Name: Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Impara a dissecare e coltivare i metatarsi embrionali di topo per studiare l'ossificazione endocondrale. Questo metodo fisiologico es vivo permette di analizzare la mineralizzazione scheletrica e la crescita ossea in condizioni simili all'ambiente in vivo.

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Siamo grati al Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) per il finanziamento di DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). Ringraziamo inoltre Arthritis Research UK per il finanziamento a KAS (20413). Ringraziamo la signorina Elaine Seawright per la sua assistenza con gli esperimenti dettagliati, il dottor Neil Mackenzie per la sua assistenza con le tecniche lentivirali, e il signor Darren Smith e il signor Alex Robertson (Roslin Institute BRF) per la loro assistenza con gli studi sugli animali.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti in conformità con gli animali del Regno Unito (Procedure Scientifiche) Act del 1986 e gli animali sono stati mantenuti in accordo con il Ministero dell&#39;Interno pubblicato Codice di condotta per l&#39;alloggiamento e la cura degli animali allevati, Fornito o utilizzati a fini scientifici. NOTA: Gli esperimenti effettuati utilizzando wild-type C57Bl / 6J topi sono ben stabiliti e descritti di seguito. Metatarsi embrionali provenienti da diversi ceppi di topi possono allo stesso modo essere coltivate in vitro, anche se i loro tassi di crescita e di mineralizzazione possono essere diverse a quelle descritte nel presente documento. 1. dissezione Condizioni e preparazione degli strumenti <ol><li> Eseguire tutta la preparazione dei media, tessuti dissezioni e il lavoro della cultura in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità dei media e rudimenti embrionali. </li><li> Consentire terreni di coltura e dissezione per equilibrare per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore prima dell&#39;uso. </li><li> sterilizzare dissezioneforbici, Dumont # 5 e # 4 Dumont pinzette accanto a un paio di Superfine Vännäs micro forbici (8 cm rette, 3 mm lame) in autoclave. Dopo la sterilizzazione in autoclave, immergere l&#39;apparecchiatura dissezione in etanolo al 70% prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di dissezione e di cultura dei media <ol><li> Preparare mezzo di dissezione <ol><li> Diluire media Essential α-minimo (senza nucleosidi, αMEM) in tampone fosfato (PBS) (1,13) e risospendere albumina sierica bovina (BSA) a 2 mg / m l prima filtro sterilizzante attraverso una siringa diametro di 0,22 micron, 33 millimetri filtro. NOTA: media dissezione può essere fatta, filtro sterilizzato e conservato in aliquote a -20 ° C a tempo indeterminato. </li></ol></li><li> Preparare terreno di coltura <ol><li> Cultura metatarsi embrionali in 300 ml di terreno di coltura (in ciascun pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti). Preparare il terreno di coltura con l&#39;aggiunta di 0,2% w / v BSA; 5 ug / ml di L-ascofosfato acido di rbic; 1 mM β-glicerofosfato (βGP; opzionale - vedi sezione risultati); 0,05 mg / ml di gentamicina e 1,25 mg amfotericina B a αMEM e filtro sterilizzare attraverso un filtro di diametro siringa da 0,22 micron, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. murino embrionale metatarso Dissection e cultura <ol><li> Abbattere il mouse in stato di gravidanza, l&#39;ospitare 15 giorni di età embrioni, da dislocazione cervicale in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito </li><li> Posizionare la supina animale e disinfettare la pelle a spruzzo con il 70% di etanolo. Utilizzando forbici dissezione fare una grande incisione sulla linea mediana, penetrando sia la pelle e il peritoneo per esporre la cavità addominale. </li><li> Individuare le due corna uterine dell&#39;animale nella regione dorsale della cavità del corpo. Rimuovere le corna uterine da un lato liberando ogni uterino dal mesometrio da attenti incisioni con le forbici dissezione e infine il taglio delle corna uterine libera alla loro base. Place corna uterine in media dissezione. </li><li> Separare ogni embrione, tagliando tra i siti di impianto lungo il corno uterino e rimuovere gli embrioni dalle loro singole sacche con pinze. embrioni da riforma per decapitazione, in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito </li><li> Dopo la disinfezione della pelle a spruzzo con il 70% di etanolo, usare le forbici Vannas micro per rimuovere gli arti posteriori da embrioni incidendo intorno al femore prossimale. Questo assicura tanto degli arti posteriori possibile è rimosso. Posizionare gli arti posteriori in una capsula di Petri sommerso nel mezzo di dissezione prima metatarso dissezione. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, cominciare a rimuovere la pelle che circonda il piede embrionale, pizzicando e tirando fuori con il # 5 pinzette, mentre tenendo premuto il arto posteriore costante con il # 4 pinzette. Questo è più efficace eseguita afferrando la pelle a circa il livello della tibia e tirando verso le falangi. L&#39;uso di forbici in questa fase per tagliare ilpelle molto sottile non è necessaria. </li><li> tenere attentamente le tarso del piede embrionale con # 4 pinzette e rimuovere il primo e il quinto metatarso pizzicando fuori vicino alle tarso usando # 5 pinzette e scartare. </li><li> Con il piede tenuto nella stessa posizione, utilizzare il # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra i tre falangi rimanenti e metatarsi. Inserire la punta di # 5 pinzette in corrispondenza del giunto tra le falangi e metatarsi per rimuovere le falangi dei metatarsi. </li><li> Infine, usare # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra le tarso e metatarso. Anche in questo caso posizionare la punta del # 5 pinzette nello spazio articolare tra le tarso e metatarso e delicatamente liberi metatarsi dai tarso. </li><li> Delicatamente raccogliere i metatarsi ora liberi con # 4 pinzette e posto in media dissezione fresco. NOTA: la dissezione attenta dovrebbe fornire 6 metatarsi da ogni embrione. </li><li> Quando tutti i metatarsi richiesti sono stati sezionati, carefuLLY luogo metatarsi singolarmente nelle piastre da 24 pozzetti pre-riscaldato contenenti 300 ml di terreni di coltura. Metatarsi Culture a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per un massimo di 14 giorni. NOTA: Non modificare i mezzi di comunicazione di culture E15 fino ad almeno 5 giorni di cultura come questo influenza la loro capacità di mineralizzazione 26. Le ragioni di questo non sono chiari, ma la crescita lineare e matrice mineralizzazione possono dipendere stimolazione con fattori di crescita rilasciati dalle metatarsi. </li></ol> 4. analisi e la manipolazione delle Culture metatarso <ol><li> Il giorno della dissezione (giorno 0) eseguire misure longitudinali iniziali utilizzando un microscopio con un software videocamera collegata e analisi di immagine digitale. Misurare la lunghezza della zona centrale mineralizzazione quando appare dopo pochi giorni di coltura. </li><li> Periodicamente, come richiesto, effettuare ulteriori misurazioni (di solito ogni 2 ° giorno) fino all&#39;ultimo giorno della cultura a quel punto mossa etatarsal vengono elaborati dipende risultati richiesti (discusso in premessa). </li><li> Media Supplemento di culture metatarso d&#39;organo con vari fattori esogeni ad esempio fattori di crescita, ormoni e agenti farmacologici dal giorno 0 della cultura 22,24. In tutti gli studi di questo tipo, di controllo sono necessari metatarsi non trattati. NOTA: Anche se è consigliabile che le ossa di controllo sono il rudimento equivalenti dalla gamba controlaterale, non ce ne è stato eventuali differenze di crescita lineare o potenziale mineralizzazione delle colta E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso (vedi sotto, figura 2) . </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La cultura del metatarso embrionali murine fornisce un modello altamente fisiologico della crescita endochondral e mineralizzazione. I primi studi hanno confermato che E15 metatarsi del mouse subiscono un normale modello di crescita scheletrica e la differenziazione. La cartilagine (condrociti) e l&#39;osso (osteoblasti e osteoclasti), le cellule e le loro rispettive matrici di collagene sono indistinguibili da quelle osservate in vivo. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni riconosciute di questo modello. La velocità di differenziazione degli osteoclasti è compromessa così come la crescita delle ossa (ma non cartilagine differenziazione). La crescita ossea è circa il 50% inferiore a quella osservata in vivo e può essere causa di carenze in fattori sistemici che influenzano la produzione di fattori locali (ad esempio, IGF-1, BMP, ecc) 31. Inoltre, è ben noto che l&#39;osso è sensibile al suo ambiente meccanico e questo è anche il caso per metatarsi coltivate, che rispondono alla cHANGES a carico 32,33 meccanica. Pertanto, in situazioni non caricati, come descritto in questo protocollo, la mineralizzazione e il riassorbimento minerale potrebbe essere compromessa. Tuttavia, il modello metatarso offre la possibilità di misurare direttamente la crescita delle ossa lineare che non è possibile tramite 2D e 3D in sistemi di coltura in vitro. Abbiamo fornito una descrizione completa del protocollo coinvolti nella dissezione e la cultura della E15 metatarsi murini e in effetti, per la prima volta, confermare la validità di mettere in comune i 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per gli esperimenti. Metatarsi da E17 / E18 sono comunemente usati per studiare i meccanismi di crescita ossea a causa della loro straordinario potenziale per crescere ex vivo per lunghi periodi di tempo (cioè oltre i 14 giorni di cultura). Si tratta di un modello consolidato per indagare il ruolo dei fattori di crescita sulla crescita embrionale ossea longitudinale.Inoltre, la dissezione e la cultura di metatarsi postnatali è comunemente impiegato per delineare i meccanismi che circondano la crescita delle ossa post-natale, come si è capito che la crescita delle ossa post-natale e la crescita delle ossa del feto sono regolati in modo diverso 21. La crescita ossea osservata in metatarsi postnatali in coltura è comunque notevolmente inferiore a quello osservato nei rudimenti embrionali 25,34, limitando il loro potenziale in studi a lungo termine e mettendo in evidenza l&#39;influenza più sistemico sulla crescita delle ossa, in questa fase post-natale. Infatti, 3 giorni di età metatarsi postnatale di topi sono tipicamente l&#39;ultima fase che può essere utilizzato per ottenere misurabile 34 crescita. Qui si descrive il nostro protocollo per l&#39;isolamento delle ossa del metatarso embrionali a E15. L&#39;assenza di minerale hydroxyapaptite in E15 metatarsale significa che essi forniscono un modello ineguagliabile per indagare non solo i meccanismi circostanti crescita ossea longitudinale, ma anche l&#39;iniziazionedi mineralizzazione scheletrica. La matrice mineralizzata della zona di condrociti ipertrofica terminale fornisce un&#39;impalcatura per invadere osteoblasti stabilire un osso specifica matrice (osteoide), che viene successivamente mineralizzata, e come tale questo mineralizzazione iniziale è di vitale importanza per la formazione delle ossa di successo e funzionale 35. In effetti una serie di rapporti recenti che utilizzano metatarsi E15 hanno confermato la loro capacità unica per l&#39;indagine del 28,36,37 processo di mineralizzazione. Inoltre, i ricercatori hanno descritto l&#39;uso di metatarsi E15 come modello di angiogenesi 38, mettendo in evidenza il potenziale di metatarsi embrionali come modello di fuori del contesto della crescita ossea / mineralizzazione. Il protocollo che descriviamo richiede solo apparecchiature di laboratorio standard tra cui una cappa flusso laminare, un microscopio da dissezione per eseguire la dissezione, e un incubatore di CO 2 per la cultura dei primi rudimenti escisse. Inoltre, una strada molto essenzialeture terreno contenente αMEM, BSA, antibiotici, antimicotici e l&#39;acido L-ascorbico (un cofattore nella sintesi di idrossiprolina e idrossilisina, due amminoacidi essenziali per la produzione di collagene 39) evita l&#39;uso di additivi non definiti, come siero animale . Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mezzi utilizzati per la coltura metatarsi embrionali, ma come rivelato nei nostri risultati, l&#39;uso di una fonte di fosfato supplementare non è richiesto per la mineralizzazione successo in questo sistema di coltura. Questo è un dato importante nella nostra ricerca di comprensione dei meccanismi alla base ECM mineralizzazione. Metatarsi sono stati precedentemente infettati con adenovirus contenenti forme dominanti negativi di Smad2 per esplorare il ruolo di fattore di crescita trasformante β nella regolazione dello sviluppo delle ossa lunghe 40. Qui si rivelano anche la trasfezione di successo di wild-type ossa metatarsali E15 con particelle virali GFP, indicando ttecniche di cappello lentivirali potrebbero essere facilmente adottate per manipolare l&#39;espressione genica nelle culture del metatarso. Analogamente, il sistema di coltura organo metatarso è un modello eccellente in cui confrontare la crescita delle ossa da topi geneticamente modificati per comprendere meglio il ruolo di un particolare gene nel processo di crescita ossea. I nostri studi precedenti hanno utilizzato il sistema di coltura di organi metatarso per determinare il ruolo di soppressore di citochine segnalazione-2 (SOCS2) in crescita ossea endochondral. Utilizzando ossa del metatarso da topi deficienti in SOCS2, abbiamo dimostrato che l&#39;ormone della crescita è in grado di simulare il loro longitudinale crescita autonoma di insulina come fattore di crescita (IGF-1), a differenza di wild-type ossa metatarsali che non rispondono alla crescita trattamento ormonale 34, 41. Ciò evidenzia la misura in cui le culture metatarsali possono essere manipolati per esaminare gli effetti di diversi geni e / o fattori esogeni sulla crescita ossea endochondral. In sintesi, abbiamo detaicondotto un metodo per l&#39;estrazione di successo e cultura metatarsale embrionali che possono essere manipolate ed esaminati utilizzando una varietà di analisi. Questo modello ex vivo mantiene cellula-cellula e le interazioni cellula-matrice, così come contiene condrociti in diverse fasi di condrogenesi, fornendo quindi un modello più fisiologico di cellule in monostrato o coltura 3D. Metatarsali organo culture sono quindi un modello unico per lo studio dei meccanismi molecolari responsabili encondrale, e sono essenziali per migliorare la nostra comprensione sia la fisiologia dell&#39;osso e fisiopatologia

Lo scheletro è un organo altamente complessa, dinamica e complessa che ha una gamma di funzioni che vanno dalla locomozione, per l&#39;omeostasi di ioni. Composto da ossa e cartilagine, lo scheletro è costituito da popolazioni di cellule funzionalmente distinte che operano per mantenere la propria integrità strutturale, biochimico e meccanica 1. Una delle funzioni primarie dello scheletro è il suo ruolo nello sviluppo e crescita. Questi processi richiedono l&#39;orchestrazione di molteplici popolazioni cellulari che sono regolati attraverso endocrino stretto e controllo genetico. Con l&#39;eccezione della ossa piatte es scapola, cranio e dello sterno, lo scheletro dei mammiferi è formata attraverso il processo noto come encondrale. Questo processo, regolato sia molecolarmente e spazialmente, inizia con la condensazione di cellule mesenchimali derivate principalmente dal mesoderma 2. Sotto l&#39;influenza del fattore di trascrizione SOX9, cellule in the all&#39;interno degli condensazioni differenziarsi in condrociti, esprimere e secernere componenti cartilagine specifiche matrice extracellulare (ECM) come collagene di tipo II e aggrecano. Le cellule al margine della condensazione, esprimono collagene di tipo I e formo la pericondrio, delineando la prospettiva osso 3. Più tardi, i osteoprogenitors del pericondrio differenziano in osteoblasti, diretto da l&#39;espressione dei fattori di trascrizione, Runx2 e Osterix 4. Questo porta ad una predominanza di osteoblasti e questo strato viene rinominato periostio che forma un collare osseo mineralizzato intorno alla metà sezione dell&#39;osso. La penetrazione vascolare del periostio e l&#39;invasione del ponteggio cartilaginea avviene portando con sé, haematopoetically derivato cellule ossee riassorbimento, osteoclasti, che riassorbono i resti di condrociti e gran parte della matrice cartilaginea 5. Gli spazi formati sono riempiti da osteoprogenitors all&#39;origine della ossificazione primariacentro che occupa progressivamente il nucleo della diafisi e si fonde con il periostio. Altre cellule danno origine al midollo osseo. Intorno nascita, vasi sanguigni e osteoprogenitors penetrano la matrice cartilaginea ricca su entrambi i lati (epifisi) della diafisi sviluppo per formare il centro di ossificazione secondario. Situato tra l&#39;epifisi e diafisi alle due estremità delle ossa lunghe sono un gruppo di cartilagine - la cartilagine di accrescimento epifisaria - che è responsabile del coordinamento crescita lineare di tutte le ossa lunghe 6. I condrociti all&#39;interno della cartilagine di accrescimento inizialmente proliferano e successivamente progressi attraverso le zone morfologicamente distinte, coordinati da espressione sequenziale di fattori di trascrizione e di crescita. Il culmine di questa sequenza di eventi è l&#39;uscita dal ciclo cellulare e l&#39;ipertrofia dei condrociti al centro di questa cartilagine precursore. condrociti ipertrofici esprimono fortemente tipo X collagene e metalloproteinasi della matrice-13 (MMP13) e la loro notevole allargamento volume nella direzione della crescita longitudinale fornisce il maggior contributo alla crescita delle ossa nei mammiferi 7,8. Inoltre, condrociti ipertrofici mineralizzano loro ECM circostante attraverso il rilascio di vescicole matrice, strutture a membrana delimitata specializzati per la produzione di fosfato di calcio amorfo attraverso la loro inclusione di fosfatasi (tessuto non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e di calcio canalizzazione proteine ​​(annexins ) 9-11. Questa cartilagine calcificata è invasa da vasi sanguigni dal midollo sottostante con conseguente reclutamento degli osteoclasti e matrice di riassorbimento. Questa è seguita da migrazione degli osteoblasti e l&#39;allineamento alla superficie dei resti cartilagine calcificata dove stabiliscono uno strato di osteoide che è rapidamente mineralizzato. Il tessuto osseo del spugnoso è poi ristrutturato per osso lamellare della spongiosa secondario 12. risultati di fusione epifisari nelcessazione di encondrale 13. Encondrale è sotto stretta regolamentazione da molti ormoni endocrini e paracrini e fattori di crescita, in modo da prevenire lo sviluppo disturbato e / o la crescita delle ossa longitudinale 14. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questi processi è quindi indispensabile nella nostra ricerca di progressi clinici verso beneficio umano. Precedenti ricerche sulle somiglianze e le differenze tra le cartilagini di accrescimento di differenti età, luoghi e specie hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione dei meccanismi fisiologici che circondano dinamiche cartilagine di accrescimento 15,16. Tuttavia, lo studio dei condrociti isolati è difficile, come la rimozione dei condrociti dal loro ambiente può portare a dedifferentiation, accompagnato da perdita di espressione di marcatori chiave come COL2A1 17. Il mouse metatarso espianto di organi, pioneered dal Prof. Elisabeth Burger ei suoi colleghi nei Paesi Bassi, è un ex vivo modello altamente fisiologico per lo studio encondrale e la crescita delle ossa, come il tasso di crescita delle ossa nella cultura imitano quello visto in vivo 18. Unicamente, la cultura organo metatarso consente l&#39;esame dei condrociti in diverse fasi di condrogenesi e mantiene cellula-cellula e cellula-matrice interazioni, fornendo quindi condizioni più prossime alla situazione in vivo di cellule in coltura 19-21. Inoltre, questo modello consente esame diretto della crescita ossea lineare che non è possibile in colture di condrociti primari. Esso permette anche la separazione dei fattori sistemici e locali permettendo quindi l&#39;analisi specifica degli effetti locali sulla piastra di crescita. La cultura del metatarsi permette lo studio di numerosi parametri. misurazioni giornaliere di lunghezza totale e delle regioni di mineralizzatii rudimenti possono essere eseguite con microscopio a contrasto di fase di serie e il software di analisi delle immagini. Istologica, ibridazione in situ e la colorazione immunoistochimica può essere facilmente eseguita su sezioni metatarsali, che permette la risoluzione spaziale di entrambe le entità cellulari e molecolari, un importante vantaggio rispetto ai metodi tradizionali di coltura cellulare. L&#39;approccio immunoistochimica include il rilevamento e la quantificazione di 5-bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) assorbimento da proliferazione condrociti 22. Inoltre, ulteriore trattamento di tessuti metatarsali può essere effettuato per consentire un&#39;analisi valle di mRNA (RT-qPCR), proteine ​​e analisi segnale intracellulare (Western blotting) o la composizione lipidica (spettrometria di massa). La maggior parte degli studi fino ad oggi utilizzano metatarsi embrionali in coltura piuttosto che metatarsi da animali post-natale. Mentre entrambi i modelli possono essere informativo, lo studio delle ossa embrionali ha diversi vantaggi: crescono più velocemente e può essere exploited per studiare l&#39;inizio e la progressione del 23-25 processo di mineralizzazione. Questo protocollo descrive in dettaglio la dissezione intricata di metatarsi embrionali dalla dell&#39;arto posteriore di giorno embrionale 15 (E15) embrioni murini. Inoltre, viene mostrato la crescita e la mineralizzazione dei metatarsi anatomicamente distinte.

<table><tbody><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #4</td> World <td>Precision Instruments</td><td>500339</td><td>sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Forbici SuperFine Vannas</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td>501778</tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Diluire al 70% v/v in dH2O</td></tr><tr><td>&alfa;-MEM senza nucleosidi</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>22561021</tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringhe (0,22 &mu; m)</td><td>Millipore Merck diametro</td> 33 mm <td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di fosfocolina sale di calcio tetraidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Aggiungere direttamente al terreno prima della sperimentazione</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico-2-fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Confezione da brodo a 5mg/ml e aliquota a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Confezione stock soution a 150mM e aliquota a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sale disodico idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Confezione scorta a 1mM e aliquota a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710049</tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td>15290018</tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti trattate con colture cellulari Nunc</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura della murini embrionali metatarso: un modello fisiologico di endocondrale ossificazione

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Il processo fondamentale dell'ossificazione endocondrale è sotto stretta regolamentazione nell'individuo sano in modo da prevenire lo sviluppo disturbato e/o la crescita ossea longitudinale. Pertanto, è imperativo approfondire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di tali disturbi in modo da fornire progressi verso il beneficio per i pazienti umani e animali. La coltura di espiantazione di organi metatarsali di topo è un modello ex vivo altamente fisiologico per lo studio dell'ossificazione endocondrale e della crescita ossea poiché il tasso di crescita delle ossa in coltura imita quello osservato in vivo. In modo univoco, la coltura di organi metatarsali consente l'esame dei condrociti in diverse fasi della condrogenesi e mantiene le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice, fornendo quindi condizioni più vicine alla situazione in vivo rispetto alle cellule in monostrato o in coltura 3D. Questo protocollo descrive in dettaglio l'intricata dissezione dei metatarsi embrionali dall'arto posteriore di embrioni murini E15 e le successive analisi che possono essere eseguite per esaminare l'ossificazione endocondrale e la crescita ossea longitudinale.

Lo scopo di questo metodo è per isolare metatarsi e li cultura embrionali per l&#39;esame della crescita ossea longitudinale ed ECM mineralizzazione. Utilizzando il nostro protocollo qui descritto, ossa del metatarso embrionali sono stati sezionati con successo, come visualizzato al microscopio ottico. Misure di ossa metatarsali, condotti come indicato nella figura 1, hanno mostrato la loro capacità di crescere in lunghezza longitudinale ed mineralizzare loro ECM (figure 2 e 3). Mineralizzazione della matrice viene prima osservato nella metà diafisi del rudiment dell&#39;osso ed è facilmente osservata al microscopio ottico. Nessuna colorazione è richiesto anche se l&#39;assorbimento di calceina può offrire una migliore visualizzazione del minerale di nuova formazione. Gli studi che utilizzano metatarsi embrionali per data 22,27,28 hanno messo in comune la sezionato 2 °, 3 ° e 4 ° (CENtrali tre) metatarsi, assumendo in crescita in vitro e la mineralizzazione per essere comparabili. In vivo dello sviluppo di metatarsi murini, tuttavia, rivela che i 3 ° e 4 ° cifre hanno evidenza di mineralizzazione prima di tutti gli altri metatarsi e falangi 29. Valutazione del potenziale di crescita e la mineralizzazione della singolarmente isolate e coltivate E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso ha rivelato differenze significative nella comparsa o alla portata di mineralizzazione dopo 7 giorni di coltura (Figura 2). Nessuna differenza nella percentuale di aumento dal basale è stata rilevata durante il periodo di coltura. Come è stato notato differenze nel potenziale di mineralizzazione il protocollo standard di mettere in comune i 2 ° 3 ° e 4 ° metatarso appare valida per gli studi futuri. Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mediautilizzato per cultura metatarsi embrionali per promuovere ECM mineralizzazione. Tuttavia, in studi di coltura cellulare, è stato dimostrato che se TNAP enzima viene aggiunto al supporto osteogeniche contenenti βGP, ectopica deposizione minerale idrossiapatite persiste anche in assenza di cellule 30. Per esaminare gli effetti dei vari substrati di mineralizzazione e agonisti sulla capacità metatarso mineralizzazione, abbiamo colto metatarsi E15 in terreni di coltura contenente una gamma di integratori, e le immagini e le misure di lunghezza sono stati registrati tutti i giorni. I risultati hanno indicato che la E15 ossa del metatarso ancora crescere e mineralizzano la ECM, in assenza di βGP. E15 metatarsale coltivate in acido ascorbico solo media hanno mostrato aumenti comparabili lunghezza e mineralizzazione come metatarsi coltivate in presenza di βGP (figura 3). Abbiamo anche dimostrato che lentivirus può essere utilizzato per trasfettare DNA esogeno in Metata coltarsals. Qui abbiamo trasfettato con successo ossa del metatarso del giorno 0 della cultura (cioè giorno di dissezione) con 2 x 10 6 verdi particelle virali proteina fluorescente (GFP) per metatarso. Per abilitare la trasduzione del virus, polibrene è stato contemporaneamente aggiunta alle culture a 1: 500. Le colture sono state lasciate per 7 giorni, senza modifiche di supporto come richiesto per E15 metatarso mineralizzazione a verificarsi, prima di essere incubate con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia per 5 minuti e poi direttamente visualizzati utilizzando un microscopio confocale ( Figura 4). La nostra prova di esperimenti concettuali mostrano chiaramente trasduzione efficace. Tuttavia sarebbe opportuno esaminare sezioni durante l&#39;interezza del metatarso per valutarne la trasfezione ed efficace manipolazione genetica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figura 1: metodologia standard usato per misurare tegli lunghezza e la mineralizzazione zona di embrionali Metatarso. (A) Misure totali di lunghezza di metatarsi E15 il giorno 0 della cultura (giorno di dissezione) presa attraverso il centro del metatarso. (B) Le misure di lunghezza longitudinale totale di un metatarso dopo sette giorni in coltura. Si noti la leggera curvatura del metatarso. (C) Misurazione della lunghezza della zona di mineralizzazione dopo sette giorni di coltura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figura 2: crescita e mineralizzazione capacità di anatomicamente distinto E15 Metatarso Imaging e misura del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso dalla dell&#39;arto posteriore di topi E15 w.interpretato. (A) le immagini seriali del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per tutto il periodo di coltura. (B) Aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 ad ogni giorno di coltura. (C) Lunghezza minerale del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarsi nel periodo di coltura espresso come percentuale della lunghezza totale metatarso. Dati in sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). (D) C57Bl / 6J metatarsali lunghezze in ogni giorno della cultura. Dati in sono rappresentati come media ± deviazione standard (n = 6). Nero bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figura 3: la crescita e la mineralizzazione capacità di Wild-typeE15 Metatarsi coltivate in vari media Osteogenic. (A) le immagini seriali di metatarsi coltivate in acido ascorbico solo 1 mm βGP 3 mm phosphocholine, cloruro di calcio 1,5 mm o cloruro di calcio 3 mM contenente supporti. (B) aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 del metatarso coltivate con i vari supplementi. (C) Lunghezza minerale di metatarsi coltivate in vari media espressa come percentuale della lunghezza totale metatarso. I dati sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). Nero bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figura 4: Transfection di E15 Metatarso con GFP virus Particoli. ossa del metatarso (A) E15 sono state trasfettate con particelle virali GFP per proof of concept. (B) Le ossa sono state colorate con DAPI per la visualizzazione del DNA. (C) Due immagini indicate trasfezione successo del virus GFP tutta la totalità delle ossa del metatarso. Barre bianche = 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un protocollo per sezionare e coltivare ossa metatarsali murine embrionali del giorno 15 (E15). Questo modello ex vivo altamente fisiologico di ossificazione endocondrale fornisce condizioni più vicine alla situazione in vivo rispetto alle cellule in monostrato o in coltura 3D ed è uno strumento vitale per studiare la crescita e lo sviluppo osseo.

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare e coltivare metatarsali da topi embrionali per fornire un modello ex vivo che permetta lo studio della crescita endocondrale delle ossa e della mineralizzazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sull'ossificazione endocondrale, il processo attraverso il quale le ossa lunghe crescono. In particolare, si presta bene a indagare i meccanismi che regolano l'inizio della mineralizzazione scheletrica.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce, grazie al mantenimento delle interazioni tra cellula e cellula e tra cellula e matrice, un modello più fisiologico di ossificazione endocondrale rispetto alle cellule coltivate in 2D o in 3D. Per iniziare, preparare il mezzo di dissezione diluendo il mezzo essenziale minimo alfa uno a 13 in PBS. Successivamente, risospendere l'albumina sierica bovina (BSA) a due milligrammi per millilitro e quindi sterilizzarla per filtrazione attraverso un filtro a siringa.Quindi, preparare il mezzo di coltura e sterilizzarlo per filtrazione utilizzando lo stesso tipo di filtro per siringa usato per la BSA. Dopo aver filtrato il mezzo di coltura, aggiungere 300 microlitri di mezzo di coltura in ogni pozzetto di una piastra da coltura a 24 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra da coltura a 24 pozzetti con il mezzo di coltura e il mezzo di dissezione in un incubatore per almeno un'ora per permettere l'equilibrazione.Quindi, immergere l'equipaggiamento per dissezione sterilizzato in autoclave in etanolo al 70%. Ottenere embrioni C57 black 6J di tipo selvatico E15 come descritto nel protocollo testuale allegato e posizionarli in una piastra di Petri contenente mezzo di dissezione. Dopo la decapitazione, lavare la pelle con etanolo al 70% e utilizzare forbici microchirurgiche di Vannas per rimuovere gli arti posteriori dagli embrioni effettuando un'incisione intorno al femore prossimale.Questo garantisce che venga rimossa la maggior parte possibile dell'arto posteriore. Posizionare gli arti posteriori in una capsula di Petri e immergerli nel mezzo di dissezione prima della dissezione dei metatarsi. Successivamente, posizionarli sotto un microscopio stereoscopico.Utilizzare una pinzetta numero quattro per tenere ferma l'arto mentre si usa una pinzetta numero cinque per rimuovere la pelle che circonda il piede embrionale. Questa operazione viene eseguita in modo più efficace afferrando la pelle a livello approssimativo della tibia e tirando verso le falangi. Successivamente, utilizzare la pinzetta numero quattro per trattenere con cura i tarso del piede embrionale mentre si usa la pinzetta numero cinque per rimuovere e scartare il primo e il quinto metatarso.Tenendo il piede nella stessa posizione, utilizzare la pinzetta numero cinque per interrompere i tessuti connettivi tra le tre falangi rimanenti e le metatarsali. Successivamente, inserire la punta della pinzetta numero cinque all'articolazione tra le falangi e le metatarsali per rimuovere le falangi dalle metatarsali. Infine, utilizzare la pinzetta numero cinque per interrompere i tessuti connettivi tra le tarsali e le metatarsali.Posizionare nuovamente la punta della pinzetta numero cinque nello spazio articolare tra tarso e metatarso e staccare delicatamente il metatarso dal tarso. Successivamente, prendere con cura il metatarso ormai libero con la pinzetta numero quattro e posizionarlo in un mezzo di dissezione fresco. È fondamentale che i metatarsi embrionali non subiscano danni né si secchino durante le fasi di dissezione e manipolazione.I danni ai metatarsali ne compromettono la crescita e la mineralizzazione. Tutti i tessuti molli residui si staccheranno dai metatarsali durante la coltura, quindi non preoccuparsi eccessivamente della loro rimozione completa durante la dissezione. Una volta dissecati tutti i metatarsali necessari, posizionarli con attenzione singolarmente nella piastra da 24 pozzetti preriscaldata contenente 300 microlitri di mezzo di coltura.Successivamente, effettuare misurazioni longitudinali iniziali utilizzando un microscopio dotato di una fotocamera digitale e di un software di analisi delle immagini. Coltivare i metatarsi fino a 14 giorni. Tuttavia, non cambiare il mezzo di coltura delle colture E15 fino al quinto giorno di coltura almeno, poiché ciò influisce sulla loro capacità di mineralizzazione.Dopo alcuni giorni di coltura, misurare la lunghezza della zona centrale di mineralizzazione quando appare. Dopo alcuni giorni di coltura, la mineralizzazione della matrice avviene nella metafisi media del rudimento osseo ed è facilmente osservabile mediante microscopia ottica. Il secondo, terzo e quarto metatarso sono spesso raggruppati per studi embriologici.Durante sette giorni di coltura, il secondo, terzo e quarto metatarso non hanno mostrato differenze significative nell'aspetto o nell'estensione della mineralizzazione, confermando questa pratica. Per esaminare gli effetti di diversi substrati e agonisti di mineralizzazione sulla capacità di mineralizzazione dei metatarsi, i metatarsi di E15 sono stati coltivati in mezzi contenenti una serie di supplementi come mostrato qui. Le immagini e le misurazioni della lunghezza sono state registrate giornalmente.Tra tutti i substrati testati, l'acido ascorbico ha aumentato maggiormente la lunghezza del minerale, con un effetto paragonabile a quello del beta-glicerofosfato. La trasfezione con lentivirus del plasmide GFP in metatarsi di E15 ha determinato l'espressione di GFP in tutto il metatarso. Ciò evidenzia l'utilizzo del lentivirus per trasfettare con successo metatarsi embrionali.Questa tecnica può essere utilizzata anche per ridurre o sovraesprimere geni bersaglio. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale ricordare che le metatarsali di embrione E15 sono estremamente fragili. L'integrità della metatarsale è fondamentale per il successo della coltura successiva.Dopo la dissezione e la coltura dei metatarsi a E15, è possibile eseguire numerose analisi successive. Ad esempio, l'espressione di mRNA e di proteine può essere valutata mediante RTQPCR e Western blotting, rispettivamente. Inoltre, l'immunohistochimica può essere utilizzata per localizzare le proteine all'interno del metatarso.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare correttamente le metatarsali dagli arti posteriori di topi al giorno embrionale 15. Questo metodo può essere adattato alle metatarsali di topi al giorno embrionale 17 o 18, che risultano più utili per lo studio della crescita ossea.

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Biologia dello sviluppo

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Impara a dissecare e coltivare i metatarsi embrionali di topo per studiare l'ossificazione endocondrale. Questo metodo fisiologico es vivo permette di analizzare la mineralizzazione scheletrica e la crescita ossea in condizioni simili all'ambiente in vivo.

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

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