Name: Co-localización de los marcadores de linaje de la célula y la señal de tomate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprende trazado de linaje celular con inmunofluorescencia para estudiar la transformación de condrocitos en células óseas en ratones Rosa26 tdtomato/Cre. Este método revela el destino celular durante la endocondrogenesis in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudio fue financiado por la subvención de los NIH DE025014 a JQF.

Todos los protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Texas A &amp; M University College of Dentistry. Cría de Animales 1. <ol><li> Use tres modelos animales en este estudio. Para investigar el destino de los condrocitos embrionarios en la formación de cóndilo, primer uso Col10a1 Cre-15 ratones y cruzarlos con Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) para obtener ratones Col10a1- Cre ratones y Rosa26 tdTomato. A continuación, cruzar estos ratones con ratones 2.3Col1a1 16-GFP. Utilice Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; Ratones 2.3Col1a1-GFP para llevar a cabo los experimentos de rastreo de linaje de células (Figura 1B). </li><li> Para estudiar el destino de los condrocitos postnatales, siga el mismo procedimiento que en el paso 1.1, pero el uso de la ERT2 Aggrecan cre-(Agg-Cre ERT2) 17,18 línea y mantener la AGG-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; Ratones 2.3Col1a1-GFP para llevar a cabo los experimentos de rastreo de linaje de células (Figura 1C). Inyectar el tamoxifeno en el día postnatal 14. </li><li> Para combinar el linaje de células trazando técnica de inmunofluorescencia, cruzar ratones Agg-Cre ERT2 y ratones Rosa26 tdTomato. Utilice los ratones que llevan ambos genes en el experimento e inyectar el tamoxifeno en el día postnatal 3 (Figura 1D). </li></ol> 2. Preparación de materiales <ol><li> Disolver el polvo tamoxifeno en 10% de etanol y aceite de maíz 90% a una concentración de 10 mg / ml. La dosis para la inyección es de 75 mg / kg. </li><li> Disolver el polvo de paraformaldehído (PFA) en PBS a una concentración de 4%, utilizando hidrato de sodio 2 M para ajustar el valor pH a 7,4. Use la solución PFA 4% para fijar el tejido (el cóndilo mandibular y la pata trasera se utilizan aquí) después del sacrificio. Debido a sutoxicidad, manejar PFA en la campana con guantes y una mascarilla. </li><li> Disolver el polvo EDTA en agua destilada a una concentración de 10%, utilizando hidrato de sodio 2 M para ajustar el valor pH a 7,4. Utilice 10% EDTA para descalcificar el cóndilo mandibular y la pata trasera. </li><li> Disuelva el polvo de sacarosa en PBS a concentraciones de 15% y 30%. Utilice la solución de sacarosa para deshidratar el tejido después de la descalcificación. </li><li> Disolver el polvo hialuronidasa en PBS a una concentración de 2 mg / ml, pH 5,0. Esta solución es para la recuperación de antígeno por inmunofluorescencia. </li><li> Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de bloqueo que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y suero de cabra al 20% en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia. </li><li> Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de anticuerpo primario que contiene 2% de suero de cabra en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia. La concentración del anticuerpo primario es de 1: 400 para Runx2 y 1: 100 para DMP1. </li><li> Use un tubo de 1,5 ml para prepararla solución de IgG de conejo como el control para la tinción de inmunofluorescencia para evitar resultados falsos positivos. La solución contiene 2% de suero de cabra en PBS. La concentración de la IgG de conejo para el control Runx2 es 1: 400; para DMP1, 1: 100. Realizar el experimento y el control de la tinción de forma simultánea. </li><li> Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de anticuerpo secundario que contiene 2% de suero de cabra en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia. Utilice el anticuerpo secundario a una dilución de 1: 500. </li></ol> 3. Preparación de los portaobjetos de microscopía confocal (linaje celular rastreo solamente, ninguna combinación con inmunofluorescencia) <ol><li> Inyectar el tamoxifeno en el cre-Agg ERT2 ratones en un punto de tiempo favorable. <ol><li> En primer lugar, eliminar un ratón de su jaula. A continuación, utilice el pulgar y el dedo índice izquierdo para agarrar la piel en la parte posterior del ratón y darle la vuelta, dejando al descubierto el abdomen. Utilice la mano derecha para sostener la jeringa. El punto de entrada óptimo para la inyección es en la lEFT oa la derecha de hipogastrio, evitando el hígado y la vesícula. </li><li> Mantener la jeringa en paralelo a las patas traseras del ratón y se inyecta por vía intraperitoneal. La dosis para la inyección es de 75 mg / kg. Los pesos de los ratones a las edades de 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas de edad son aproximadamente 7 - 9 g, 11 - 13 g, y 16 - 18 g, respectivamente. </li></ol></li><li> Anestesiar a los ratones con una combinación xilazina / Ketaset. <ol><li> Para preparar la solución de trabajo, diluir primero la xilazina y Ketaset con agua destilada a una concentración de 1 mg / ml y 5 mg / ml, respectivamente. A continuación, mezclar la xilazina y Ketaset en una proporción de 1: 2. La dosificación para inyección es 30 l / g. </li><li> Inyectar como en el paso 3.1. Confirmar la anestesia pellizcando el tobillo del ratón. El ratón está inconsciente si no tiene una reacción. </li></ol></li><li> Perfundir los ratones con PFA al 4% después de la anestesia. <ol><li> Después de que el ratón pierde la conciencia, fijar las cuatro patas del ratón sobre una tabla de entirely exponer el abdomen. </li><li> Saturar el abdomen con un 70% de etanol y hacer una escisión de la parte inferior del abdomen hasta el cuello a lo largo de la línea media. Pellizcar y simultáneamente tirar de la piel a los lados laterales para revelar la membrana peritoneal. Use las tijeras de disección para hacer una escisión longitudinal. </li><li> Cortar y quitar las costillas delanteras para exponer el corazón. Perforar el corazón del ventrículo izquierdo con una jeringa de 22 G, mantenga la jeringa, y al mismo tiempo cortar una ranura en la aurícula derecha. </li><li> Lentamente inyectar el 4% PFA, que se perfundió a lo largo del sistema cardiovascular mientras que los rubores de sangre fuera del corte de la aurícula derecha. El volumen de la PFA para la perfusión es 1 ml / gramo. Realice este paso en una cabina de bioseguridad de Clase I que es difícil de tuberías para el sistema de salida del edificio. </li></ol></li><li> Retire la piel del ratón y puso todo el cuerpo en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml que contiene 40 ml de PFA al 4% para fijar la noche a 4 ° C. </li><li>Use las tijeras de disección y # 3 y # 5 pinzas para retirar con cuidado la mandíbula y la pata trasera del cuerpo y para eliminar los músculos y los tendones en la superficie. Realice este paso en una cabina de bioseguridad de Clase I que es difícil de tuberías para el sistema de salida del edificio. </li><li> Cortar la mandíbula en dos artículos en la región distal del tercer molar. Del mismo modo, cortar el fémur y la tibia en la mitad del tallo para exponer la cavidad de la médula ósea a fin de acelerar la descalcificación. Ponga la parte que incluye el proceso cóndilo y condilar y junto con la pata trasera en 40 ml de 10% de EDTA para descalcificar a 4 ° C durante 2 - 4 días en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. </li><li> Usar 50 ml de 15% de sacarosa para deshidratar el cóndilo y la pata trasera durante la noche a 4 ° C en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. </li><li> Utilice 30% de sacarosa para deshidratar el cóndilo y la pata trasera durante la noche a 4 ° C en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. </li><li> A lo largo del plano sagital, incrustar la muestra conPTU respecto de la placa de corte en la máquina criogénica. <ol><li> Horizontalmente sentar las cóndilo o la pata trasera en el molde de montaje. Sumergir el tejido en OCT y dejarlo en la máquina criogénica hasta la OCT se congela. </li><li> Montar el bloque de PTU respecto de la placa de corte. Esperar aproximadamente 15 min antes de cortar para asegurar que el OCT es completamente congelado. </li></ol></li><li> Cortar el cóndilo y la pata trasera en secciones de 10 micras. Recoger las secciones en portaobjetos y se almacena a -20 ° C. </li><li> Incubar el portaobjetos en una cámara de 37 ° C para eliminar el agua antes de la tinción. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con agua destilada durante 5 minutos. </li><li> Limpiar el agua alrededor de cada sección. Utilice un bolígrafo barrera hidrofóbica para rodear las secciones y soltar DAPI o solución de montaje anti-fade no fluorescente en el círculo. Coloque con cuidado por la hoja de la cubierta. </li></ol> 4. La tinción inmunohistoquímica para Runx2 y DMP1 NOTA: El aire IgGcontrol es necesario para la tinción inmunohistoquímica para evitar falsos positivos señales. La tinción de los grupos experimentales y de control necesita ser realizado simultáneamente. <ol><li> Incubar los portaobjetos en una cámara de 37 ° C para eliminar el agua antes de la tinción. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con agua destilada. </li><li> Utilice el lápiz barrera hidrofóbica que encuentre todos los tramos de la diapositiva. A partir de este paso, añadir toda la solución preparada en el círculo para cubrir completamente las secciones. </li><li> Tratar las secciones con hialuronidasa en una cámara húmeda a 37 ° C durante 30 min. El volumen de la solución (en pasos de 4,5 - 4,8) depende del tamaño de la sección. Utilice 50 l de solución para el cóndilo y 100 l para el hueso largo. Lavar con PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween 20) tres veces. </li><li> Preparar y aplicar la solución de bloqueo a cada sección y se incuba en una cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Se incuban las secciones con primariasolución de anticuerpo (Runx2 de conejo anti-ratón o de conejo anti-ratón DMP1) a 4 ° C durante la noche. Lavar con PBS tres veces. </li><li> Se incuban las secciones con solución de anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo, Alexa Fluor 488) durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar con PBS tres veces. </li><li> Limpiar el agua alrededor de la sección y soltar DAPI en el círculo para cubrir la sección en la diapositiva. Coloque con cuidado por la hoja de la cubierta. </li></ol> 5. Microscopía Confocal <ol><li> Captura de imágenes de células fluorescentes usando un microscopio confocal en longitudes de onda que van de 488 micras (verde) a 561 micras (rojo). Tomar varias imágenes apiladas a 200 Hz (dimensiones de 1.024 x 1.024) 19 utilizando 10X, 20X, 63X y lentes. </li></ol>

<ol><li>Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+role+of+chondrocyte+apoptosis+in+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification.</a> Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li>
<li>Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+hypertrophic+chondrocyte%3A+microenvironmental+perspectives+on+apoptosis+and+survival+in+the+epiphyseal+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).</li>
<li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte-to-osteocyte+transformation+in+grafts+of+perichondrium-free+epiphyseal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage.</a> Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).</li>
<li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-differentiation+of+hypertrophic+chondrocytes+into+cells+capable+of+producing+a+mineralized+bone+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Miner%22%5BJournal%5D)">Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix.</a> Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts%3A+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li>
<li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).</li>
<li>Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-tracing+methods+and+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Lineage-tracing methods and the kidney.</a> Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).</li>
<li>Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lineage+tracing+to+study+kidney+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration.</a> Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+fate+of+hypertrophic+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes.</a> Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).</li>
<li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li>
<li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+Directly+Transform+into+Bone+Cells+in+Mandibular+Condyle+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth.</a> J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).</li>
<li>Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development%2C+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genet. 10 (12), (2014).</li>
<li>Purcell, P., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mighty+Chondrocyte%3A+No+Bones+about+It%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Mighty Chondrocyte: No Bones about It.</a> J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).</li>
<li>Gebhard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+Cre+recombinase+in+hypertrophic+cartilage+under+the+control+of+a+BAC-Col10a1+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter.</a> Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+the+expression+of+a+green+fluorescent+protein+transgene+in+differentiated+osteoblasts%3A+comparison+between+rat+type+I+collagen+and+rat+osteocalcin+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters.</a> Bone. 31 (6), 654-660 (2002).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteo-chondroprogenitor+cells+are+derived+from+Sox9+expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).</li>
<li>Henry, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+aggrecan-CreERT2+knockin+mice+for+inducible+Cre+activity+in+adult+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage.</a> Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).</li>
<li>Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+way+to+statistically+analyze+morphologic+changes+in+Dmp1-null+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes.</a> Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).</li>
<li>Pest, M. A., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology%3A+Is+there+such+a+thing+as+a+cartilage-specific+knockout+mouse%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).</li>
<li>Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+growth+plate+hypertrophic+chondrocytes%3A+death+or+lineage+extension%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?</a> Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).</li>
<li>Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ScxCre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ScxCre transgenic mice.</a> Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+conditional+null+allele+for+Dmp1+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse.</a> Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMP1-targeted+Cre+expression+in+odontoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes.</a> J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li>
<li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).</li>
<li>Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tamoxifen+induces+rapid%2C+reversible+atrophy%2C+and+metaplasia+in+mouse+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach.</a> Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).</li>
<li>Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+murine+hepatic+steatosis+induced+by+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen.</a> Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).</li>
<li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER%28T%29+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.

Debido a las limitaciones tecnológicas, siempre es difícil de investigar el comportamiento de las células in vivo. Sin embargo, la técnica de rastreo de linaje celular está demostrando ser una herramienta poderosa para el estudio de la biología celular 7-9. En este estudio, podemos mejorar aún más este protocolo mediante la combinación con inmunofluorescencia. De esta manera, el destino celular puede ser definido por múltiples marcadores relacionados, que amplía la aplicación de rastreo de linaje. Po...

Durante el desarrollo, la formación de hueso endocondral representa más del 80% del volumen esquelético. Se cree ampliamente que comienza con la apoptosis de los condrocitos hipertróficos. Posteriormente, las células de la médula ósea subyacente invaden y iniciar la angiogénesis, seguido por la deposición de hueso nuevo por marrow- ósea y células derivadas de periostio 1,2. El destino celular de condrocitos hipertróficos (HC), sin embargo, ha sido un tema de debate durante décadas 3. Inicialmente, los HC se considera que el final de la vía de diferenciación de condrocitos, y la apoptosis en general se piensa que es el destino final de los HC. Ahora, algunos investigadores sugieren que al menos algunos HC podrían sobrevivir y contribuir a la formación de hueso endocondral. A pesar de que propusieron que el crecimiento de condrocitos placa tenían la capacidad de transdifferentiate en osteoblastos sobre la base de ultraestructura, tinción inmunohistoquímica, y los estudios in vitro de 46 años, ninguno de estos métodos were definitiva para demostrar la contribución de los condrocitos al linaje de osteoblastos. La técnica de rastreo de linaje celular proporciona una manera más rigurosa para estudiar el destino celular. En pocas palabras, una enzima recombinasa, que sólo se expresa en un tipo específico de célula, estimula la expresión del gen reportero. De esta manera, este tipo de células y sus descendientes son etiquetados de forma permanente 7. El sistema Cre-loxP se utiliza comúnmente en el rastreo de linaje. Cre (la enzima recombinasa) será escindir la secuencia de parada entre los dos sitios loxP y activar el reportero en una línea celular específica (Figura 1A). En algunos casos, el investigador puede elegir un punto de tiempo favorable para activar Cre mediante el uso de un fármaco, tal como tamoxifeno, causando Cre para fusionar a una forma modificada del receptor de estrógeno (Cre ERT2) 8. reporteros fluorescentes han convertido en el estándar en el linaje de rastreo experimentos, ya que reducen drásticamente la complejidady mejorar la precisión y la eficiencia de la celda destino de rastreo 8,9. tdTomato se está convirtiendo en la mejor elección entre los reporteros fluorescentes ya que tiene la proteína fluorescente más brillante y la más fuerte de epifluorescencia, lo que es fácilmente visualizada 7 (Figura 1A). Al utilizar el linaje Rosa26 tdTomato sistema de rastreo, nuestro grupo y otros investigadores han demostrado que los HC puede cambiar su fenotipo en células óseas durante el desarrollo 10-14. Para lograr esto, hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones con Rosa26 tdtomato (expresión ubicua en todas las células) / Cre (específico de condrocitos) ratones: 2.3Col1a1-GFP (específico de osteoblastos) e inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran que ambos métodos son formas viables para estudiar el destino de células in vivo.

<table><tbody><tr><td>Tamoxifeno &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>activar el evento Cre&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td>fijar la muestra</td></tr><tr><td>Etilendiaminotetraacético</td><td>ácido Alfa Aesar</td><td>A10713</td><td>descalcificar el tejido duro</td></tr><tr><td>Sacarosa &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>deshidrata el tejido</td></tr><tr><td>hialuronidasa de testículos bovinos&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>recuperar el antígeno para la tinción inmunoquímica de la</td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina</td><td>Sigma&nbsp;</td>Solución de bloqueo <td>A3059</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anticuerpo primario para Runx2&nbsp;</td><td>Señal celular</td><td>D1L7F anticuerpo</td><td>primario para tinción inmunoquímica</td></tr><tr><td>anticuerpo primario para DMP1</td><td>proporcionado por el Dr. Chunlin Qin</td><td></td><td>anticuerpo primario para tinción inmunoquímica</td></tr><tr><td>anti-conejo anti-conejo control</td><td></td><td></td><td>para tinción inmunoquímica</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>segundo anticuerpo para tinción inmunoquímica</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>incrustar la muestra para la sección congelada</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>PBST</td></tr><tr><td>montador antidecoloración no fluorescente</td><td>Life technologies</td><td>P36934</td><td>portaobjetos</td></tr><tr><td>de montaje DAPI</td><td>Life technologies</td><td>P36931</td><td>tinción nuclear</td></tr><tr>Los <td>laboratorios</td><td></td> de <td>vectores de pluma de barrera hidrofóbica</td><td>enmarcan en un círculo la sección en el portaobjetos para la tinción inmunoquímica&nbsp;</td></tr><tr>Anestesia con <td>xilacina</td><td>AnaSed</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketaset &nbsp;</td><td>Anestesia Zoetis</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>máquina de criosección</td><td>Leica</td><td>CM1860</td> Microscopio confocal UV <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DM6000 CFS&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

co-localización de los marcadores de linaje de la célula y la señal de tomate

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

El sistema de rastreo de linaje de células se ha utilizado predominantemente en los estudios de biología del desarrollo. El uso de la recombinasa Cre permite la activación del reportero en una línea celular específica y toda la progenie. En este caso, se utilizó la línea celular de rastreo técnica para demostrar que los condrocitos se transforman directamente en los osteoblastos y los osteocitos durante hueso largo y el desarrollo cóndilo mandibular utilizando dos tipos de Cre, Col10a1-Cre y Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), cruzamos con Rosa26 tdTomato. Tanto Col10 y agrecano son marcadores bien reconocidos por los condrocitos. Sobre esta base, hemos desarrollado un nuevo linaje de células método de seguimiento en relación con el destino de células inmunohistoquímica para definir fluorescente mediante el análisis de la expresión de marcadores de células específicas. Runx2 (un marcador de células osteogénicas en fase inicial) y la dentina protein1 matriz (DMP1, un marcador para las células de la última etapa osteogénicas) eranse utiliza para identificar las células óseas de condrocitos derivados y su estado de diferenciación. Esta combinación no sólo amplía la aplicación de rastreo de linaje de células, sino que también simplifica la generación de ratones compuestos. Más importante aún, los estados de número, ubicación, y la diferenciación de la progenie celular parental se muestran simultáneamente, proporcionando más información de la línea celular de rastreo solo. En conclusión, la co-aplicación de técnicas de trazado de linaje celular y de inmunofluorescencia es una herramienta poderosa para la investigación de biología celular in vivo.

Directamente condrocitos se transforman en células óseas (osteoblastos y osteocitos) en el cóndilo mandibular y hueso largo. Aggrecan, un gen crítico para la condrogénesis, se expresa principalmente en los primeros y maduras condrocitos 18. Como resultado, la inyección de tamoxifeno a las 2 semanas de edad en Agg-Cre ERT2; Ratones Rosa26 tdTomato acti...

Hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones en Rosa26 tdtomato (ubicuamente expresado en todas las células) / Cre (expresa específicamente en condrocitos) ratones: uno con 2.3Col1a1-GFP (específico para los osteoblastos) y uno con inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran la transformación directa de los condrocitos en las células óseas.

Co-localización de los marcadores de linaje de la célula y la señal de tomate

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

El objetivo general de esta técnica de rastreo de linaje celular y la posterior inmunofluorescencia es investigar la biología celular y el destino de las células in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular y el desarrollo de tejidos con respecto al origen de las células que forman hueso durante la endocondrogénesis. La principal ventaja de esta técnica es mostrar el número, la ubicación y el estado de diferenciación de la progenie de la célula fundadora simultáneamente, ampliando así la aplicación del rastreo de linaje.Aunque este método proporciona información sobre la transformación de condrocitos en células osteogénicas durante el desarrollo normal, también se puede aplicar a otros tejidos y modelos de enfermedades, como la transformación celular en un tumor. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el corte congelado es difícil y la sección puede despegarse fácilmente durante la tinción. La idea de este método fue cuando nos propusimos demostrar el estado de diferenciación de las células osteogénicas transformadas a partir de crondocitos en el hueso trabecular.Para rastrear el linaje de c

co-localization-of-cell-lineage-markers-and-the-tomato-signal

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

Análisis específico de célula de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Hojas usando citometría de flujo

Describimos aquí un modelo de ratón reportero transgénico para visualizar las células productoras de IL-22 dentro de diferentes tejidos de ratón. Este método se puede utilizar para rastrear la ubicación de otras citocinas o proteínas secretaria en el ratón.

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Aquí, se presenta un protocolo para una técnica de etiquetado mosaico que permite la visualización de las neuronas derivadas de una célula progenitora común en dos colores distintos. Esto facilita el análisis de linaje neural con la capacidad de las neuronas individuales de nacimiento actualización y el estudio de la función de genes en las mismas neuronas de diferentes individuos.

Los análisis de linaje celular y el gen de Estudios de la función Uso MARCM Twin-situ

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Este protocolo presenta cómo viven la imagen y analizar los meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas mediante microscopía confocal de barrido láser.

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios...

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

En este manuscrito, se presenta un protocolo para realizar la medición basada en FACS de la actividad transcripcional BK-polioomavirus mediante el uso de células HEK293T transcritas con un plásmido reportero bidireccional que expresa tdTomato y eGFP. Este método permite además determinar cuantitativamente la influencia de nuevos compuestos en la transcripción viral.

Medición de la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus a través de la citometría de flujo

Se presenta un protocolo para realizar el rastreo de linajes y el análisis genético funcional de genes candidatos a un solo nivel de células utilizando el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM). El análisis clonal de MADM proporciona un marco cuantitativo para medir el comportamiento proliferativo, la producción celular y la relación de linaje de los progenitores individuales y sus células hijas.

Seguimiento de linaje y análisis clonal en el desarrollo de la corteza cerebral mediante el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM)

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Este protocolo describe la selección de marcadores plasmodesmales óptimos para análisis basados en microscopía confocal de proteínas dirigidas a plasmodesmos durante las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal.

Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Aprende trazado de linaje celular con inmunofluorescencia para estudiar la transformación de condrocitos en células óseas en ratones Rosa26 tdtomato/Cre. Este método revela el destino celular durante la endocondrogenesis in vivo.

Co-localización de los marcadores de linaje de la célula y la señal de tomate

Explorar más videos