 a seconda dell&#39;applicazione. </li><li> Utilizzando una conca arco in acciaio pugno, tagliare i PDMS nanostrutturati substrati in dischi per adattare la configurazione di un piatto multi-ben specifici (ad esempio targa, 24 pozzetti). </li><li> Utilizzare le pinzette per posizionare i dischi PDMS nei pozzetti oFa piatto multi-bene. </li><li> Sterilizzare i substrati PDMS utilizzando etanolo al 70% e quindi l&#39;esposizione UV, ciascuno per 30 min. </li><li> Lavare le PDMS substrati con 1x fosfato sterile salina tamponata (PBS) per tre volte. </li><li> Rivestire le PDMS substrati con proteine della matrice extracellulare (cioè, 20 ug / ml fibronectina) per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i PDMS substrati tre volte con PBS sterile, ciascuno per 5 min. </li><li> Sospendere A549 delle cellule del cancro del polmone umano in media aquila Dulbecco modificato con il 10% di siero fetale bovino e contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Piastra le cellule ad una densità di semina di 2.000 cellule / cm 2 sui PDMS substrati e li coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 per un giorno. </li><li> Lavare le cellule con PBS per tre volte. </li><li> Fissare le cellule in una miscela di 4% paraformaldeide e glutaraldeide al 2% in PBS per 4 ore e disidratare le cellule utilizzando un CO 2 PO criticaint asciugatrice per la scansione elettronica osservazione al microscopio 29. Attenzione: Paraformaldeide e glutaraldeide possono causare gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Operare in una cappa chimica e all&#39;usura adeguata DPI. </li></ol>

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<li>Yang, Y., Kulangara, K., Sia, J., Wang, L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+Microfluidic+Cell+Culture+Platform+Embedded+with+Nanoscale+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of a Microfluidic Cell Culture Platform Embedded with Nanoscale Features.</a> Lab Chip. 11 (9), 1638-1646 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotopographical+modulation+of+cell+function+through+nuclear+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Nanotopographical modulation of cell function through nuclear deformation.</a> Acs Appl. Mater. Inter. 8 (8), 5082-5092 (2016).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Kulangara, K., Lam, R. T. S., Dharmawan, R., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Topographical+and+Mechanical+Property+Alterations+Induced+by+Oxygen+Plasma+Modification+on+Stem+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Effects of Topographical and Mechanical Property Alterations Induced by Oxygen Plasma Modification on Stem Cell Behavior.</a> ACS Nano. 6 (10), 8591-8598 (2012).</li>
<li>Hua, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Imprint+Lithography+with+Molecular-Scale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Polymer Imprint Lithography with Molecular-Scale Resolution.</a> Nano Lett. 4 (12), 2467-2471 (2004).</li>
<li>Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+molded+polydimethylsiloxane+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures.</a> Adv. Mater. 9 (9), 741-746 (1997).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vi presentiamo un metodo semplice, economico, ma versatile per generare una vasta area di substrato nanostrutturati. Per espandere fedelmente nanopatterns altamente definite, grande attenzione deve essere rivolta a diversi passaggi critici. Il primo è quello di tagliare le molteplici stampi PDMS. aree nanostrutturata degli stampi PDMS devono essere rimossi. Inoltre, le pareti laterali degli stampi devono essere tagliati verticalmente perfetto possibile per minimizzare gli spazi tra gli stampi. Collettivamente, la porzio...

Un certo numero di recenti scoperte rivelano che la nanotopografia del substrato ha un'influenza pronunciata sul comportamento cellulare, dall'adesione, diffusione e migrazione cellulare, alla proliferazione e differenziazione1-6. Ad esempio, sono state osservate cellule di dimensioni più piccole e un tasso di proliferazione inferiore in cellule coltivate su nanoreticoli profondi, portando anche all'apoptosi, sebbene l'allineamento, l'allungamento e la migrazione cellulare siano stati migliorati, rispetto ai controlli piatti2,7-10. Inoltre, è stato dimostrato che la nanotopografia facilita la differenziazione delle cellule staminali in determinati lignaggi come il neurone2,11,12, il muscolo13 e l'osso3,4. Inoltre, a causa delle crescenti preoccupazioni sulla tossicità dei nanomateriali ingegnerizzati14,15, è necessario incorporare la nanotopografia in modelli in vitro fisiologicamente rilevanti per un'accurata valutazione del rischio dei nanomateriali. Per completare le analisi biochimiche e di biologia molecolare, è necessario un numero sufficiente di cellule da coltivare su un'ampia area di substrato nanostrutturato. Tuttavia, le tecniche convenzionali di nanofabbricazione hanno dei limiti per generare nanomodelli altamente definiti su una vasta area.
L'autoassemblaggio, inclusa la litografia colloidale16 e la demiscelazione dei polimeri17, può generare facilmente nanostrutture di grandi dimensioni a bassi costi. Poiché l'autoassemblaggio si basa sulle interazioni tra gli elementi di assemblaggio, come le particelle colloidali e le macromolecole, e sulle possibili interazioni tra questi elementi e il substrato, non può essere un metodo autonomo per produrre nanostrutture con un posizionamento spaziale preciso e forme arbitrarie18. Anche l'alta densità di difetti che l'accompagna è uno svantaggio. Il controllo spaziale preciso dei nanopattern può essere ottenuto impiegando l'autoassemblaggio basato su modelli, che utilizza approcci litografici top-down per fornire il modello topografico e/o chimico per guidare l'assemblaggio dal basso verso l'alto degli elementi di assemblaggio19-21. Sono state sviluppate tecniche di nanofabbricazione alternative, come la litografia step-and-flash22 e la litografia a nanoimprinting roll-to-roll23, ma hanno un uso limitato a causa del loro processo sofisticato o della necessità di attrezzature specializzate. Tuttavia, è necessario un modello o uno stampo master con modelli definiti su scala nanometrica per le tecniche di nanofabbricazione basate su modelli o alternative. 
Tali modelli e stampi master sono convenzionalmente generati utilizzando la litografia a fascio di elettroni, ioni o fotoni focalizzati. Ad esempio, la litografia a fascio di elettroni (EBL)24 e la litografia a fascio ionico focalizzato25 possono generare modelli definiti con una risoluzione inferiore a 5 nm. La litografia a due fotoni ha dimostrato una dimensione della caratteristica di soli 30 nm26. Sebbene le tecniche di litografia a fascio focalizzato consentano la generazione di strutture su scala nanometrica ben definite, l'investimento di capitale e il processo lungo e costoso ne limitano l'uso diffuso nella ricerca accademica27. Pertanto, è altamente auspicabile sviluppare tecniche abilitanti ma convenienti per produrre un'ampia area di superfici nanomodellate con alta fedeltà.
Abbiamo riportato una tecnica di punto semplice ed economica per generare una vasta area di superficie nanomodellata da un piccolo stampo ben definito28. Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo dalla replicazione di stampi in poli(dimetilsilossano) (PDMS) utilizzando un modello scritto EBL, all'assemblaggio di più stampi PDMS in un unico grande stampo, alla generazione di uno stampo master su substrati polimerici come il polistirene (PS), alla produzione di substrati di lavoro. Con i substrati nanostrutturati espansi, abbiamo dimostrato la modulazione nanotopografica della diffusione cellulare.

<table><tbody>Evaporatore a fascio elettronico <tr><td>SEM</td><td>JEOL</td><td>JSM-7600F</td><td>EBL</td></tr><tr><td></td><td>Kurt J. Lesker</td><td>Modello: Evaporatore a fascio elettronico LAB 18</td><td>a deposizione di nichel</td></tr><tr><td>Trion Minilock III ICP/RIE</td><td>Tecnologia Trion</td><td>Modello: Minilock-phantom III</td><td></td></tr><tr><td>Pressa</td><td>idraulica PHI</td> Pressa<td>: SQ-230H</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell Tecnologie</td><td>Modello: WS-400A-6NPP-LITE</td><td></td></tr><tr><td>CO2 essiccatore critico</td><td>Tousimis</td><td>Modle: Autosamdri-815</td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td>University Wafer</td><td>1080</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in alluminio</td><td>McMaster-carr</td><td>9057K123</td><td></td></tr><tr><td>Fogli di teflon</td><td>McMaster-carr</td><td>8711K92</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm</td><td>FALCON</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Piastra di Petri 60 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-34</td><td></td></tr><tr><td>Barche di pesatura monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-913-360</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore in plastica</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42025-000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110049SH</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>5726</td><td></td></tr><tr><td>Lama</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr><tr><td>Blocchi di metallo</td><td>McMaster-carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punch</td><td>Brettuns Village Leather Craft Supplies</td><td>Arco punzone</td><td></td></tr><tr><td>Poli(metilmetacrilato)</td> <td>MicroChem</td><td>495 PMMA A4</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 kit</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene</td><td>Dow Chemical</td><td>Styron 685D</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-perfluoroottilmetildiclorosilano</td><td>Oakwood Chemical</td><td>7142</td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore</td><td>MicroChem</td><td>MIBK/IPA a rapporto</td><td></td>1: 3</tr><tr><td>Remover</td><td>MicroChem</td><td>Remover PG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Fisher Scientific</td><td>T324-500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modificato eagle medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Elettrone Microsopy Science</td><td>15712-S</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>celle A549</td><td>ATCC ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr></tbody></table>

espansione nanostrutturati substrati utilizzando la tecnica del punto per nanotopographical modulazione di cell comportamento

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

La nanotopografia del substrato ha dimostrato di essere un potente modulatore del fenotipo e della funzione cellulare. Per sezionare la modulazione nanotopografica del comportamento cellulare, è auspicabile un'ampia area di substrato nanostrutturato in modo che un numero sufficiente di cellule possa essere coltivato sulla nanotopografia per le successive analisi biochimiche e di biologia molecolare. Tuttavia, le attuali tecniche di nanofabbricazione hanno dei limiti per generare nanomodelli altamente definiti su una vasta area. Qui, presentiamo un metodo per espandere i substrati nanomodellati da un nanomodello piccolo e altamente definito a una vasta area utilizzando la tecnica del punto. Il metodo combina più tecniche, che coinvolgono la litografia morbida per replicare stampi in poli(dimetilsilossano) (PDMS) da uno stampo ben definito, la tecnica del punto per assemblare più stampi PDMS in un unico stampo di grandi dimensioni e la nanoimprinting per generare uno stampo master su substrati di polistirene (PS). Con lo stampo master PS, produciamo substrati di lavoro PDMS e dimostriamo la modulazione nanotopografica della diffusione cellulare. Questo metodo fornisce una via semplice, economica ma versatile per generare nanomodelli ben definiti su vaste aree ed è potenzialmente esteso per creare dispositivi su micro/nanoscala con componenti ibridi.

<html> La tecnica del punto può generare una grande superficie di substrati nanostrutturati con alta fedeltà. Figura 1a e 1b visualizzare la grande area di nanopatterns trasferite dallo stampo PDMS cucita piastra PS e PS film sottile su un substrato di Si, rispettivamente. Il confronto tra lo stampo originale EBL-scritta (figura 1c) e le PDMS finali lavorativi substrato (Figura 1d) conferma che le nanopatterns EBL-scritte...

Viene presentato un protocollo per la produzione di una vasta area di substrato nanostrutturato da piccoli stampi nanomodellati per lo studio della modulazione nanotopografica del comportamento cellulare.

Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre un'area estesa di substrato nanopatternato a partire da piccoli stampi nanopatternati, utilizzando una semplice e accessibile tecnica di cucitura versatile. Questo metodo può aiutare a studiare la modulazione della fenotipo e della funzione cellulare indotta dalla nanotopografia del substrato a livello cellulare e molecolare, ad esempio l'espressione delle proteine delle adesioni focali. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità e convenienza economica.Per iniziare, preparare il modulo in silicio silanizzato nel prepoliimero di PDMS, come descritto nel protocollo testuale. Posizionare il modulo in silicio silanizzato in una piastra di Petri da 60 millimetri. Versare il prepoliimero di PDMS sul modulo in silicio all'interno della piastra di Petri.Posizionare la piastra di Petri in un desiccante di plastica ed eseguire la disgasatura per circa 10 minuti, fino alla scomparsa di tutte le bolle. Trasferire la piastra di Petri su un agitatore magnetico riscaldante e polimerizzare il prepolymero di PDMS a 70 gradi Celsius per quattro ore. Rimuovere con attenzione il calco in PDMS dallo stampo in silicio utilizzando pinzette.Determinare l'orientamento dei nanopattern anisotropi in PDMS, come nanogriglie, mediante microscopio ottico, e segnarlo sul retro degli stampi in PDMS con un pennarello. Pulire il substrato di silicio con etanolo in una cappa aspirante, quindi asciugarlo con aria compressa. Rimuovere con una lama le aree non strutturate di ciascuno stampo in PDMS.I modelli in PDMS devono essere allineati il più vicino possibile, ma senza toccare il modello circostante, per ridurre al minimo l'area non strutturata e per evitare che la deformazione della nanostruttura avvenga quando viene applicata la forza di compressione. Posizionare il modello in PDMS tagliato con la superficie nanostrutturata rivolta verso il basso sul lato riflettente del substrato in silicio, quindi allineare gli altri modelli vicino a questi, senza farli toccare. È fondamentale cercare di indurire il PDMS nello strato basale, poiché il PDMS non indurito potrebbe scorrere attraverso gli spazi tra i diversi modelli danneggiando le nanostrutture.Tuttavia, il PDMS completamente polimerizzato non può unire tra loro diversi stampi. Per preparare uno strato adesivo di PDMS, versare un grammo di prepolymero di PDMS disgasato su un vetrino pulito per formare uno strato spesso 0,5 millimetri. Cuocere lo strato di PDMS a 100 gradi Celsius su una piastra riscaldante per tre-cinque minuti.Usare un ago per toccare lo strato ed assicurarsi che lo strato sia parzialmente ma non completamente polimerizzato. Posizionare lo strato di PDMS sul retro degli stampi in PDMS allineati, capovolgere rapidamente questo insieme e trasferirlo sulla piastra riscaldante. Applicare una forza compressiva utilizzando un blocco di metallo posto sulla parte superiore dell'insieme per garantire un buon contatto tra lo strato adesivo di PDMS e il retro degli stampi in PDMS.Polimerizzare lo strato adesivo in PDMS a 100 gradi Celsius per un'ora. Spegnere la piastra riscaldante, rimuovere il blocco di metallo ed eliminare delicatamente il modulo in PDMS con singola cucitura dal substrato in silicio. Per effettuare la nanoimpronta del modulo in PDMS cucito sulla piastra in PS, posizionare la piastra in PS in un distanziatore di alluminio montato su una wafer di silicio da tre pollici.Riscaldare la piastra di PS su una piastra riscaldante a 250 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, posizionare il modulo in PDMS cucito, con le nanostrutture rivolte verso il basso, sulla piastra di PS fusa. Poi, appoggiare una piastra di alluminio sulla lametta di vetro del modulo in PDMS cucito.Applicare una pressione compressiva utilizzando blocchi metallici sulla piastra di alluminio e attendere tre minuti. Sollevare e sostituire il blocco metallico dalla piastra di alluminio, quindi aumentare la pressione compressiva a 25 chilopascal. Successivamente, ripetere questo passaggio aumentando la pressione a 50 chilopascal.Mantenere la temperatura della piastra riscaldante tra 240 e 250 gradi Celsius, sotto una pressione costante di 50 chilopascal, per 15 minuti. Spegnere la piastra riscaldante e far raffreddare l'intero apparato. Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura è scesa al di sotto di 50 gradi Celsius e staccare con attenzione il modulo in PDMS cucito dalla piastra in PS.Per nanoimprontare il film sottile di PS con il calco in PDMS, posizionare il calco in PDMS assemblato con la superficie nanostrutturata rivolta verso il basso sul film sottile di PS, che è appoggiato su una piastra riscaldante. Applicare una pressione compressiva di 12 kilopascals sul calco in PDMS utilizzando blocchi di metallo posizionati sul vetrino porta il calco in PDMS. Aumentare la temperatura della piastra riscaldante fino a 180 gradi Celsius e mantenerla per 15 minuti.Spegnere la piastra riscaldante e far raffreddare l'intero apparato. Rimuovere i blocchi metallici dopo che la temperatura è scesa al di sotto di 50 gradi Celsius e staccare con cura il modulo in PDMS stampato dal film in PS. Utilizzando un punzone cilindrico in acciaio, tagliare i substrati in PDMS con nanostruttura a forma di dischi, adatti alla configurazione di una specifica piastra a pozzetti multipli.Quindi, utilizzare pinzette per posizionare i dischi in PDMS nei pozzetti della piastra a multi-pozzetti. Sterilizzare i substrati in PDMS utilizzando etanolo al 70% per 30 minuti. Successivamente, aspirare l'etanolo ed esporre i campioni a raggi UV per 30 minuti.Lavare i substrati in PDMS con soluzione salina fosfato sterile 1X per tre volte. Successivamente, ricoprire i substrati in PDMS con proteina della matrice extracellulare per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i substrati in PDMS tre volte con PBS sterile, ogni volta per cinque minuti.Sospendere le cellule umane di carcinoma polmonare A549 in Dulbecco's Modified Eagle Medium contenente il 10% di siero fetale bovino e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seminare le cellule a una densità di semina di 2.000 cellule per centimetro quadrato su substrati in PDMS. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica per un giorno e osservarle successivamente.Il nanopattern generato sulla piastra di PS e sul film sottile è mostrato qui. Le frecce indicano l'innalzamento del polimero negli interstizi dei modelli in PDMS assemblati. Queste immagini al microscopio elettronico a scansione dimostrano che i substrati in PDMS riproducono fedelmente il nanopattern realizzato mediante litografia a fascio di elettroni, applicando la tecnica di assemblaggio.Qui sono mostrate immagini rappresentative al SEM di cellule A549 coltivate su nanogriglie e nanopilastri. Le cellule mostrano una morfologia allineata sulle nanogriglie, mentre si espandono in modo casuale sui nanopilastri. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare un'area estesa di substrato con nanostrutture unendo più stampi piccoli e definiti con nanostrutture.Ricordare che lavorare con toluene e paraformaldeide può essere estremamente pericoloso, e indossare sempre un'adeguata attrezzatura di protezione individuale durante l'esecuzione delle procedure.

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Bioengineering

Bioingegneria

Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine ​​e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Segnaliamo su tecniche per micropattern nanoporosi film sottili di oro tramite la stampa stencil e fotolitografia, così come i metodi di cellule di coltura, su modelli di microfabbricati. Inoltre, si descrivono metodi di analisi di immagine per caratterizzare morfologia del materiale e le cellule in coltura mediante scansione elettronica e tecniche di microscopia a fluorescenza.

Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

Questo protocollo descrive un metodo compatibile microfabbricazione per patterning cellulare su SiO 2. Un disegno predefinito parylene-C è fotolitograficamente stampato su SiO 2 wafer. Dopo l'incubazione con siero (o altra soluzione di attivazione) cellule aderiscono specificamente (e crescere secondo la conformità dei) sottostante parylene-C, pur essendo repulsione per SiO 2 regioni.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Questo manoscritto presenta una tecnica per applicare o liberare forze su cellule o tessuti aderenti usando allungamento unidirezionale.

Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.

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Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di piastre gradiente GNSM via nanoimprinting termica e il metodo di screening risposte di cellule progenitrici endoteliali umane alle nanostrutture. Utilizzando la tecnologia descritta, è possibile produrre un ponteggio che può manipolare il comportamento delle cellule di stimoli fisici.

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Questo protocollo introduce un metodo di micromodellazione senza litografia che è semplice e accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato. Questo metodo utilizza stencil personalizzati tagliati al laser per micropattern proteine a matrice extracellulare in una forma di interesse per la modulazione delle morfologie cellulari. La procedura per la micropatterning è dimostrata utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti.

Micropatterning a cella singola semplice senza litografia con stencil laser-cut

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Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

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Tradizionalmente, la coltura cellulare viene eseguita su substrati planari che imitano male l'ambiente naturale delle cellule in vivo. Qui descriviamo un metodo per produrre substrati di coltura cellulare con geometrie curve fisiologicamente rilevanti e proteine extracellulari micropatternate, consentendo indagini sistematiche sul rilevamento cellulare di questi segnali extracellulari.

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Impara a produrre substrati nanopatterned di grandi dimensioni da stampi piccoli utilizzando la tecnica del punto con PDMS. Questo metodo semplice ed economico permette di studiare la modulazione nanotopografica del comportamento cellulare.

Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

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