Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

L'obiettivo generale di questo metodo derivato da peptidi è trasportare geni e proteine attraverso barriere cellulari e organellari nelle piante. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali modificando le piante mediante coniugati peptidici progettati razionalmente, che consegnano vari geni e proteine per regolare l'espressione di geni specifici. Il vantaggio immediato di questa tecnica è che utilizza una semplice procedura di trasfezione assistita da siringa su foglie di piante, basata su peptidi in grado di superare i confini cellulari e organellari.

Abbiamo sviluppato questo semplice, efficace e innovativo metodo di trasformazione vegetale perché i metodi convenzionali sono costosi, non applicabili ad alcuni tipi di piante e incapaci di bersagliare gli organelli intracellulari. Jo-Ann Church illustrerà la procedura insieme a Yoko Horii, una tecnica del mio laboratorio. Preparare la formulazione di DNA con peptide plasmidico come descritto nel protocollo testuale.

Quando il peptide viene aggiunto al DNA plasmatico, si formerà una soluzione torbida. La miscela diventa limpida dopo diluizione con acqua ultrapura fino al volume finale specificato nel protocollo del testo. Trasferire 800 microlitri della soluzione diluita in una cuvetta per l'analisi della diffusione dinamica della luce.

Determinare il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersità dei complessi formati mediante un zetananosizer. Utilizzare un laser all'elio-neon di 633 nanometri a 25 gradi Celsius con un angolo di rilevamento in retrodiffusione di 173 gradi. Dopo le misurazioni dimensionali, trasferire la soluzione in una cella capillare piegata per le misurazioni del potenziale zeta utilizzando i parametri predefiniti per costante dielettrica, indice di rifrazione e viscosità dell'acqua a 25 gradi Celsius.

Per osservare la soluzione complessa mediante microscopia a forza atomica, depositare 10 microlitri sulla superficie appena esposta e scheggiata di un foglio di micace e lasciare asciugare l'aria alla mica durante la notte in una capsula di Petri di plastica coperta. Acquisire un'immagine dei complessi in aria a 25 gradi Celsius utilizzando una mensola in silicio con una costante elastica di 1,3 newton per metro in modalità tapping. Utilizzare piante di Arabidopsis thaliana di tre settimane cresciute in un ciclo di 16 ore di luce e 8 ore di buio, a 22 gradi Celsius.

Scegliere almeno tre foglie per la trasfezione, da utilizzare come triplicato per la quantificazione dell'espressione genica. Caricare una siringa di plastica da un millilitro senza ago con 100 microlitri di soluzione complessa per la trasfezione di una foglia. Successivamente, posizionare la punta della siringa sulla superficie abassiale della foglia.

Premere leggermente la punta della siringa contro la foglia e abbassare lentamente lo stantuffo della siringa esercitando una pressione contraria con l'indice di una mano guantata in lattice dal lato opposto. L'infiltrazione riuscita può essere osservata come diffusione di un'area impregnata d'acqua nella foglia. Etichettare le foglie infiltrate per facilitarne l'identificazione.

Incubare la pianta transfettata con DNA plasmidico peptidico per 12 ore in una camera di crescita. Per valutare l'efficienza di transfezione, rimuovere innanzitutto l'intera foglia transfettata. Per esperimenti di transfezione che utilizzano il vettore reporter della Renilla Luciferasi, determinare quantitativamente l'efficienza di transfezione mediante un kit per saggio della Renilla Luciferasi.

Prima di tutto, posizionare ogni foglia escissa in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di Buffer di lisi 1X per ogni provetta. In modo analogo, preparare i lisati delle foglie di controllo non trasfettate in triplicato.

Macinare la foglia utilizzando un pestello per omogeneizzazione e incubare il lisato risultante a 25 gradi Celsius per sei-dieci ore. Dopo l'incubazione, centrifugare il lisato a 12.470 ×g in una microcentrifuga per un minuto. Trasferire 20 microlitri del lisato chiarificato in una pozzetta di una micropiastra a 96 pozzette.

Utilizzare il volume rimanente per la quantificazione della concentrazione totale di proteine mediante un kit per saggio proteico BCA, seguendo il protocollo del produttore. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di substrato per saggio Renilla Luciferasi una volta nella pozzetta e mescolare mediante pipettaggio lento. Posizionare la micropiattaforma in un lettore multi-mode per micropiastre e avviare la misurazione.

Per esperimenti di trasfezione che utilizzano un vettore reporter della proteina verde fluorescente, osservare la fluorescenza mediante un microscopio confocale a scansione laser. Innanzitutto, tagliare i margini di una foglia intera per facilitare la rimozione degli spazi aeriferi. Successivamente, rimuovere lo stantuffo da una siringa da 10 mL e inserire ogni foglia o sezione fogliare escissa nella siringa.

Sostituire lo stantuffo e spingerlo delicatamente fino al fondo della siringa senza schiacciare la foglia. Aspirare acqua nella siringa fino a riempirla per circa metà. Orientare la siringa verso l'alto e premere lo stantuffo per rimuovere l'aria dalla siringa attraverso la punta.

Quindi, coprire la punta della siringa e tirare lentamente lo stantuffo verso il basso per espellere l'aria dalla foglia. Ripetere questo processo più volte finché la foglia non appare traslucida. Successivamente, ricoprire la superficie di un vetrino con del nastro adesivo.

Tagliare un'area quadrata sul nastro di dimensioni sufficienti ad accogliere il campione di foglia utilizzando una lama, quindi staccare il pezzo quadrato di nastro con una pinzetta per creare una camera per il campione. Il nastro fungerà da spaziatore tra il vetrino e il coprioggetto. Posizionare la foglia nella camera con la superficie abassiale rivolta verso l'alto e riempire la parte rimanente della camera con acqua.

Sigillare la foglia all'interno della camera con un coprioggetto di vetro e fissare i bordi del coprioggetto con del nastro adesivo. Esaminare il campione di foglia utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo 40x o un obiettivo ad immersione in acqua 63x. La fluorescenza GFP può essere visualizzata a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri.

Una preparazione ottimale della formulazione di DNA plasmidico con peptidi a un rapporto peptido-DNA di 0,5 dovrebbe presentare un diametro medio di circa 290 nanometri e un basso indice di polidispersione di circa 0,3, il che indica una distribuzione uniforme delle dimensioni. Inoltre, i complessi dovrebbero mostrare un potenziale zeta di circa 30 millivolt. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa ottenuta al microscopio a forza atomica dei complessi di DNA plasmidico con peptidi.

Sono stati osservati complessi globulari omogenei. Utilizzando la formulazione peptidica di DNA plasmidico, è possibile ottenere un rilascio mirato al nucleo e l'espressione del DNA plasmidico in Arabidopsis thaliana con un valore stimato di Renilla Luciferasi per milligrammo di circa 100.000. L'osservazione al microscopio è stata effettuata su foglie trattate con complessi preparati utilizzando DNA plasmidico che codifica per il reporter GFP per valutare l'espressione genica.

Le immagini hanno rivelato che nelle cellule trasfettate con complessi di DNA plasmidico e peptidi non mirati, una fluorescenza verde diffusa corrispondente all'espressione di GFP è stata chiaramente osservata e localizzata nel citosol. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biotecnologia vegetale per consegnare diverse tipologie di carichi a base di proteine e acidi nucleici in piante vive. Dopo aver visionato questo video e letto il protocollo testuale, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare, caratterizzare e applicare diverse formulazioni ottimizzate per ciascun tipo di carico, che includono il DNA plasmidico, il DNA a doppio filamento o l'RNA e le proteine.