Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre un'area estesa di substrato nanopatternato a partire da piccoli stampi nanopatternati, utilizzando una semplice e accessibile tecnica di cucitura versatile. Questo metodo può aiutare a studiare la modulazione della fenotipo e della funzione cellulare indotta dalla nanotopografia del substrato a livello cellulare e molecolare, ad esempio l'espressione delle proteine delle adesioni focali. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità e convenienza economica.

Per iniziare, preparare il modulo in silicio silanizzato nel prepoliimero di PDMS, come descritto nel protocollo testuale. Posizionare il modulo in silicio silanizzato in una piastra di Petri da 60 millimetri. Versare il prepoliimero di PDMS sul modulo in silicio all'interno della piastra di Petri.

Posizionare la piastra di Petri in un desiccante di plastica ed eseguire la disgasatura per circa 10 minuti, fino alla scomparsa di tutte le bolle. Trasferire la piastra di Petri su un agitatore magnetico riscaldante e polimerizzare il prepolymero di PDMS a 70 gradi Celsius per quattro ore. Rimuovere con attenzione il calco in PDMS dallo stampo in silicio utilizzando pinzette.

Determinare l'orientamento dei nanopattern anisotropi in PDMS, come nanogriglie, mediante microscopio ottico, e segnarlo sul retro degli stampi in PDMS con un pennarello. Pulire il substrato di silicio con etanolo in una cappa aspirante, quindi asciugarlo con aria compressa. Rimuovere con una lama le aree non strutturate di ciascuno stampo in PDMS.

I modelli in PDMS devono essere allineati il più vicino possibile, ma senza toccare il modello circostante, per ridurre al minimo l'area non strutturata e per evitare che la deformazione della nanostruttura avvenga quando viene applicata la forza di compressione. Posizionare il modello in PDMS tagliato con la superficie nanostrutturata rivolta verso il basso sul lato riflettente del substrato in silicio, quindi allineare gli altri modelli vicino a questi, senza farli toccare. È fondamentale cercare di indurire il PDMS nello strato basale, poiché il PDMS non indurito potrebbe scorrere attraverso gli spazi tra i diversi modelli danneggiando le nanostrutture.

Tuttavia, il PDMS completamente polimerizzato non può unire tra loro diversi stampi. Per preparare uno strato adesivo di PDMS, versare un grammo di prepolymero di PDMS disgasato su un vetrino pulito per formare uno strato spesso 0,5 millimetri. Cuocere lo strato di PDMS a 100 gradi Celsius su una piastra riscaldante per tre-cinque minuti.

Usare un ago per toccare lo strato ed assicurarsi che lo strato sia parzialmente ma non completamente polimerizzato. Posizionare lo strato di PDMS sul retro degli stampi in PDMS allineati, capovolgere rapidamente questo insieme e trasferirlo sulla piastra riscaldante. Applicare una forza compressiva utilizzando un blocco di metallo posto sulla parte superiore dell'insieme per garantire un buon contatto tra lo strato adesivo di PDMS e il retro degli stampi in PDMS.

Polimerizzare lo strato adesivo in PDMS a 100 gradi Celsius per un'ora. Spegnere la piastra riscaldante, rimuovere il blocco di metallo ed eliminare delicatamente il modulo in PDMS con singola cucitura dal substrato in silicio. Per effettuare la nanoimpronta del modulo in PDMS cucito sulla piastra in PS, posizionare la piastra in PS in un distanziatore di alluminio montato su una wafer di silicio da tre pollici.

Riscaldare la piastra di PS su una piastra riscaldante a 250 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, posizionare il modulo in PDMS cucito, con le nanostrutture rivolte verso il basso, sulla piastra di PS fusa. Poi, appoggiare una piastra di alluminio sulla lametta di vetro del modulo in PDMS cucito.

Applicare una pressione compressiva utilizzando blocchi metallici sulla piastra di alluminio e attendere tre minuti. Sollevare e sostituire il blocco metallico dalla piastra di alluminio, quindi aumentare la pressione compressiva a 25 chilopascal. Successivamente, ripetere questo passaggio aumentando la pressione a 50 chilopascal.

Mantenere la temperatura della piastra riscaldante tra 240 e 250 gradi Celsius, sotto una pressione costante di 50 chilopascal, per 15 minuti. Spegnere la piastra riscaldante e far raffreddare l'intero apparato. Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura è scesa al di sotto di 50 gradi Celsius e staccare con attenzione il modulo in PDMS cucito dalla piastra in PS.

Per nanoimprontare il film sottile di PS con il calco in PDMS, posizionare il calco in PDMS assemblato con la superficie nanostrutturata rivolta verso il basso sul film sottile di PS, che è appoggiato su una piastra riscaldante. Applicare una pressione compressiva di 12 kilopascals sul calco in PDMS utilizzando blocchi di metallo posizionati sul vetrino porta il calco in PDMS. Aumentare la temperatura della piastra riscaldante fino a 180 gradi Celsius e mantenerla per 15 minuti.

Spegnere la piastra riscaldante e far raffreddare l'intero apparato. Rimuovere i blocchi metallici dopo che la temperatura è scesa al di sotto di 50 gradi Celsius e staccare con cura il modulo in PDMS stampato dal film in PS. Utilizzando un punzone cilindrico in acciaio, tagliare i substrati in PDMS con nanostruttura a forma di dischi, adatti alla configurazione di una specifica piastra a pozzetti multipli.

Quindi, utilizzare pinzette per posizionare i dischi in PDMS nei pozzetti della piastra a multi-pozzetti. Sterilizzare i substrati in PDMS utilizzando etanolo al 70% per 30 minuti. Successivamente, aspirare l'etanolo ed esporre i campioni a raggi UV per 30 minuti.

Lavare i substrati in PDMS con soluzione salina fosfato sterile 1X per tre volte. Successivamente, ricoprire i substrati in PDMS con proteina della matrice extracellulare per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i substrati in PDMS tre volte con PBS sterile, ogni volta per cinque minuti.

Sospendere le cellule umane di carcinoma polmonare A549 in Dulbecco's Modified Eagle Medium contenente il 10% di siero fetale bovino e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seminare le cellule a una densità di semina di 2.000 cellule per centimetro quadrato su substrati in PDMS. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica per un giorno e osservarle successivamente.

Il nanopattern generato sulla piastra di PS e sul film sottile è mostrato qui. Le frecce indicano l'innalzamento del polimero negli interstizi dei modelli in PDMS assemblati. Queste immagini al microscopio elettronico a scansione dimostrano che i substrati in PDMS riproducono fedelmente il nanopattern realizzato mediante litografia a fascio di elettroni, applicando la tecnica di assemblaggio.

Qui sono mostrate immagini rappresentative al SEM di cellule A549 coltivate su nanogriglie e nanopilastri. Le cellule mostrano una morfologia allineata sulle nanogriglie, mentre si espandono in modo casuale sui nanopilastri. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare un'area estesa di substrato con nanostrutture unendo più stampi piccoli e definiti con nanostrutture.

Ricordare che lavorare con toluene e paraformaldeide può essere estremamente pericoloso, e indossare sempre un'adeguata attrezzatura di protezione individuale durante l'esecuzione delle procedure.