Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli eventi di segnalazione indotti e le cellule di risposta vitali a seguito della loro interazione fisica con le cellule morte vicine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia cellulare, della patologia e della fisiologia, come l'influenza che le cellule morte o morenti esercitano sui loro vicini vivi. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è semplice e poco costosa e che può essere applicata per studiare gli effetti biologici indotti nelle cellule vive in seguito alla loro interazione con le cellule vicine in fase di apoptosi.

A dimostrare la tecnica sarà Lanfei Feng, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, dopo aver passato le cellule BUNPT su piastre di coltura tissutale trattate con plasma sottovuoto da 100 millimetri, coltivarle nel terreno di coltura A alla confluenza e in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Successivamente, sciacquare il monostrato di cellule aderenti tre volte con il terreno di coltura B.Quindi, indurre l'apoptosi incubando le cellule nel terreno di coltura B, contenente staurosporina, un inibitore non selettivo della proteina chinasi, per 3 ore a 37 gradi Celsius.

Dopo 3 ore, raccogliere il terreno contenente le cellule apoptotiche galleggianti che si sono staccate dal monostrato. Successivamente, centrifugare questo terreno per dieci minuti a 500 volte G.Successivamente, scartare il surnatante, lavare il pellet tre volte con il terreno di coltura B, prima di aggiungerlo nuovamente alle cellule aderenti. Dopo questa fase di lavaggio, staccare le cellule aderenti rimanenti aggiungendo 5 millimolari di EDTA in DPBS 1X privo di calcio e magnesio.

Raccogliere il terreno contenente le cellule apoptotiche staccate e mettere le cellule staccate con le cellule apoptotiche galleggianti in una provetta da centrifuga sterile in polistirene da 15 millilitri. Quindi lavare le cellule apoptotiche tre volte mediante centrifugazione per dieci minuti a 500 x G.Seguito da risospensione in dieci millilitri di DPBS 1X privo di calcio e magnesio per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere le cellule apoptotiche nel terreno di coltura fresco B a 5x10^6 cellule per millilitro, prima di utilizzarle per stimolare le cellule responder.

In alternativa, fissare le cellule apoptotiche lavate in paraformaldeide 0,4 in 1X DPBS per 30 minuti, quindi lavarle tre volte con il terreno di coltura B e sospenderle in esso a 5x10^6 cellule per millilitro prima di utilizzarle per stimolare le cellule responder. Dopo aver passato le cellule BUNPT su piastre di coltura tissutale trattate con plasma di polistirene sterile sottovuoto di 100 millimetri di diametro, farle crescere fino alla confluenza e all'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica in condizioni permissive. Quindi risciacquare il monostrato di cellule aderenti tre volte con 10 ml di terreno di coltura B per risciacquo.

Successivamente, staccare le cellule aggiungendo 5 mM EDTA in DPBS 1X senza calcio e magnesio. Raccogliere le cellule staccate dal terreno contenente EDTA e aggiungere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga sterile in polistirene da 15 mL. Successivamente, lavare le cellule tre volte mediante centrifugazione per dieci minuti a 500 volte G e risospensione in 10 mL di DPBS privo di calcio e magnesio per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere le cellule nel terreno di coltura fresco B a 5x10^6 cellule per millilitro. Successivamente, indurre la necrosi riscaldando le cellule a 70 gradi Celsius per 45 minuti in un bagno d'acqua, agitando delicatamente questa sospensione cellulare ogni dieci minuti. Dopo l'induzione della necrosi, incubare le cellule per due ore in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius e agitare delicatamente la sospensione cellulare ogni 15 minuti.

In questa procedura, far crescere le cellule BUNPT in piastre sterili di coltura tissutale da 100 millimetri in condizioni permissive, fino a raggiungere circa l'85% di confluenza. Successivamente, aspirare il terreno di coltura A e sciacquare le cellule tre volte con 10 ml di terreno di coltura B per risciacquo. Quindi, il siero affama le cellule nel terreno di coltura B per 18-24 ore in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica in condizioni non permissive, al fine di indurre la quiescenza.

Etichettare un piatto di coltura tissutale separato di cellule BUNPT confluenti per le sei condizioni sperimentali per la procedura successiva. Ora, aspirare il terreno di coltura B dalle piastre pre-marcate delle cellule responder BUNPT quiescenti. Per preparare le piastre da 100 millimetri in condizioni diverse, aggiungere due mL di terreno di coltura B senza cellule, la sospensione cellulare apoptotica a 5X10^6 cellule per millilitro nel terreno di coltura B o la sospensione cellulare necrotica a 5X10^6 cellule per mL nel terreno di coltura B.Ottenere un rapporto tra cellule morte e cellule responder di uno a uno aggiungendo a mL di cellule morte a 5X10^6 cellule per millilitro a piatto confluente da 100 millimetri, che contiene 10X10^6 celle.

Agitare delicatamente i piatti. Quindi incubarli a 37 gradi Celsius nell'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica. Dopo 30 minuti, stimolare le cellule responder con veicolo o EGF 15 nMOL, secondo la pre-marcatura del piatto di coltura.

Incubare le cellule per 15 minuti a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica. Successivamente, lava via le cellule morte aggiungendo cinque millimetri di DPBS ghiacciato. Agitare il piatto e aspirare il liquido di lavaggio.

Ripetere il lavaggio tre volte. Quindi posizionare immediatamente le piastre della cellula di risposta sul ghiaccio per un'ulteriore elaborazione. Questa figura mostra che l'esposizione di responder BUNPT quiescenti a cellule apoptotiche per 30 minuti ha fortemente inibito la fosforilazione basale di GSK3 alfa beta.

Per prevenire l'interazione fisica tra i responder BUNPT e le cellule apoptotiche, i responder BUNPT sono stati coltivati in un sistema di supporto permeabile e separati dai bersagli apoptotici da una membrana in policarbonato da 0,4 micron. La prevenzione dell'interazione fisica tra i responder BUNPT e le cellule apoptotiche ha abolito la capacità dei bersagli apoptotici di inibire la fosforilazione di GSK3 alfa beta. Per valutare il ruolo della fagocitosi, l'inibitore del citoscheletro Citocalasina D è stato utilizzato per prevenire l'assorbimento fagocitario delle cellule morte.

L'inibizione della fosforilazione di GSK3 alfa beta in risposta alle cellule apoptotiche si è verificata in assenza di fagocitosi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 4-6 ore se eseguita correttamente, escludendo il tempo necessario per l'elettroforesi su gel e l'immunoblotting. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'utilizzo di una sospensione cellulare al contrario di un ligando solubile come stimolo pone diversi ostacoli sperimentali intrinseci e in gran parte inevitabili.

Utilizzando la stessa procedura, si possono studiare altre funzioni cellulari, come la sopravvivenza o la proliferazione o la crescita cellulare, al fine di determinare le conseguenze funzionali degli eventi di segnalazione che vengono indotti nelle cellule vive che rispondono in seguito alla loro interazione con le cellule morte vicine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare specifici eventi di segnalazione che vengono indotti nelle cellule di risposta vitali in seguito alla loro interazione fisica con le cellule morte vicine.