L'analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L'utilizzo di un In Vitro sistema

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare il danno cromosomico indotto dall'esposizione delle cellule al particolato, estratto dall'aria ambiente. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo del particolato, e cioè se l'esposizione al particolato induce danni cromosomici? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione diretta del danno indotto nel materiale genetico.

Dopo aver raccolto e analizzato le particelle secondo il protocollo di testo, eseguire l'esposizione delle particelle riscaldando il terreno di crescita completo, lo 0,25% di tripsina e il PBS in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, per almeno 30 minuti prima dell'inizio della coltura. Dopo aver lavato 264,7 cellule grezze, aggiungere un millilitro della soluzione tiepida di tripsina al piatto e rimuovere le cellule dal fondo del recipiente di coltura tissutale raschiandole. Quindi raccogliere le cellule e creare una sospensione unicellulare mediante pipettaggio ripetuto.

Con il blu di tripano, contare il numero di cellule, quindi utilizzare un terreno completo preriscaldato per piastrle a una densità di 8000 per centimetro quadrato in un piatto di coltura tissutale da 100 millimetri. Quindi utilizzare un terreno completo per regolare il volume a 10 millilitri per una concentrazione finale di 50.000 cellule per millilitro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per 24 ore per consentire loro di attaccarsi.

In una cappa di biosicurezza, utilizzare PBS sterile per diluire le particelle filtrate a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro, per una dose di trattamento di 5 microgrammi per millilitro e a 5 milligrammi per millilitro, per una dose di trattamento di 50 microgrammi per millilitro. Per trattare le cellule con particolato, controllare le cellule coltivate al microscopio con ingrandimento 10x per la crescita cellulare, la morfologia cellulare, le condizioni di coltura e la contaminazione. Le cellule dovrebbero essere almeno al 30% confluenti in questa fase.

Utilizzando una pipetta sterile, aspirare asetticamente il terreno e utilizzare due millilitri di PBS a 37 gradi Celsius per lavare il recipiente di coltura due volte. Aggiungere una dose predeterminata di particolato con terreno fresco e incubare le colture a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per parallelamente all'esposizione utilizzata per l'analisi genotossica ed epigenotossica concomitante. Per arrestare le cellule in metafase, dopo il lavaggio delle cellule, aggiungere alla coltura due millilitri di terreno preriscaldato con cinque microlitri per millilitro di soluzione di colcemid e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per due ore.

Dopo l'incubazione, rimuovere completamente il terreno e utilizzare PBS caldo per lavare le cellule due volte. Quindi aggiungere la soluzione di tripsina e incubare le colture a 37 gradi Celsius per un minuto. Usando un raschietto cellulare, staccare le cellule e aggiungere 10 millilitri di PBS per inattivare la tripsina.

Quindi pipettare le cellule su e giù almeno dieci volte per creare una sospensione a cellula singola e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri. Posizionare le provette in una centrifuga oscillante e far girare la sospensione cellulare a 400 volte g e a temperatura ambiente per cinque minuti. Per eseguire il trattamento ipotonico, rimuovere il surnatante dai tubi senza disturbare il pellet cellulare e lasciare circa 0,5 millilitri di PBS.

Rompere delicatamente il pellet cellulare e utilizzare una pipetta P200 per creare una sospensione a cella singola. Quindi aggiungere quattro millilitri di soluzione di cloruro di potassio preriscaldata goccia a goccia agitando delicatamente. Incubare la sospensione cellulare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Dopo il trattamento ipotonico, fissare le cellule aggiungendo un volume uguale di fissativo al tubo e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo. Centrifugare le provette a 400 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti e rimuovere il surnatante. In questa fase, il pellet cellulare sarà aumentato di dimensioni e diventerà di colore biancastro e più visibile.

Rimuovere il surnatante. Aggiungere quattro millilitri di fissativo fresco e incubare le provette a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi centrifugare le provette, rimuovere il surnatante e utilizzare quattro millilitri di fissativo per lavare le cellule altre due volte.

Immergere completamente i vetrini in detersivo liquido al 10% per 30 minuti. Quindi sciacquare accuratamente i vetrini in acqua corrente fredda del rubinetto per 30 minuti. Utilizzare acqua distillata per sciacquare i vetrini tre volte per rimuovere completamente il detersivo.

Quindi immergerli in acqua distillata e conservare i vetrini in frigorifero per una notte. Far cadere dieci microlitri di sospensione cellulare su un vetrino umido freddo e lasciarlo asciugare per una notte a temperatura ambiente. Per colorare e montare i campioni, preparare 50 millilitri di soluzione colorante giemsa mescolando una parte di soluzione colorante giemsa con una parte di PBS e versare in un barattolo di coplin.

Immergere i vetrini in una soluzione colorante per 20 minuti, quindi sciacquare i vetrini in acqua distillata per rimuovere la macchia in eccesso e utilizzare immediatamente un asciugacapelli per asciugare i vetrini. Lasciare i vetrini a temperatura ambiente per una notte. La mattina seguente, applicare una singola goccia di mezzo di montaggio sul vetrino.

Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sulla parte superiore e lasciare che il supporto di montaggio si diffonda lentamente sul vetrino. Quindi utilizzare un tovagliolo di carta per rimuovere il terreno in eccesso. Infine, utilizzare un microscopio a campo chiaro con ingrandimento 100x per esaminare le aberrazioni cromosomiche strutturali nelle diffuse della metafase.

Questa immagine mostra che una normale metafase di topo avrà 40 cromosomi acentrici. Il trattamento con particolato induce varie aberrazioni cromosomiche, come una rottura cromatidica, un frammento acentrico, un cromosoma ad anello, un cromosoma dicentrico, doppi minuti, una traslocazione robertsoniana e un'endoreduplicazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che devono essere utilizzate solo cellule proliferanti.

Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi, come M-FISH e SKY, per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, se sono presenti aberrazioni intercromosomiche stabili. Non dimenticare le precauzioni e gli agenti cancerogeni, e precauzioni come indossare i guanti, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.