Inducibile LAP-tagged linee cellulari stabili per indagare la funzione delle proteine, Spatiotemporal Localizzazione e reti di interazione proteina

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare la localizzazione inducibile e la purificazione dell'affinità, o linee cellulari stabili con tag LAP, per studiare la funzione delle proteine, la localizzazione spazio-temporale e le reti di interazione proteica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biologia molecolare e cellulare relative alla funzione delle proteine, alla localizzazione del ciclo cellulare delle proteine sotto zero e alle interazioni proteiche. Il vantaggio principale di questo metodo è che è suscettibile di analisi ad alto rendimento di gruppi di proteine e può essere utilizzato per sezionare le componenti proteiche dei percorsi biologici.

Per iniziare questa procedura, clonare il frame di lettura aperto del gene di interesse nel vettore marcato LAP e trasfettarlo in cellule HEK293 come descritto nel protocollo di testo. Un giorno dopo la trasfezione, sostituire il supporto Tet DMEM/F12 meno con un nuovo supporto. Due giorni dopo la trasfezione, dividere le cellule al 25% di confluenza.

Lasciare che le celle si attacchino per circa cinque ore. Quindi, aggiungere il terreno meno Tet DMEM/F12 contenente igromicina alla concentrazione predeterminata. Per le cellule HEK293, utilizzare 100 microgrammi per millilitro di igromicina.

Sostituire il terreno secondo necessità fino a quando non compaiono focolai cellulari distinti che assomigliano a macchie opache contro la lastra trasparente. Aggiungere 20 microlitri di tripsina sopra ogni focolaio cellulare e convogliarlo su e giù due volte con un puntale per pipetta da 200 microlitri. Trasferire le cellule in una piastra a 24 pozzetti ed espandere le cellule mediante la crescita continua in terreni contenenti igromicina meno Tet DMEM/F12.

Espandi la linea cellulare LAP-taged convalidata per l'isolamento di complessi proteici con purificazione di affinità tandem, o TAP. A tal fine, è necessario trasferire continuamente tutte le celle HEK293 in piastre più grandi e/o bottiglie a rullo, e meno i terreni Tet DMEM/F12 a 37 gradi Celsius e il cinque percento di anidride carbonica. Per le linee cellulari inducibili Tet/Dox, indurre le cellule per 10-15 ore aggiungendo una concentrazione di 0,2 microgrammi per millilitro di Tet/Dox quando le cellule raggiungono circa il 70% di confluenza.

Raccogliere le cellule mediante agitazione o tripsinizzazione. Quindi, pellettali a 875 volte g per cinque-10 minuti. Per accoppiare l'anticorpo anti-GFP alle perle di proteina A, equilibrare 160 microlitri di perle di proteina A in volume confezionato con PBST in una provetta da 1,5 millilitri.

Lavare le perline tre volte con 1 millilitro di PBST. Dopo ogni fase di lavaggio durante questa procedura, le perle vengono centrifugate a 5000 volte g per 10 secondi e il surnatante viene rimosso. Dopo aver risospeso le perle in 500 microlitri di PBST, aggiungere 80 microgrammi di anticorpo rapido anti-GFP purificato per affinità a ciascuna provetta, contenente 160 microlitri di perline.

Mescolare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le perle due volte con un millilitro di PBST, quindi lavare le perle due volte con un millilitro di borato di sodio 0,2 molari, pH Dopo il lavaggio finale, aggiungere 900 microlitri di tampone borato di sodio, per portare il volume finale a un millilitro. Quindi, aggiungere 100 microlitri di DMP 220 molari alla sospensione della perla, per una concentrazione finale di 20 millimolari.

Ruotare delicatamente i tubi a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione con DMP, lavare le perle una volta con un millilitro di etanolammina 0,2 molare, cloruro di sodio 0,2 molare pH 8,5, per inattivare il reticolante residuo. Quindi, risospendere le perle in un millilitro dello stesso tampone e ruotarle per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo aver pellettato le perline, rimetterle in sospensione in altri 500 microlitri di tampone. Le perle preparate sono stabili per diversi mesi a quattro gradi Celsius. Per preparare i lisati cellulari, risospendere 500 microlitri di volume cellulare impacchettato in 2,5 millilitri di LAP 300, con 0,5 millimolari di DTT e inibitori della proteasi.

Aggiungere 90 microlitri di fenossipolietossietanolo nonil al 10% e mescolare per inversione. Mettere il composto sul ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare a 21.000 volte g per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, raccogliere questo surnatante a bassa velocità e mettere da parte un campione da 10 microlitri per l'analisi del gel. Dopo aver trasferito il surnatante a bassa velocità in un tubo TLA 100.3, centrifugare a 100.000 volte g per un'ora a quattro gradi Celsius. Raccogliere questo surnatante ad alta velocità in una provetta e metterlo su ghiaccio, riservando un campione da 10 microlitri per l'analisi del gel.

Per la prima cattura dell'affinità attraverso il legame con le perle anti-GFP, pre-eluire le perle accoppiate all'anticorpo lavandole tre volte con un millilitro di tampone di eluizione per rimuovere gli anticorpi disaccoppiati e ridurre il fondo. Esegui questa operazione rapidamente. Non lasciare le perline sotto sale per molto tempo.

Quindi, lavare le perle tre volte con un millilitro di LAP 200 N.Quindi, mescolare l'estratto di surnatante ad alta velocità con le perle di anticorpi per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo aver centrifugato l'estratto a 21.000 volte g per 10 minuti, riservare un campione da 10 microlitri del surnatante per l'analisi su gel. Eseguire tre lavaggi rapidi delle perle con un millilitro di LAP 200 N, contenente 0,5 millimolari di DTT e inibitori della proteasi.

Utilizzare lo stesso tampone per lavare le perle altre due volte con un tempo di incubazione di cinque minuti per ogni lavaggio. Quindi, lavare rapidamente le perle altre due volte con 1 millilitro di LAP 200 N contenente 0,5 millimolari di DTT e senza inibitori della proteasi, prima di aggiungere la proteasi del virus dell'incisione del tabacco, o TEV. Aggiungere 10 microgrammi di proteasi TEV in un millilitro di LAP 200 N alle perle e ruotare le provette a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, pellettare le perline e trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Sciacquare le perle due volte con 160 microlitri di LAP 200 N, contenente 0,5 millimolari di DTT e inibitori della proteasi per rimuovere eventuali proteine residue. Per la seconda cattura di affinità attraverso il legame con l'agarosio della proteina S, lavare tre volte un tubo di 80 microlitri di liquame di agarosio di proteina S con un millilitro di LAP 200 N.Aggiungere il surnatante eluito TEV alle perle di proteina S e farle oscillare per tre ore a quattro gradi Celsius.

Dopo aver pellettato le perline, lavarle tre volte con un millilitro di LAP 200 N contenente 0,5 millimolari di DTT e inibitori della proteasi. Quindi, lavare le perline due volte con un millilitro di LAP 100. Eluire le proteine dell'agarosio della proteina S aggiungendo 50 microlitri di tampone campione Laemmli 4x e riscaldando a 97 gradi Celsius per 10 minuti.

Per identificare le proteine interagenti mediante analisi di spettrometria di massa, testare la qualità della purificazione analizzando i campioni raccolti mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di poliacrilammide. Macchia d'argento il gel risultante. Inoltre, tamponare gli eluati con l'immunobenzine e sondare con anticorpi anti-GFP per garantire che la purificazione con tag LAP funzionasse.

Per identificare le specie co-purificanti stechiometriche e substechiometriche, prelevare il campione di eluizione finale e separarlo mediante SDS-PAGE. Colorare il gel con una colorazione proteica compatibile con la spettrometria di massa. Asportare le bande più prominenti nel gel e lo spazio tra di esse per elaborare le bande separatamente per l'analisi mediante spettrometria di massa.

Qui è mostrata un'analisi rappresentativa del western blot dei campioni proteici provenienti da cellule LAP-Tau HEK293 non indotte e indotte da Dox. Le cellule vengono sondate con anticorpi anti-Tubulina per rilevare il controllo del carico di Tubulina e sondate con anti-GFP per rilevare la proteina Tau marcata con LAP. Si noti che LAP-Tau è espresso solo quando le cellule sono indotte con Dox.

Le cellule mitotiche che esprimono LAP-Tau sono state fissate e co-colorate per DNA e Tubulina con anticorpi anti-Tubulina e la localizzazione subcellulare di LAP-Tau è stata analizzata mediante microscopia a fluorescenza. Si noti che LAP-Tau si localizza al fuso mitotico e ai poli del fuso durante la mitosi. Qui è mostrato un gel colorato d'argento rappresentativo della purificazione LAP-Tau.

Le corsie rappresentano il peso molecolare, i lisati eliminati e gli eluati finali. I campioni sono stati analizzati su un gel SDS-PAGE al 4-20% e il gel è stato colorato con argento per visualizzare le proteine purificate. Si noti che una banda corrispondente a LAP-Tau è contrassegnata da un asterisco e si possono vedere diverse altre bande corrispondenti a proteine co-purificanti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare linee cellulari stabili inducibili con tag LAP e come eseguire purificazioni biochimiche di proteine con tag LAP per l'analisi proteomica e l'identificazione di reti di interazione proteica.