Uno studio comparato Drug metodi di consegna mirate per l'orecchio interno mouse: Bullostomy Versus Iniezione transtimpanica

L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di descrivere e confrontare due approcci micro-chirurgici per la somministrazione locale di farmaci all'orecchio interno in termini di impatto sui parametri uditivi e sui marcatori di citoarchitettura cocleare. Queste procedure possono aiutarci a rispondere a domande chiave in campo uditivo, in particolare nello sviluppo di studi pro-chimici sugli animali. Il vantaggio principale di queste tecniche è che sono minimamente invasive.

E questo permette alla sostanza di raggiungere didatticamente l'orecchio interno. L'applicazione di queste tecniche si estende alla terapia della perdita dell'udito, perché le sue procedure microchirurgiche sono adatte per la somministrazione a secco nell'orecchio medio. La dimostrazione pacifica di questo metodo è fondamentale, perché la bullostomia e l'iniezione transtimpanica sono difficili da imparare e richiedono una conoscenza anatomica e una formazione chirurgica.

Per iniziare, posizionare un tappo per le orecchie nell'orecchio controlaterale di un topo anestetizzato per ottenere risposte prevalentemente mono-aurali. Quindi, posizionare il mouse in posizione prona su un termoforo all'interno di una camera di attenuazione del suono. Posizionare l'elettrodo ad ago sottocutaneo positivo in acciaio inossidabile nel cuoio capelluto tra le orecchie sopra il vertice del cranio.

Posizionare l'elettrodo di riferimento nella regione della parotide sotto il padiglione auricolare. Quindi posizionare l'elettrodo di terra nella regione posteriore, della coda o degli arti posteriori. Controllare l'impedenza elettrica negli elettrodi positivo e negativo.

Assicurarsi che l'impedenza sia inferiore a tre kiloohm. Posizionare l'altoparlante preriempito a una distanza fissa di fronte all'orecchio selezionato, con il centro dell'altoparlante allineato con il canale uditivo esterno. Assicurarsi che non vi siano ostacoli tra l'altoparlante e l'orecchio e che il padiglione auricolare sia completamente aperto.

Collegare l'uscita della workstation digitale-analogica all'altoparlante selezionato. Qui vengono utilizzati altoparlanti a campo libero. Collegare un amplificatore con basso rumore e un buon rapporto segnale/rumore all'ingresso analogico/digitale.

Quindi inizia il processo per fornire stimoli acustici nel canale uditivo esterno utilizzando stimoli preimpostati o nuovi segnali progettati con il software appropriato. Presentare gli stimoli iniziando con un'intensità elevata e riducendo l'intensità in passi di livello di pressione sonora da cinque a 10 decibel. Registrare la risposta elettrica nei primi 10 millisecondi dopo la stimolazione, poiché le risposte ABR evocate appaiono da sei a otto millisecondi.

Utilizzare il software per determinare la soglia ABR come descritto nella parte scritta del protocollo. Dopo aver somministrato l'anestesia secondo i protocolli approvati, verificare che sia stato raggiunto un piano chirurgico di anestesia dall'assenza di una reazione a un pizzicamento del dito del piede e dalla presentazione di una respirazione regolare. Usa le tosatrici per rimuovere il pelo sulla superficie ventrale del collo e proteggi gli occhi dalla cheratite corneale con un gel a base di idrossi-propil-metil-cellulosa.

Posizionare il topo nell'area chirurgica sterile in posizione supina da decubito. Pulire la pelle con una soluzione antisettica a base di iodio povidone e coprire con un telo sterile. Dopo aver praticato con un bisturi un'incisione longitudinale di due centimetri dalla mandibola alla clavicola, guarda attraverso il microscopio operatorio e identifica le ghiandole sottomandibolari.

Separare entrambe le ghiandole sottomandibolari con una pinza, ritrarle e localizzare l'origine del muscolo digastrico nel nervo facciale. Successivamente, praticare un'incisione all'origine del muscolo digastrico con una forbice e ritrarla ventralmente, esponendo l'aspetto mediale inferiore sottostante della bolla timpanica. Quindi, usa un ago calibro 27 per forare la bulla e creare un'apertura.

Pulire il sangue dall'area perforata con una spugna di gelatina assorbibile. Individua l'arteria stapediale nella membrana rotonda della finestra coccolata ad essa. Utilizzando un catetere calibro 34 e una micro-siringa di vetro, iniettare lentamente da tre a cinque microlitri di soluzione veicolare attraverso la bullostomia e direttamente sulla nicchia rotonda della finestra per riempirla.

Sigillare la bullostomia con una o due gocce di adesivo per tessuti. Riportare le ghiandole sottomandibolari nella loro posizione iniziale e chiudere le incisioni cutanee con sutura chirurgica di seta 5-0. Applicare un antisettico a base di iodio povidone o clorexidina intorno all'incisione per evitare l'infezione della ferita.

Tenere il mouse su un termoforo fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Rimetti l'animale nella gabbia di casa solo dopo che si è completamente ripreso. Posizionare il topo in posizione di decubito laterale e prepararlo in un'area chirurgica settica sotto il meato uditivo esterno come mostrato in precedenza.

Dopo aver praticato un'incisione longitudinale di 0,5 centimetri nella parte verticale del condotto uditivo esterno, individuare la membrana timpanica con l'aiuto del microscopio operatorio. Identificare la pars flaccida superiore nella pars tensa inferiore, che è divisa in sezioni anteriori e posteriori dal manico del martello. Quindi, eseguire una piccola miringostomia nella porzione caudale della pars flaccida e un'ulteriore incisione nella pars tensa della membrana timpanica per consentire l'evacuazione dell'aria durante l'iniezione.

Utilizzare una micro-siringa di vetro collegata a un catetere calibro 34 per iniettare delicatamente da 10 a 15 microlitri di veicolo attraverso la pars flaccida, vicino alla nicchia rotonda della finestra, fino a quando l'orecchio medio non è chiaramente pieno. Chiudere le incisioni cutanee con una sutura chirurgica di seta 5-0 e pulire come precedentemente descritto. Questo grafico mostra le soglie ABR nei topi maschi C57BL/6J di 8 settimane in risposta agli stimoli del clic prima dell'intervento chirurgico e sette, 14 e 28 giorni dopo la microchirurgia.

I dati sulla bullostomia sono mostrati in arancione, i dati sulle iniezioni transtimpaniche sono mostrati in blu e i dati degli animali non operati sono mostrati in grigio. Questo grafico mostra le soglie ABR in risposta a stimoli di esplosione di toni nell'intervallo da 8 a 40 kilohertz nello stesso periodo di tempo dopo la microchirurgia. Anche in questo caso, non sono state osservate differenze significative tra l'approccio bullostomia e quello transtimpanico.

Studi morfologici dimostrano che la scala media non mostra alterazioni dopo la somministrazione del veicolo mediante bullostomia o iniezione transtimpanica, indicando che entrambe le procedure da sole non provocano danni. Durante il tentativo di procedura di bullostomia, è importante ricordare di rivedere la struttura critica e anatomica che circonda l'orecchio medio e interno dei roditori. Seguendo queste procedure, potrebbero essere eseguite altre tecniche.

Ad esempio, campionamento di Berlino per studi di farmacocinetica Dopo il suo sviluppo, queste tecniche aprono la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze uditive per esplorare potenziali terapie locali in modelli animali, principalmente nei roditori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come somministrare i farmaci nell'orecchio medio e come valutare l'udito nei roditori.