Name: Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di De Novo Metastasi del cancro del mammario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri la metodologia chirurgica per un modello murino di metastasi de novo del cancro mammario. Questo protocollo consente di studiare la progressione metastatica e testare terapie adiuvanti dopo la resezione del tumore primario.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Jo Hill per l&#39;assistenza istopatologica, il Dr. John Gleysteen per l&#39;istruzione in tecnica chirurgica, Tessa Diebel per l&#39;assistenza video, tutti i membri dei laboratori Wong e Coussens per una visione e discussioni critiche e l&#39;OHSU Knight Cancer Institute per il sostegno finanziario. Gli autori riconoscono il supporto di T32GM071388-10 e T32CA106195-11 a CEG, il NCI / NIH, il Dipartimento della Difesa, il programma per la ricerca sul seno del seno, la Fondazione Susan G Komen, la Fondazione per la Ricerca sul Cancro del seno e una Fondazione per il Cancro - Lustgarten (SU2C-AACR-DT14-14) a LMC, un premio alla Fondazione per la Salute delle Donne di Salute a MHW e al Centro Brenden-Colson per la Salute Pancreatica a MHW e LMC.

Gli animali utilizzati nel protocollo seguente sono coperti dal comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali (IACUC) dell&#39;Oregon Health &amp; Science, che è stato progettato per essere conforme alle normative vigenti in materia di benessere degli animali e della politica sanitaria pubblica (PHS). Manutenzione delle condizioni sterili: devono essere utilizzati strumenti sterilizzati e tra i topi devono essere puliti con garza sterile, sciacquati in PBS e sterilizzati con disinfettante al 70% di etanolo per almeno 15 minuti. È necessario indossare un cappello chirurgico, una maschera facciale, un abito e guanti per gli interventi di sopravvivenza. La preparazione pre-operativa dell&#39;animale per interventi di sopravvivenza è inclusa nel seguente protocollo. Fare riferimento alla tabella 1 per un elenco di reagenti e attrezzature. 1. Isolamento e preparazione di sospensioni di cellule singole da tumori primari del mammario <ol><li> Anestetizzare i topi transgenici MMTV-PyMT (FVB / n) femmina donatrice di 100 giorni e mantenere sotto cOntinuosa sedazione somministrando 2% di isoflurano attraverso una maschera di anestesia. Confermare che il mouse sia correttamente anestetizzato con un riflesso a pinza assente. </li><li> In un ambiente sterile, i respirazione di tumori mammari primari da topi femmina transgenici MMTV-PyMT (FVB / n) di 100 giorni, separando il tumore mammario dalla pelle sovrapposta e dai tessuti adiposi circostanti e / o dai linfonodi usando forbici sterili. Eutanizzare i topi anestetizzati per dislocazione cervicale. </li><li> Con forbici sterili o un bisturi, sminuzzare tumori primari manualmente in piccoli pezzi (~ 1,0 millimetri 3). Posizionare i tumori in 3,0 mg / mL collagenasi A e 4,0 U / mL DNasi I sciolti in DMEM. Utilizzare ~ 10 mL del suddetto mezzo di digestione per un tumore di diametro di 1,0 cm. <ol><li> Effettuare la digestione in una bottiglia sterile da 25 ml con una barra di stirata sterile a ~ 125 giri / min e 37 ° C per 40 min. </li></ol></li><li> Fermare la digestione aggiungendo il siero fetale fetale (FBS) ad una diluizione finale del 10% e collocare l&#39;intera miscela su wDove si mantiene. </li><li> Filtrare la sospensione tumorale digerita attraverso un filtro in nylon da 0,7 μm in un tubo conico da 50 ml e scartare qualsiasi tumore rimasto nel filtro. Centrifugare il surnatante a 300 xg a 4 ° C. </li><li> Resuspendere il pellet in 10 mL di DMEM per 1,0 cm di tumore e ri-filtrare attraverso un filtro in nylon da 0,7 μm. Conta concentrazione delle cellule, quindi centrifugare a 300 xg a 4 ° C. </li><li> Resuspendere il pellet nel 10% dimetilsolfossido con il 90% di FBS ad una concentrazione di 2 x 10 7 cellule vive / mL. Conservare le sospensioni a cellule singole di intero tumore primario a -80 ° C. </li></ol> 2. Iniezione ortotopica del tumore mammario <ol><li> Parzialmente scongelare le sospensioni tumorali primarie congelate a 37 ° C fino a quando il pellet congelato può essere rilasciato dal tubo criogenico in 20 mL di DMEM e contare le cellule. Centrifugare a 300 xg a 4 ° C e risospendere le cellule in 1: 1 DMEM: preparazione solubilizzata di membrana basale a fattore di crescita ridottaEstratto dal sarcoma del mouse di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule / ml (vedi tabella dei materiali ). </li><li> Mettere il lato ventrale femminile sinergico del ricevente anestetizzato e mantenere in sedazione continua somministrando 2% di isoflurano tramite una maschera di anestesia. </li><li> Sterilizzare il 4 ° sito di iniezione della ghiandola mammaria usando etanolo al 70% aerosolizzato e applicando Poly (vinilpirrolidone) -Iodina con un tampone sterile in cotone. </li><li> Iniettare 100 μL (1 x 10 6 cellule vive dalle sospensioni tumorali primarie congelate) in senso inverso verso l&#39;alto fino alla 4a ghiandola mammaria destra del 6- 10 settimane FVB / n femminile utilizzando una siringa da 29 g 0,3 ml di insulina. </li></ol> 3. Resezione chirurgica del tumore ortotopico del mammario <ol><li> 38-60 giorni dopo l&#39;iniezione delle cellule tumorali, eutanizzano i topi che non presentavano volumi tumorali ortotopici che vanno da 172 a 450 mm 3 in volume [lunghezza x (larghezza 2 </Sup&gt;) / 2] (circa il 75% dei topi iniettati). </li><li> Posizionare i topi anestetizzati visualizzando il lato ventrale appropriato del tumore fino alla sedazione continua somministrando 2% di isoflurano tramite una maschera di anestesia e confermare che il mouse è correttamente anestetizzato con un riflesso a pinza assente. Applicare unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante la sedazione. </li><li> Spruzzare il 70% di etanolo per sterilizzare l&#39;area chirurgica che circonda il tumore primario, quindi applicare Poly (vinilpirrolidone) -Iodina con un tampone sterile di cotone. NOTA: La rimozione dei capelli presso il sito chirurgico ha provocato estrazioni cutanee e / o infezioni per topi del ~ 5% e fu pertanto escluso da questo passaggio (dati non mostrati). </li><li> Come mostrato in Figura 1C , effettuare un&#39;incisione iniziale della pelle usando forbici sbarrate medial-caudali al tumore. </li><li> Successivamente, fare un&#39;escissione superiore della pelle ( Figura 1C ) mediale al tumore. Prestate attenzione alla necessità di cauterizzare qualsiasi vascolarizzazioneIl tumore posto sulla pelle prima di estendere l&#39;incisione. </li><li> Continuare l&#39;incisione della pelle lateralmente (posteriormente al tumore), quindi fare un&#39;escisione superiore della pelle (laterale al tumore) e l&#39;escissione mediale (superiore al tumore) ( Figura 1C ). </li><li> Dopo che la pelle è stata tagliata circonferenzialmente intorno al tumore ( Figura 1C ), sollevare la pelle sovrapposta attaccata al tumore utilizzando le pinze, mentre sbucchiando il tumore lontano dalla muscolatura della parete addominale e mantenendo intatte le ghiandole mammarie. </li><li> Identificare (per via smussa) e cauterizzare grandi vasi che attraversano i 4 ° e 5 ° ghiandola mammaria. </li><li> Excise circa la metà dei 4 ° e 5 ° ghiandole mammarie nel sito cauterizzazione per liberare il tumore, pelle sovrastante, e segmenti delle ghiandole mammarie (Figura 1C). </li><li> In caso di sanguinamento, identificare attivamente il sanguinamentoImbarcazioni e immediatamente cauterizzarle. Se si perde più di 250 μL di sangue, escludere il topo da studi e eutanizzarlo. </li><li> Chiudere i siti di escissione con le clip della ferita utilizzando un applicatore a clip ferito ( Figura 1C ). NOTA: Rimuovere le clip della ferita 10 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico con un rimontaggio della ferita. </li><li> Amministrare salina sterile calda subcutanea (4% del peso corporeo dell&#39;animale) e mantenere l&#39;animale caldo con una lampada di calore. Controllare gli animali ogni 5-10 minuti durante il recupero dall&#39;anestesia. NOTA: L&#39;amministrazione di bupivacaina o lidocaina ha aumentato la mortalità post-operatoria (dati non mostrati). I topi che mostravano segni di dolore (colpi, mancanza di spostamento, mancanza di sposo) sono stati eutanizzati 1 h dopo la chirurgia. <ol><li> Una volta che il mouse è completamente recuperato, restituirlo alla compagnia di altri topi. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento e trattamento di sangue e polmone per la citometria e l&#39;istologia di flusso &lt;ol&gt; <li> All&#39;inizio degli studi, preparare i topi per diverse valutazioni istopatologiche, se lo si desidera. 90 minuti prima dell&#39;eutanasia, dare a ciascun topo un&#39;iniezione intraperitoneale di bromodeossiridina (BrdU, 50 μg / g peso del mouse) a una concentrazione di 6,25 μg / μL in 1x PBS. NOTA: Le scorte congelate di bromodeossiridina sciolte vengono utilizzate entro un mese dalla preparazione. </li><li> 10 minuti prima dell&#39;eutanasia, con il mouse anestetizzato, raccogliere il sangue retroorbitale (&gt; 500 μL) utilizzando tubi capillari eparinizzati e successivamente trasferirli in tubi rivestiti con EDTA di potassio tenuto in ghiaccio. </li><li> Per rimuovere polmoni e restante tessuto mammario, fare un&#39;incisione mediana con le forbici dal basso addome alla bocca per esporre la cavità toracica e peritoneali (Figura 2A), e staccare la pelle lateralmente per esporre anche i restanti right 4 ° e 5 ° mammaria ghiandole. </li><li> Accisa il residuo tessuto ghiandolare mammario e esamina iT per escludere la ricrescita tumorale primaria mediante la valutazione di un tessuto a base di paraffina (FFPE) fissato a forma di formalina a serie con la colorazione di ematossilina ed eosina (H &amp; E) ( Figura 1 supplementare ). </li><li> Per rimuovere i polmoni, aprire la parete addominale al diaframma con forbici, quindi eutanizzare l&#39;animale tagliando l&#39;aorta addominale per scaricare il sangue prima della perfusione dei polmoni ( Figura 2B -2C ). </li><li> Tagliare il diaframma lungo la gabbia toracica da un approccio addominale, assicurandosi di evitare il polmone e il cuore. Quindi esporre il torace tagliandone i lati laterali della gabbia toracica ( figura 2D ). </li><li> Usando un ago da 23 gauge su una siringa da 20 ml, perfezionare i polmoni con ~ 5,0 mL DPBS (~ 10 mL / min) attraverso il ventricolo destro del cuore fino a quando i polmoni diventano completamente bianchi ( Figura 2E -2F ). Immediatamente tagliare il cuore dalla vesse principaleCosì il sangue non ri-perfusa nel polmone. </li><li> Per i tessuti polmonari da fissare e lavorare per valutazioni istopatologiche, iniettare ~ 1,0 mL di formalina 10% a 4 ° C nel lato opposto alla trachea esposta fino ai polmoni usando un ago da 23 gauge ( Figura 2G - 2H ). Interrompere l&#39;iniezione quando i polmoni sono completamente espandibili e riempiti con fissativo ( Figura 2I ). </li><li> I lobi polmonari di accisa dalla trachea e l&#39;emersione fissano il tessuto polmonare in formalina neutra-tamponata per il successivo incorporamento di paraffina o il mezzo di congelamento OCT, secondo procedure istopatologiche standard. </li><li> Valutare quantitativamente l&#39;onere metastatico nei polmoni mediante la sequenza seriale del tessuto polmonare FFPE e valutare le sezioni del microtomo (100 μm, tredici sezioni) mediante la colorazione H &amp; E ( Figura 1B ). </li></ol>

<ol><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Res. 8, 212(2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SEER+Cancer+Statistics+Review+1975-2008%22">SEER Cancer Statistics Review 1975-2008</a>. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/</a> (2011).</li>
<li>National Comprehensive Cancer Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Breast+Cancer+%28Version+3.2014%29%22">Breast Cancer (Version 3.2014)</a>. , Accessed November 25.
 <a target="_blank" href="http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf">http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf</a> (2016).</li>
<li>Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/annonc/article/23/suppl_7/vii11/144433/Locally-recurrent-or-metastatic-breast-cancer-ESMO">Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).</li>
<li>Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK13196/">Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine</a>. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-3+links+tumor+differentiation+and+dissemination+in+a+luminal+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model.</a> Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung.</a> Nature. 436, 518-524 (2005).</li>
<li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4548055/">FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis.</a> J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Verkooijen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients%27+refusal+of+surgery+strongly+impairs+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival.</a> Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28303905">Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna dichiarazione di conflitto con i dati presentati.

Modifiche e risoluzione dei problemi: Quando il tumore sbarrato dissezione dalla parete addominale, il tumore può rimanere aderente alla parete addominale. Questo è stato osservato in &lt;5% di topi iniettati con tumore (dati non mostrati). Per i topi con tumori aderenti alla parete addominale, il topo deve essere eutanizzato in quanto la resezione è difficile senza ricrescita del tumore primario. Limitazioni del modello / tecnica:</stron...

Le donne dell&#39;America settentrionale hanno un rischio di vita pari al ~ 12% per lo sviluppo del cancro al seno 2 ; La maggioranza di questi individui avrà i tumori primari rimossi tramite chirurgia e, a seconda del sottotipo del cancro, riceverà terapia mirata, endocrina, chemioterapia e / o radioterapia nell&#39;ambiente adiuvante 3 . Esempi includono, donne con diagnosi di cancro ormonale recettore-positivo che ricevono terapie anti-estrogeno e donne con tumori HER2-positivi che ricevono terapie con targeting HER2 con radiazioni / chemioterapia, mentre non sono disponibili terapie mirate per tumori negativi triplici 3 . Nonostante i progressi in radiazioni, chemioterapia, terapie personalizzate e ormonali che integrano la resezione chirurgica, la malattia si ripete nel 30-70% delle donne diagnosticate con la malattia di stadio II o III 4 , poiché le terapie sono in gran parte inefficaci nell&#39;eradicazione della malattia metastatica negli organi distanti, Polmone, osso, bPioggia e / o fegato 5 . Ciò è particolarmente significativo in quanto quando si verifica una malattia metastatica in assenza di ricrescita tumorale primaria, ciò implica che le cellule maligne disseminate erano già probabilmente presenti negli organi secondari al momento della chirurgia definitiva. Quindi terapie in grado di sradicare o lenta crescita dei tumori metastatici sono urgentemente necessari. Mentre i modelli de novo di cancro della carcinogenesi mammaria sono stati notevolmente informativi nei meccanismi rivelatori che regolano la progressione neoplastica 1 , i modelli esistenti hanno anche diverse limitazioni. Uno di questi è il fatto che i modelli de novo transgenici sviluppano tipicamente tumori primari in molteplici ghiandole mammarie, in cui il carico tumorale primario limita la durata degli studi. Mentre la fuga di cellule tumorali primarie e la semina metastatica probabilmente si verificano all&#39;inizio della progressione neoplastica in questi modelli, il sincero sviluppo di tumori metastatici si verifica in ritardo eN il modello del mouse e lo sfondo del ceppo, è spesso parzialmente penetrante 1 . Ciò limita ulteriormente l&#39;utilità dei modelli de novo per la scoperta di molecole che regolano la metastasi negli organi secondari e per la valutazione dell&#39;efficacia preclinica dei terapeutici nell&#39;ambiente adiuvante. Per eludere queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello de novo autochthonous di metastasi del carcinoma mammario ai polmoni. Le femmine transgeniche parentali ( ovvero MMTV-PyMT sullo sfondo del ceppo FVB / n per gli studi qui descritti) che portano tumori mammari di tarda fase de novo sono invecchiati a ~ 100 giorni 6 , a quel punto i loro tumori primari sono resettati chirurgicamente e dissociati enzimaticamente in Sospensioni singole cellule. Le sospensioni (1 x 10 6 cellule) sono a loro volta esplorate ortotropicamente in topi femmine singenici riceventi di 6-7 settimane, dove tumori mammari primari singoli si sviluppano in un periodo di 38-60 giorni ( 3), topi riceventi sono anestetizzati e tumori primari sono chirurgicamente resecati tale che la ricrescita del tumore al sito chirurgico è minimizzato, coerente con la chirurgia nelle donne (figura complementare 1). Sullo sfondo del ceppo FVB / n, i topi sviluppano foci metastatiche rilevabili istologicamente nei polmoni con 45% di penetranza per ~ 115 giorni dopo la chirurgia ( Figura 1B ). Con questa lunga latenza di crescita tumorale metastatica, il modello è posizionato in modo univoco per la consegna di terapie adiuvante e per chiarire e valutare la biologia sottostante che influenza la progressione metastatica dopo la rimozione chirurgica dei tumori primari.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Prescrizione</td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Flacone Pyrex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Bio&nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 &; m filtro in nylon&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita ridotto Matrigel</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Preparato di membrana basale solubilizzata a ridotto fattore di crescita estratto dal sarcoma del topo di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)</td></tr><tr><td>Poli(vinilpirrolidone)... Complesso di iodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0,3 mL siringa da insulina</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Kit cauterizzatore per piccoli vasi</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Clip per ferite</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di clip per ferite AutoClip&nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di rimozione della clip per ferite AutoClip&nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeossiuridina</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari eparinizzati&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microtainer con EDTA dipotassico&nbsp;</td><td>Siringa BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL&nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-congelamento medio&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalina, tamponata, 10% (tampone fosfato)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>ago da 23 g</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n topo</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di de novo metastasi del cancro del mammario

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Un aspetto limitante del tasso dei modelli murini transgenici di adenocarcinoma mammario è che il carico tumorale primario nel tessuto mammario definisce tipicamente gli endpoint dello studio. Pertanto, gli studi incentrati sul chiarimento dei meccanismi delle metastasi de novo in stadio avanzato sono compromessi, così come gli studi che esaminano l'efficacia delle terapie antitumorali mirate ai mediatori delle metastasi nel contesto adiuvante. Numerosi modelli murini di carcinoma mammario sono stati sviluppati attraverso l'espressione mirata di oncoproteine dominanti alle cellule epiteliali mammarie, producendo modelli che imitano in modo variabile i sottotipi di carcinoma mammario istopatologico e definito dal trascrittoma comuni nelle donne1. Mentre molto è stato appreso riguardo alla biologia della cancerogenesi mammaria con questi modelli, la loro utilità nell'identificare le molecole che regolano la crescita delle metastasi in fase avanzata è compromessa poiché i topi vengono tipicamente soppressi in momenti precedenti a causa del significativo carico tumorale primario. Inoltre, poiché una percentuale significativa di donne con diagnosi di carcinoma mammario riceve una terapia adiuvante dopo la resezione chirurgica dei tumori primari e prima della presenza di malattia metastatica rilevabile, sono urgentemente necessari modelli preclinici di metastasi de novo come piattaforme per valutare nuove terapie volte a colpire i focolai metastatici. Per affrontare queste carenze, abbiamo sviluppato un modello murino di metastasi del cancro mammario de novo, in cui i tumori mammari primari vengono resecati chirurgicamente e i focolai metastatici si sviluppano successivamente in un periodo post-operatorio di 115 giorni. Questa lunga latenza fornisce un modello trattabile per identificare regolatori funzionalmente significativi della progressione metastatica nei topi privi di tumore primario, nonché un modello per valutare l'efficacia terapeutica preclinica di agenti volti a bloccare molecole funzionalmente significative che aiutano la sopravvivenza e la crescita del tumore metastatico.

Più del 75% dei topi riceventi che ricevono 1 x 10 6 cellule da tumori mammari primari derivati ​​da topi MMTV-PyMT, sviluppano singoli adenocarcinomi mammari che vanno da 172 a 450 mm 3 entro 38-60 giorni (dati non mostrati). I topi ammessi alla randomizzazione sono quindi iscritti in gruppi di studio dopo la resezione chirurgica dei tumori primari come mostrato ( Figura 1C ). La ricrescita tumorale primaria è stata identificata in men...

Mancano modelli pre-clinici che valutano la terapia adiuvante che mirano alla metastasi del cancro al seno. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un modello murino di metastasi adenocarcinomi mammarie polmonari de novo , in cui le terapie somministrate nell&#39;ambiente adiuvante (resezione chirurgica postale dei tumori primari) possono essere valutate per efficacia nell&#39;effetto delle metastasi polmonari precedentemente seminate.

Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di De Novo Metastasi del cancro del mammario

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Abbiamo sviluppato un nuovo modello murino di metastasi de novo del cancro mammario che imita da vicino il decorso del carcinoma mammario umano, fornendo una piattaforma preclinica per valutare la biologia, la progressione metastatica sottostante della malattia e l'efficacia delle terapie somministrate nel contesto adiuvante. Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Oregon Health and Science University. Il nostro modello murino è stato stabilito raccogliendo tumori primari enzimaticamente dissociati da topi transgenici di 100 giorni con virus del tumore mammario di 100 giorni polioma medio T o topi MMTV-PyMT.Una volta da 10 al sesto tumore vengono iniettate ortotopicamente in topi femmine riceventi singenici e i tumori primari si sviluppano in un periodo da 38 a 60 giorni. I topi portatori di tumori da 170 a 450 millimetri cubi vengono arruolati per la resezione chirurgica del tumore primario. L'analisi a 115 giorni dopo l'intervento ha portato a topi con focolai metastatici istologicamente rilevabili nei polmoni con penetranza del 45%.Questo video mostra la resezione chirurgica del tumore mammario primario, una componente cruciale del modello murino preclinico. Ai topi viene somministrato isoflurano al 2% e l'intervento chirurgico può iniziare una volta che il riflesso di pizzicamento del piede è assente. Spruzzare la pelle sovrastante il tumore primario con etanolo al 70%.La betadina viene quindi applicata sull'area chirurgica iniziando dalla pelle sovrastante il tumore, seguita dall'area circostante il tumore primario utilizzando un batuffolo di cotone sterile. Utilizzando le forbici a punta smussata, viene praticata un'incisione iniziale nella caudale mediale della pelle fino al tumore primario. L'incisione è estesa in una direzione superiore mediale al tumore primario.Identificare e cauterizzare i potenziali vasi che alimentano il tumore dalla pelle sovrastante. Se si verifica sanguinamento, è necessario eseguire un'ulteriore cauterizzazione. Quando si esegue un'incisione cutanea laterale inferiore al tumore primario, assicurarsi di evitare di tagliare la ghiandola mammaria sottostante poiché potrebbero essere presenti vasi.L'incisione cutanea viene quindi estesa circonferenzialmente attorno al tumore primario. Le aderenze sottili nella ghiandola mammaria mediale al tumore vengono quindi sezionate con cura, separando il tumore dalla parete addominale. I vasi sanguigni possono essere presenti all'interno di queste aderenze.Cauterizzare tutti i vasi identificati all'interno delle aderenze prima del taglio. Le frecce indicano la quarta e la quinta ghiandola mammaria destra, mostrate sopra e sotto il tumore. La quinta ghiandola mammaria viene quindi cauterizzata e asportata in quanto può contenere piccoli vasi difficili da visualizzare.Dopo che il tumore è stato separato dalla parete addominale, è possibile identificare i vasi più grandi. Il vaso che attraversa la quarta ghiandola mammaria è indicato dalla freccia in alto. L'arteria femorale sottostante è indicata dalla freccia centrale.E il grande vaso che alimenta il tumore tra la quarta e la quinta ghiandola mammaria è indicato dalla freccia in basso. Viene quindi eseguita la cauterizzazione lungo il grande vaso che corre tra la quarta e la quinta ghiandola mammaria, assicurandosi di evitare la cauterizzazione dell'arteria femorale sottostante sulla gamba. Dopo che la cauterizzazione del vaso grande è completa, tagliare il vaso fino alla quarta ghiandola mammaria.Localizzare e cauterizzare il secondo grande vaso che attraversa la quarta ghiandola mammaria. Tagliare il vaso senza tagliare l'intera ghiandola mammaria in modo che, in caso di sanguinamento, il vaso possa essere facilmente identificato e ulteriormente cauterizzato. Il resto della quarta ghiandola mammaria viene quindi asportato.La pelle sovrastante viene quindi chiusa con clip per ferite utilizzando un applicatore di clip per ferite AutoClip. Assicurarsi che la pelle sovrastante sia sufficientemente separata dalla parete addominale per evitare di tagliare il muscolo sottostante. Unisci i bordi laterale e mediale della ferita, sollevando la pelle in direzione anteriore per applicare la clip della ferita.Assicurarsi di evitare di tagliare il tratto urogenitale o il muscolo sottostante della gamba destra. La mobilizzazione della gamba destra rimuovendo il nastro adesivo può consentire un'applicazione più facile delle clip della ferita. Le clip della ferita devono essere rimosse 10 giorni dopo l'intervento chirurgico.La resezione chirurgica del tumore primario mostrato in questo video consente alle cellule tumorali disseminate di svilupparsi nei focolai metastatici nel polmone 115 giorni dopo l'intervento chirurgico, dove viene mostrato un rappresentante di ciascuno nell'immagine di un focolaio metastatico. Dato che un'ampia percentuale di donne con diagnosi di cancro al seno subisce la rimozione chirurgica del tumore e può soccombere alla malattia metastatica dopo l'intervento chirurgico, abbiamo stabilito un modello murino preclinico che imita il decorso della malattia e del trattamento del paziente. Registrando la metodologia per la rimozione chirurgica del tumore mammario primario, questo componente chiave del nostro modello murino di metastasi del cancro mammario de novo può essere facilmente riprodotto al fine di valutare la biologia della malattia metastatica dopo la resezione del tumore e l'efficacia della terapia adiuvante.

surgical-procedures-methodology-for-preclinical-murine-model-de-novo

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Un seno cancro al cervello metastasi modello del mouse viene stabilito con ecografia guidata iniezione intracardiaca delle cellule MDA-MB231/Br-GFP. Sviluppo delle metastasi intracraniche multifocali è stato monitorato longitudinalmente utilizzando ad alta risoluzione di 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging guidata intracardiaca iniezione di sviluppare un modello murino di Breast Cancer metastasi cerebrali Seguito da longitudinale MRI

Attivazione di mutazioni latenti con adenovirus-Cre nei risultati mammarie sistema duttale in un carcinoma mammario metastatico clinicamente rilevante. Incorporazione di un promotore YFP consente di tenere traccia di cellule tumorali metastatiche distali. Questo modello è utile per studiare metastasi latente, immunità anti-tumorale, e per la progettazione di nuove immunoterapie per trattare il cancro al seno.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Un preclinico, modello murino di metastasi epatiche effettuato tramite una tecnica di iniezione hemispleen.

Un preclinici Modello murino di metastasi epatiche

L'obiettivo di questo protocollo è studiare la tumorigenesi mammaria. Con questa tecnica, i tumori mammari di topo vengono rimossi e le cellule primarie vengono preparate dai tumori. È incluso un protocollo di estrazione polmonare per lo studio delle metastasi polmonari. Inoltre, è incluso un altro protocollo per l'analisi dei fibroblasti embrionali di topo dall'embrione di topo.

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

Per chiarire il processo a più fasi di diffusione peritoneale del carcinoma ovarico, questo studio presenta un modello sperimentale murino di sviluppo del tumore originale e metastasi peritoneali tramite inoculazione ortotopico con queste cellule tumorali.

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Vi presentiamo un modello murino ortotopico di cancro del seno e mastectomia radicale modello con tecnologia di bioluminescenza per quantificare il carico del tumore per simulare la progressione del cancro al seno umano.

Generazione di un modello di cancro al seno metastatico murino ortotopico ed eseguendo murino mastectomia radicale

In questo protocollo, descriviamo un modello murino di resezione chirurgica incompleta del sarcoma dei tessuti molli per testare (neo)le terapie adiuvanti.

Un modello di topo di Sarcoma di tessuto molle incompleto resected per test (Neo)adiuvante Terapie

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall'incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l'iniezione di tumore intracranico con l'analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.

Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Scopri la metodologia chirurgica per un modello murino di metastasi de novo del cancro mammario. Questo protocollo consente di studiare la progressione metastatica e testare terapie adiuvanti dopo la resezione del tumore primario.

Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di De Novo Metastasi del cancro del mammario

Esplora altri video