Name: Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri come etichettare xenotrapianti derivati da pazienti con reporter tracciabili per studiare la crescita tumorale e le metastasi del cancro al seno. Questo metodo consente il monitoraggio in vivo senza analisi istologica estensiva.

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Gli autori ringraziano il Dr. Darrel Kotton della Boston University per aver fornito il vettore pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W e i protocolli per la produzione di lentivirali ad alto titolo utilizzati in questi studi. Questo lavoro è stato finanziato da DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) e R01 CA140985 (CAS). La sovvenzione dell'NCI P30CA046934 Center ha sostenuto l'imaging in vivo e i nuclei di coltura tissutale presso l'Università del Colorado AMC.

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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renewable+tissue+resource+of+phenotypically+stable%2C+biologically+and+ethnically+diverse%2C+patient-derived+human+breast+cancer+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models.</a> Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).</li>
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<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).</li>
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<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+of+human+breast+cancer%3A+protocols+for+in+vitro+and+in+vivo+applications+in+tumor+biology+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2013).</li>
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<li>Indumathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+depletion+of+stromal+vascular+fractions+isolated+from+human+adipose+tissue%3A+a+novel+approach+towards+cell+enrichment+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology.</a> Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).</li>
<li>Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer+requires+identification+and+correction+of+a+critical+cell+lineage-dependent+transduction+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias.</a> Nat Commun. 6, 6927(2015).</li>
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<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+TGFbeta+Signaling+in+Mouse+Models+of+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis.</a> Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).</li>
<li>Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+human+breast+cancer+cell+lines+that+permit+rapid+and+sensitive+in+vivo+detection+of+mammary+tumors+and+multiple+metastases+in+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice.</a> Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Passaggi critici all'interno del protocollo:
L'uso di particelle lentivirali ad alto titolo (>108 TU/ml) è un passo fondamentale per il successo di questo protocollo, in quanto consente un attento controllo della composizione del terreno durante la trasduzione in vitro . Mentre sono stati ben descritti diversi metodi per la produzione di particelle virali ad alto titolo18,19; Questo protocollo utilizza particelle lentivirali prodotte come descrit...

Lo sviluppo di xenotrapianti derivati da pazienti tumorali (PDXs), in cui i campioni di tumore chirurgicamente asportati vengono innestati direttamente in topi immuno-compromessi, offre diversi vantaggi rispetto ai modelli di xenotrapianto di cellule-linea standard e rappresenta un importante passo avanti nella ricerca sul cancro 1,2. PDXs possono essere mantenuti e ampliati con passaggi successivi con minima alterazione delle caratteristiche genetiche e biologiche del tumore coltivate nel primo passaggio; e riflettere più accuratamente l&#39;eterogeneità del tumore di xenotrapianti derivate da linee cellulari tumorali umane 3-8. Questi modelli sono ora ampiamente utilizzate come piattaforma per la personalizzazione cancro terapeutica 9,10, come piattaforma preclinico nello sviluppo di farmaci 6,11 e come uno strumento sperimentale per lo studio della biologia del cancro 4,12. La maggior parte dei PDXs vengono impiantati e propagate per via sottocutanea, che permette di tenerne la misurazione della crescita tumorale nel tempo utilizzando pinze. però, La malattia metastatica è stato più difficile da modellare con PDXs. In particolare per il cancro al seno, xenotrapianti con capacità metastatica a diversi organi sono stati descritti 3,5,13, ma la frequenza di diffusione spontanea di siti metastatici è estremamente bassa. Dove riportato, l&#39;identificazione e la quantificazione degli oneri si basa metastatico in esame istologico laboriosa degli organi bersaglio post-mortem. linee cellulari di cancro che esprimono bioluminescente (luciferasi, Luc) o fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) reporter gene sono comunemente utilizzati in modelli sperimentali di metastasi del cancro al seno a cervello, polmoni, ossa e il fegato dopo intracardiaca, la coda-venosa, intrafemoral e iniezione milza 14-16. Anche se questi modelli bypassare diffusione dei tumori primari, che sono preziosi per studiare i meccanismi di tropismo d&#39;organo e di colonizzazione metastatica. Tuttavia, le cellule derivate da tumori di pazienti primari e PDXs possono avere bassi tassi di trasfezione o trasduzione using procedure standard. Una alternativa è quella di stabilire linee cellulari derivate PDX-17 in vitro, che può essere poi etichettati utilizzando protocolli di coltura dei tessuti convenzionali. Questo approccio tuttavia, non è adatto per l&#39;etichettatura maggior PDXs, per cui linea cellulare derivazione è difficile e può modificare il fenotipo delle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per la trasduzione di cellule tumorali PDX-dissociate con vettori lentivirali adatti per l&#39;imaging in vivo. Inoltre, descriviamo metastasi sperimentale con iniezione intracardiaca delle cellule dissociate PDX luc-GFP etichettati in topi immunocompromessi. Un protocollo di base per la trasduzione di organoidi PDX-dissociate con gene reporter che esprime lentivirus è stato descritto in precedenza 18. Nel protocollo corrente si descrivono metodi aggiuntivi per arricchire per le cellule tumorali umane ed ottenere vicino efficienza di trasduzione 100%, così come l&#39;uso di PDXs etichettati per rilevare il cancro al seno sperimentalemetastasi. Questo protocollo può essere adattato per l&#39;etichettatura più tipi di cancro di PDXs con vari marcatori luminescenti e fluorescenti e la modulazione dell&#39;espressione genica (cioè, shRNA knockdown di geni di interesse).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>Anti-funghi-antibiotici</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105-500</td><td>Tampone di digestione</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Rosso Ca2+/Mg2+ libero</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex</td><td>Cultrex</td><td>3433-005-01</td><td>Estratto di matrice basamentale (BME)</td></tr><tr><td>30 &#176; Agitatore a C</td><td>NewBrunswick Scientific CO. INC</td><td>Serie 25 Agitatore</td><td></td>per incubatrici</tr><tr><td>70 &#956; m filtri</td><td>Falcon</td><td>bisturi 7352350</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>22079690</td><td></td></tr><tr><td>Disinfettante alla clorexidina</td><td>Durvet</td><td>NDC# 30798-624-35</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per lisi cellulare del sangue rosso</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Neuraminidasi</td><td>Sigma</td><td>N7885-1UN</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326+) microsfere*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-061-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit di deplezione delle cellule di lignaggio, topo*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MiniMACS&nbsp;</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mini MACS Supporto magnetico</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MS È</td> possibile utilizzare colonne <td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>MS o LS, regolare in base al numero di celle.</td></tr><tr><td>Illumatool Sistema di luce sintonizzabile</td><td>Lightools research</td><td>Vari</td><td>Per l'imaging a fluorescenza in vivo</td></tr><tr><td>Dispositivo di imaging IVIS200 xenogeno</td><td></td><td>Xenogeno Vari</td><td>Per l'imaging della luminiscenza in vivo</td></tr><tr><td>Clone di citocheratina umana MNF116 Anticorpo monoclonale</td><td>DAKO</td><td>M0821</td><td>Pan-citocheratina&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo del recettore del fattore di crescita epidermico</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4267S</td><td>EGFR</td></tr></tbody></table>

etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili reporter per crescita tumorale e metastasi studi

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

L'uso di modelli preclinici per studiare la biologia dei tumori e la risposta al trattamento è fondamentale per la ricerca sul cancro. Le linee cellulari umane di lunga data e molti modelli murini transgenici spesso non riescono a ricapitolare gli aspetti chiave delle neoplasie maligne umane. Pertanto, si stanno sviluppando modelli alternativi che rappresentano meglio l'eterogeneità dei tumori dei pazienti e delle loro metastasi. I modelli di xenotrapianto derivati da pazienti (PDX) in cui campioni tumorali resecati chirurgicamente vengono innestati in topi immunocompromessi sono diventati un'alternativa interessante in quanto possono essere trapiantati attraverso più generazioni e riflettono in modo più efficiente l'eterogeneità del tumore rispetto agli xenotrapianti derivati da linee cellulari tumorali umane. Una limitazione all'uso dei PDX è che sono difficili da trasfettare o trasdurre per introdurre reporter tracciabili o per manipolare l'espressione genica. L'attuale protocollo descrive i metodi per trasdurre cellule tumorali dissociate da PDX con un'elevata efficienza di trasduzione e l'uso di PDX marcati per modelli sperimentali di metastasi del cancro al seno. Il protocollo dimostra anche l'uso di PDX marcate in modelli sperimentali di metastasi per studiare il processo di colonizzazione degli organi della cascata metastatica. Le metastasi in diversi organi possono essere facilmente visualizzate e quantificate utilizzando l'imaging bioluminescente in animali vivi o l'espressione di GFP durante la dissezione e negli organi asportati. Questi metodi forniscono un potente strumento per estendere l'uso di più tipi di PDX alla ricerca sulle metastasi.

Questo metodo descrive la trasduzione di cellule tumorali del seno dissociate da PDX mediante vettori lentivirali ad alto titolo pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro e pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Questi vettori esprimono un marcatore fluorescente che consente di stimare l'efficienza di trasduzione in vitro, già a partire da 24 ore dopo l'infezione (Figura 1a). Per la maggior parte dei PDX, l'espressione di GFP sarà ritardata fino a 72 ore dopo l'infezione (Figu...

Descriviamo un metodo per l'etichettatura stabile di xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) con particelle lentivirali che esprimono proteina fluorescente verde e reporter di luciferasi. Questo metodo consente di monitorare la crescita dei PDX nel sito primario, nonché di rilevare metastasi spontanee e sperimentali utilizzando sistemi di imaging in vivo.

Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di trasduzione è introdurre stabilmente geni reporter in xenotrapianti derivati da pazienti, o PDX, al fine di facilitarne l'utilizzo in modelli sperimentali e di metastasi spontanea. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sul cancro, come l'entità della metastasi extracutanea originata da xenotrapianti derivati da pazienti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i PDX marcati possono essere tracciati mediante imaging in vivo, facilitando la valutazione di metastasi organizzate e specifiche senza ricorrere a un'analisi istologica estensiva post-mortem.La dimostrazione di questo protocollo sarà effettuata da Jessica Finlay-Schultz, una ricercatrice post-dottorato, che applica regolarmente questo protocollo per l'etichettatura di xenotrapianti derivati da pazienti con cancro al seno. Utilizzando una tecnica asettica, iniziare tagliando la pelle intorno al tumore con un bisturi. Successivamente, tirare la pelle con una pinza e utilizzare un bisturi pulito per staccare la pelle dal tumore.Quando il tumore è completamente esposto, utilizzare un set pulito di pinzette e bisturi per trasferire il t

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Diffuse la tomografia di fluorescenza offre un approccio relativamente a basso costo e potenzialmente ad alta dappertutto per...

Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

Il seguente video descrive una tecnica di trasduzione per marcare (xenotrapianti derivati da pazienti) le cellule tumorali PDX, che viene utilizzata per introdurre lentivirus che esprimono la proteina fluorescente verde e i reporter della luciferasi nella cellula tumorale in vitro.

Trasduzione per marcare le cellule tumorali PDX: introduzione del marcatore fluorescente che esprime lentivirus nella cellula tumorale in vitro

Questo manoscritto descrive in dettaglio un metodo utilizzato per generare xenotrapianti derivati da pazienti affetti da cancro alla prostata (PDX) da cellule tumorali circolanti (CTC). La generazione di modelli PDX da CTC fornisce un modello sperimentale alternativo per studiare il cancro alla prostata; il tumore più comunemente diagnosticato e una frequente causa di morte per cancro negli uomini.

Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Le metastasi del cancro ovarico sono caratterizzate da numerose lesioni diffuse intra-peritoneali, tali da rendere difficile un'accurata quantificazione visiva del carico tumorale.  Qui descriviamo un metodo per la quantificazione in situ ed ex vivo del carico tumorale metastatico utilizzando cellule tumorali marcate con proteina fluorescente rossa (RFP) e imaging ottico.

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Qui descriviamo il modello e l'approccio per studiare le funzioni dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi del cancro. Per dimostrare il ruolo di queste cellule nelle metastasi, è stato utilizzato il modello singenico (4T1) del carcinoma mammario in combinazione con la deplezione dei macrofagi alveolari con liposomi di clodronato.

Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di preclinici in vivo della metastasi del cancro. Si basa su un reporter del radionuclide-fluorescenza combinando lo symporter dello ioduro di sodio, rilevato da non-invasiva [18F] tetrafluoroborate-PET e una proteina fluorescente per semplificata ex vivo conferma. Il metodo è applicabile per preclinici in vivo delle cellule di rilevamento di là di biologia del tumore.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.

L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

Questo lavoro preconfigura un protocollo avanzato per valutare con precisione il carico del tumore rilevando segnali di proteina fluorescente e bioluminescenza verdi, nonché l'integrazione della tecnica di rilevamento molecolare quantitativo.

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Qui presentiamo un protocollo per testare l'efficacia delle terapie mirate selezionate in base alla trucco genomico di un tumore. Il protocollo descrive l'identificazione e la convalida dei riarrangiamenti strutturali del DNA, l'innesto dei tumori dei pazienti nei topi e il test delle risposte ai farmaci corrispondenti.

Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Questo protocollo descrive un metodo efficiente e non chirurgico per l'impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario nei topi. La tecnica prevede la dissociazione enzimatica del tumore seguita da un'iniezione diretta nei cuscinetti adiposi mammari, consentendo un impianto ad alto rendimento. La convalida completa garantisce la fedeltà del modello, facilitando studi rigorosi su vari sottotipi di cancro al seno.

Dissociazione ad alto rendimento e impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario

Scopri come etichettare xenotrapianti derivati da pazienti con reporter tracciabili per studiare la crescita tumorale e le metastasi del cancro al seno. Questo metodo consente il monitoraggio in vivo senza analisi istologica estensiva.

Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi (Video) | JoVE Journal

Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi

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