Quantificazione istologica di cronica Myocardial Infarto in Rats

L'obiettivo generale di questa procedura istologica è quello di eseguire la quantificazione morfometrica dell'indice di espansione dell'infarto e dei parametri strutturali del cuore utilizzando un modello di ratto con infarto del miocardio al fine di valutare le dimensioni dell'infarto e il rimodellamento del ventricolo sinistro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo cardiaco come l'effetto della terapia rigenerativa dopo l'infarto del miocardio o nuove strategie volte a ridurre l'espansione dell'infarto. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso del campionamento sistematico del cuore di ratto prelevato per valutare accuratamente le dimensioni dell'infarto e tenere conto dei cambiamenti del ventricolo sinistro durante il rimodellamento.

Seguire questo metodo può fornire informazioni sulle dimensioni dell'infarto nel modello di infarto miocardico cronico di ratto. Può anche essere applicato a topi o altri modelli ischemici, come l'infarto miocardico acuto o la riperfusione ischemica. Per iniziare questa procedura, eseguire una sternotomia su un animale con infarto del miocardio sotto anestesia.

Praticare un'incisione nella pelle e nei muscoli lungo lo sterno con le forbici chirurgiche. Quindi, taglia le costole a sinistra e a destra per rimuovere il petto. Successivamente, rimuovere le aderenze rimaste dopo la legatura LAD.

Tagliare l'aorta e rimuovere il cuore, quindi posizionare il tessuto in PBS con un molare di cloruro di potassio per meno di un minuto prima di lavarlo con PBS. Al fine di preservare il tessuto, la PBS all'interno dei ventricoli deve essere accuratamente rimossa. Successivamente, trasferire il cuore infartuato in una matrice acrilica di cuore di ratto e posizionarlo longitudinalmente.

Quindi mantenerlo a meno 20 gradi Celsius per un'ora. Per un campionamento sistematico dopo un'ora, tagliare il cuore direttamente nella matrice utilizzando una lama di rasoio. Assicurati che ogni sezione abbia uno spessore di due millimetri.

Successivamente, eseguire la colorazione TTC incubando le sezioni in TTC all'1% per 15 minuti a 37 gradi Celsius, quindi incubarle in PFA al 4% per 20-60 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, posiziona le sezioni tra due lastre di vetro con distanziatori da due millimetri e scatta foto con un microscopio stereologico accoppiato a una fotocamera con un ingrandimento 15x. È stata eseguita una procedura di colorazione TTC per visualizzare l'area dell'infarto, che appare in bianco, e il miocardio sano, che appare in rosso.

Per un infarto miocardico di grandi dimensioni, sono stati osservati infarti transmurali dall'apice alla base. Gli infarti più piccoli presentavano tessuto infartuato bianco visibile dall'apice alla parte centrale del cuore. Per piccoli infarti non transmurali, il tessuto fibrotico è stato osservato solo su una o due sezioni dall'apice.

Per congelare le sezioni, posizionare ciascuna sezione in uno stampo di plastica con mezzo di montaggio per criotomia e posizionare l'apice verso il basso nello stampo. Congelare i blocchi con vapori di 2-metilbutano sotto raffreddamento ad azoto liquido per 10-15 minuti. Dopodiché, conservare i fazzoletti a meno 80 gradi Celsius.

Per la paraffinazione, posizionare ogni sezione in una cassetta di inclusione con l'apice rivolto verso il basso, quindi mantenere le cassette in PFA al 4% per 24 ore. Successivamente, mettili in un processore di tessuti per una notte. Una volta completata la lavorazione, crea dei blocchi incorporando ogni sezione del cuore nella paraffina.

In questa procedura, preparare sezioni di tessuto spesse 5 micron dai blocchi di paraffina con un microtomo manuale. Quindi, colorare un vetrino da ogni sezione del cuore per ogni ratto con la colorazione tricromica di Masson-Goldner. Per le sezioni di paraffina, sciogliere i tessuti a 60 gradi Celsius in forno.

Sotto una cappa aspirante, deparaffinarli in xilolo due volte per dieci minuti ciascuno. Quindi, reidratali in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 70% e poi acqua distillata per tre minuti ciascuno. Per le sezioni deparaffinizzate e per le sezioni criogeniche, fissarle in soluzione di Bouin per una notte.

La mattina seguente, sciacquateli con acqua corrente del rubinetto per 10-15 minuti, quindi risciacquateli nuovamente con acqua distillata. La fissazione con Bouin è il passaggio più importante per garantire una splendida colorazione Goldner. Incubarli nell'ematossilina di Mayer per tre minuti.

Dopo tre minuti, togliete i vetrini e lasciateli in acqua distillata per cinque minuti. Successivamente, incubarli in ponceau acid fucsin per cinque minuti prima di risciacquare con acido acetico all'1% per un minuto. Successivamente, incubare le sezioni in acido fosfomolibdico arancio g per un minuto e poi sciacquarle in acido acetico all'1% per un minuto.

Incubare in colorante verde chiaro per dieci minuti e poi risciacquare con acido acetico all'1% per un minuto. Infine, disidratare le sezioni in etanolo al 70% per 30 secondi, etanolo al 95% per 30 secondi ed etanolo al 100% per cinque minuti in sequenza. Applicare una goccia di terreno di montaggio resinoso sulle sezioni di tessuto, coprirle con vetrini coprioggetti e metterle ad asciugare.

In questa fase, acquisire un'immagine da ogni vetrino utilizzando uno stereomicroscopio accoppiato a una fotocamera con ingrandimento 15x. Fotografa un righello con le stesse impostazioni. Sezioni sottili di cinque micron da ogni fetta di cuore sono state tagliate e colorate con tricromia di Masson-Goldner.

I tessuti sani apparivano in rosso e il tessuto connettivo in verde. Successivamente, utilizzare il software di analisi delle immagini per misurare lo spessore della cicatrice al centro dell'infarto, lo spessore del setto, l'area della cavità del ventricolo sinistro, l'area dell'infarto e l'area del tessuto ventricolare sinistro. Per fare ciò, imposta la scala con l'immagine del righello.

Fare clic su Misure e selezionare Imposta fattore di conversione. Disegna una linea sulla barra di calibrazione. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Termina calibrazione.

Prendere nota del valore della barra e quindi fare clic su OK. Utilizzare lo strumento segmento multiplo per selezionare il LV punto per punto, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse su copia e incolla in un punto qualsiasi. Successivamente, misurare lo spessore della cicatrice e del setto utilizzando lo strumento di misurazione del segmento singolo. Quindi, rileva automaticamente la cavità ventricolare, l'infarto e le aree ventricolari utilizzando lo strumento di misurazione automatica dell'area in modalità RGB.

Attiva solo i bordi e contigui in modalità RGB. Infine, fai clic all'interno dell'area di interesse per rilevarla. Successivamente, calcola la dimensione dell'infarto come il rapporto tra l'area dell'infarto e l'area del ventricolo sinistro.

Quindi, calcola l'indice di espansione utilizzando questa formula. Infine, calcola una media per ogni cuore utilizzando la formula mostrata. L'indice di dilatazione calcolato dalla colorazione di Goldner è un buon indice per valutare lo sviluppo dell'infarto.

Come mostrato in figura, è correlato con la dimensione dell'infarto espressa come percentuale del ventricolo sinistro e con la frazione di eiezione misurata mediante ecocardiografia. Sui grafici sono rappresentati la regressione lineare e gli intervalli di confidenza al 95%. L'indice di espansione dell'infarto è stato calcolato come descritto nella formula qui.

L'intera area del ventricolo sinistro è stata misurata come cavità ventricolare sinistra combinata e area del tessuto ventricolare sinistro. La percentuale dell'infarto è stata calcolata come mostrato. La funzione è stata valutata a sei settimane dopo la legatura LAD utilizzando un'ecocardiografia ad alta risoluzione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un campionamento sistematico del cuore e di come valutare le dimensioni dell'infarto sulla base di un'analisi delle immagini delle sezioni di colorazione.