Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

L'obiettivo generale di questo metodo derivato da peptidi è quello di trasportare geni e proteine attraverso le barriere cellulari e organellari nelle piante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave attraverso la modifica delle piante attraverso coniugati peptidici progettati razionalmente che forniscono vari geni e proteine per mediare l'espressione di geni specifici. Il vantaggio immediato di questa tecnica è che impiega una semplice procedura di trasfezione assistita da siringa di foglie di piante che si basa su peptidi in grado di trascendere i confini cellulari e organellari.

Abbiamo sviluppato questo metodo di trasformazione delle piante semplice, efficace e innovativo perché i metodi convenzionali sono costosi, non applicabili ad alcuni tipi di piante e non sono in grado di colpire gli organelli intracellulari. Jo-Ann Church dimostrerà la procedura con Yoko Horii, un tecnico del mio laboratorio. Preparare la formulazione del DNA plasmatico peptidico come descritto nel protocollo di testo.

Quando il peptide viene aggiunto al DNA plasmatico, si forma una soluzione torbida. La miscela diventa limpida dopo la diluizione con acqua ultrapura fino al volume finale specificato nel protocollo di testo. Trasferire 800 microlitri della soluzione diluita in una cuvetta per l'analisi dinamica della diffusione della luce.

Determinare il diametro irodinamico e l'indice di polidispersione dei complessi formati con uno zetananosizer. Utilizzando un laser al neon all'elio da 633 nanometri a 25 gradi Celsius con un angolo di rilevamento della retrodiffusione di 173 gradi. Dopo le misurazioni delle dimensioni, trasferire la soluzione in una cella capillare ripiegata per le misurazioni del potenziale zeta ai parametri predefiniti della costante dielettrica, dell'indice di rifrazione e della viscosità dell'acqua a 25 gradi Celsius.

Per osservare la complessa soluzione al microscopio a forza atomica, depositare 10 microlitri sulla superficie appena esposta di un foglio di mica e lasciare asciugare la mica all'aria per una notte in una capsula di Petri di plastica coperta. Acquisire un'immagine dei complessi in aria a 25 gradi Celsius utilizzando un cantilever in silicio con una costante elastica di 1,3 newton per metro in modalità di maschiatura. Utilizzare Arabidopsis thaliana di tre settimane coltivata in un ciclo di 16 ore di luce, 8 ore di buio, a 22 gradi Celsius.

Scegli almeno tre foglie per la trasgressione che servano come triplicato per la quantificazione dell'espressione genica. Caricare una siringa di plastica senza ago da un millilitro con 100 microlitri di soluzione complessa per la trasfezione di una foglia. Quindi, posizionare la punta della siringa sulla superficie aassiale della foglia.

Premere leggermente la punta della siringa contro la foglia e premere lentamente lo stantuffo della siringa esercitando una contropressione con il dito indice di una mano guantata in lattice dal lato opposto. L'infiltrazione riuscita può essere osservata come la diffusione di un'area imbevuta d'acqua nella foglia. Etichettare le foglie infiltrate per facilitarne l'identificazione.

Incubare la pianta trasfettata con DNA nel plasma peptidico per 12 ore in una camera di crescita. Per valutare l'efficienza della trasfezione, asportare prima l'intera foglia trasfettata. Per gli esperimenti di trasfezione che utilizzano il vettore reporter Renilla Luciferase, determinare quantitativamente l'efficienza di trasfezione utilizzando un kit di saggi Renilla Luciferase.

Per prima cosa, metti ogni foglia asportata in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi 1X per provetta. Allo stesso modo, preparare lisati di foglie di controllo non trasfettate in triplicato.

Macinare la foglia usando un pestello per omogeneizzazione e incubare il lisato risultante a 25 gradi Celsius per sei-10 ore. Dopo l'incubazione, centrifugare il lisato a 12, 470 volte g in una microcentrifuga per un minuto. Trasferire 20 microlitri di lisato chiarificato in un pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti.

Utilizzare il volume rimanente per la quantificazione della concentrazione proteica totale utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA secondo il protocollo del produttore. Quindi, aggiungere 100 microlitri di substrato del saggio Renilla Luciferase una tantum nel pozzetto e mescolare mediante pipettaggio lento. Posizionare la micropiastra in un lettore di micropiastre multimodale e avviare la misurazione.

Per gli esperimenti di trasfezione utilizzando un vettore reporter proteico fluorescente verde, osservare la fluorescenza utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Per prima cosa, taglia i bordi di un'intera foglia per favorire la rimozione degli spazi d'aria. Quindi, rimuovere lo stantuffo da una siringa da 10 millilitri e inserire ogni foglia o sezione di foglia asportata nella siringa.

Riposizionare lo stantuffo e spingerlo delicatamente sul fondo della siringa senza schiacciare la foglia. Aspirare l'acqua nella siringa fino a riempirla circa a metà. Puntare la siringa verso l'alto e premere lo stantuffo per rimuovere l'aria dalla siringa attraverso la punta.

Quindi, coprire la punta della siringa e tirare lentamente lo stantuffo verso il basso per espellere l'aria dalla foglia. Ripeti questo processo più volte fino a quando la foglia appare traslucida. Quindi, coprire la superficie di un vetrino da microscopio con del nastro adesivo.

Tagliare un'area quadrata sul nastro abbastanza grande da ospitare il campione di foglie usando una lama e staccare il pezzo quadrato di nastro con una pinza per creare una camera del campione. Il nastro servirà come distanziatore tra il vetrino e il vetrino coprioggetto. Posizionare la foglia nella camera con la superficie abassiale rivolta verso l'alto e riempire d'acqua la restante area della camera.

Sigillare l'anta all'interno della camera con un vetrino coprioggetto e fissare i bordi del vetrino coprioggetto con del nastro adesivo. Esaminare il campione di foglie utilizzando un microscopio a scansione laser confocale sotto un obiettivo 40x o un obiettivo a immersione in acqua 63x. La fluorescenza GFP può essere visualizzata a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri.

Una preparazione ottimale della formulazione di DNA plasmatico peptidico con un rapporto peptide/DNA di 0,5 dovrebbe avere un diametro medio di circa 290 nanometri e un basso indice di polidispersione di circa 0,3 che indica una distribuzione dimensionale uniforme. Inoltre, i complessi dovrebbero presentare un potenziale zeta di circa 30 millivolt. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa al microscopio a forza atomica dei complessi di DNA del plasma peptidico.

Sono stati osservati complessi globulari omogenei. Utilizzando la formulazione del DNA plasmatico peptidico, la consegna e l'espressione del DNA plasmatico a bersaglio nucleare possono essere ottenute in Arabidopsis thaliana con un valore stimato di Renilla Luciferasi per milligrammo di circa 100.000. L'osservazione microscopica è stata eseguita su foglie trattate con complessi preparati utilizzando DNA plasmatico, codificando il reporter GFP per valutare l'espressione genica.

Le immagini hanno rivelato che nelle cellule trasfettate con complessi di DNA plasmatico peptidico non mirati, la fluorescenza verde diffusa corrispondente all'espressione di GFP è stata chiaramente osservata e si è scoperto che si localizza nel citosol. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biotecnologia vegetale per fornire vari carichi a base di proteine e acidi nucleici nelle piante viventi. Dopo aver visto questo video e aver letto il protocollo di testo, dovresti avere una buona comprensione di come preparare, caratterizzare e applicare varie fomulazioni ottimizzate per ogni tipo di carico, che includono il DNA plasmatico, il DNA a doppio filamento o RNA e le proteine.