Sviluppo di un virus System Reporter dell'epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

L'obiettivo generale di questo sistema reporter HBV ricombinante è quello di semplificare l'esecuzione di screening di massa per il virus anti-epatite B, o agenti HBV. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'HBV, come lo screening per gli agenti anti-HBV e l'identificazione dei fattori HBV. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il sistema reporter HBV può monitorare le prime fasi del ciclo di replicazione dell'HBV.

Dopo aver preparato il terreno di coltura cellulare, il giorno prima della trasvezione, posizionare quattro volte 10 alle sei cellule HepG2 nel terreno, su un piatto rivestito di collagene di 10 cm. Incubare le cellule a 37 gradi C in un incubatore umidificato al 5% di CO2. Utilizzando un agente transvezionario secondo le istruzioni del produttore, traspetta le cellule con 5 mcg di pUC1 2HBV delta epsilon e 5 mcg di pUC1 2HBV/NL.

Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco. Quindi, una settimana dopo la trasvezione, trasferire il terreno di coltura contenente l'HBV ricombinante in una provetta da 50 mL. Quindi, aggiungere 10 mL di terreno di coltura fresco alla piastra contenente le cellule trasvette.

Quindi raccogliere e centrifugare il terreno di coltura a 2.300 x g per cinque minuti per rimuovere i detriti cellulari contenenti l'HBV ricombinante. Passare il surnatante attraverso un filtro a membrana da 45 mcm. Quindi aggiungere un volume uguale di 25% di PEG, 1,5 molari di NaCl, al filtrato e mescolare delicatamente.

Incubare il campione per una notte a quattro gradi C.Il giorno seguente, centrifugare la soluzione a 2, 300 x g e quattro gradi C, per 20 minuti. Scartare il surnatante e sciogliere il pellet in 5 mL di tampone TNE. Centrifugare nuovamente il campione per rimuovere i detriti cellulari, quindi caricare 5 mL di HBV ricombinante contenente TNE su 8 mL di saccarosio al 20% in TNE.

Centrifugare i due a 100, 000 x g e 15 gradi Celsius per tre ore. Scartare la maggior parte possibile del surnatante e utilizzare 1 mL di DMEM privo di siero per 40 mL di coltura iniziale per risospendere il pellet. Incubare la sospensione a quattro gradi Celsius durante la notte.

La mattina seguente, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 45 mcm. Quindi preparare aliquote da 5 ml e conservare le provette a meno 80 gradi Celsius. Piastre di cellule HepG2, che esprimono stabilmente il polipeptide cotrasportatore del taurocolato di sodio, o NTCP, che sono suscettibili all'infezione da HBV e incubano a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Un giorno prima dell'infezione, immergere circa cinque volte le cellule NTCP HepG2 da 10 a quarti nei pozzetti di una piastra rivestita di collagene a 96 pozzetti, in 1 mL di terreno di coltura. Scongelare l'HBV ricombinante in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, fino a quando non rimane un po' di ghiaccio nella fiala. Preparare il terreno per l'infezione combinando 78 mcL di terreno di coltura fresco, 2 mcL di DMSO, 10 mcL di PEG 8000 al 40%, in 1x PBS e 10 mcL di HPV ricombinante.

Aggiungere 100 mcL di soluzione ricombinante di HBV a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Un giorno dopo l'infezione, utilizzare 300 mcL di PBS per lavare la cellula tre volte per rimuovere la proteina reporter contaminante dalla frazione virale. Aggiungere 200 mcL di terreno di coltura, contenente il 2% di DMSO, alle cellule infette e incubare per una settimana o meno.

Per effettuare l'analisi dell'infezione da HBV, una settimana dopo l'infezione, utilizzare il PBS per lavare le cellule infette tre volte. Aggiungere 50 mcL di tampone di lisi alle cellule infette. Far oscillare la piastra di coltura per cinque minuti, quindi centrifugare a 2.000 x g per cinque minuti.

Aggiungere 50 mcL del substrato reporter a una piastra luminometrica. Quindi aggiungere 20 mcL di lisato cellulare alla piastra e mescolare agitando brevemente. Infine, posiziona la lastra nel luminometro e avvia la lettura.

Questo gel mostra la digestione del plasmide reporter pUC1 2HBVNL costruito e del plasmide helper delta pUC1 2HBV con HindII ed EcoRI. Entrambi i campioni producono le dimensioni di banda previste. In questo western blot, i lisati delle cellule HepG2, o delle cellule HepG2 che esprimono NTCP ricombinante con myc-marcato e infettati con HBV ricombinante, sono stati sondati con un anticorpo anti-myc che riconosce le proteine ricombinanti 34 kDa non glicosilate e 65 kDa glicosolate.

I grafici mostrati qui illustrano la cinetica del gene reporter. Livelli di RNA e DNA nel clone 22 di HepG2 NTCP ricombinante infettato da HBV o in cellule epatocitarie primarie umane. I livelli di HBV RNA nell'attività reporter erano elevati a tre giorni dopo l'infezione, sia nelle cellule infette che negli epatociti primari.

Al contrario, non c'è stato alcun cambiamento nei livelli di DNA a nove giorni dopo l'infezione, perché l'HBV ricombinante è carente per il nucleo funzionale e il polo, che svolgono un ruolo importante nella via di replicazione del DNA intracellulare. In questa figura, viene illustrata l'inibizione dell'HBV ricombinante da parte delle immunoglobuline dell'epatite B, o HBIG, eparina e IFN-beta. L'HBIG e l'eparina hanno fortemente soppresso l'attività del reporter a meno del 10% rispettivamente a 75 U/mL e 150 U/mL.

L'IFN-beta, d'altra parte, ha soppresso l'attività dei reporter a meno del 50% a 1000 U/mL. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana per la preparazione dell'HBV ricombinante, in sei giorni per l'infezione da HBV ricombinante e, in sintesi, mezzi per la misurazione della proteina reporter, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la fase di lavaggio che rimuove la proteina reporter contaminante dalla frazione di polarizzazione.

A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti altri risultati come l'infezione da HBV ampio per rispondere a ulteriori domande sul fatto che l'HBV ricombinante non ha prodotto i primi risultati positivi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'HBV per esplorare lo sviluppo di agenti anti-HBV in un modello di coltura cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare e infettare le cellule con l'HBV ricombinante.

Non dimenticare che lavorare con l'HBV ricombinante può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i guanti.