Name: Un modello di lesioni del midollo spinale contusivo basato sullo spostamento tissutale nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Scopri un modello di lesione contusiva del midollo spinale basato sullo spostamento tissutale nei topi adulti. Questa tecnica offre infortuni riproducibili e graduati per studiare meccanismi e terapie sperimentali.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562; Premio Merit Review I01 BX002356 del Dipartimento degli Affari Esteri degli Stati Uniti; Fondazione Craig H Neilsen 296749; Indiana Spinal Cord e Brain Injury Research Foundation e Mari Hulman George Funds Funds (XMX); Norton Healthcare, Louisville, KY (YPZ); Lo stato dell&#39;Indiana ISDH 13679 (XW); E la NeuroCures Foundation.

Tutte le procedure chirurgiche e di manipolazione degli animali sono state eseguite come approvato nell&#39;ambito della Guida per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio (National Research Council) e le linee guida della commissione istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali della Scuola di medicina dell&#39;Indiana. 1. Preparazione dell&#39;animale e esecuzione della laminactomia spinale T10 <ol><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici e lo stabilizzatore della spina metallica in un autoclave. Pulire la tabella operativa chirurgica. Scaldare un tappetino di riscaldamento a 37 ° C. Posizionare il riscaldatore sul tavolo operatorio e coprirlo con drappi chirurgici sterili. Utilizzare la tecnica sterile durante l&#39;operazione. </li><li> Usa i topi giovani C57 / 6J adulti di sesso femminile a 10 settimane per questo studio. Anestetizzare ogni animale con un&#39;iniezione intraperitoneale (ip) di una miscela di ketamina (87,7 mg / kg) e xilazina (12,3 mg / kg). Confermare l&#39;anestesia completa non generando alcuna risposta a una stimolazione di nociception indotta da pizzicotto. </stro<html> ng&gt; <ol><li> Somministrare somministrato buprenorfina (0,01-0,05 mg / kg), un agente analgesico e carprofene (5 mg / kg), un farmaco antinfiammatorio non steroideo. </li></ol></li><li> Rasare i capelli sopra la colonna vertebrale toracolombare usando un tagliatore elettrico. Scrub la pelle con soluzione betadina e 70% di alcool. </li><li> Applicare unguento oftalmico alle cornee per proteggere gli occhi dall&#39;asciugare durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Con un bisturi, fai un&#39;incisione della pelle mediana di 1,5 cm sulla parte posteriore dell&#39;animale per esporre le lamelle vertebrali toraciche da 9 a 11 ° . Spingere il tessuto adiposo sottocutaneo rostrally. Disseccare i muscoli paraspinali lontano da processi spinosi e lamelle, verso le facce laterali da ogni lato. </li><li> Posizionare il mouse sul fondello a forma di U dello stabilizzatore ( Figura 2A E 2B ). Bloccare bilateralmente le braccia dell&#39;acciaio inossidabile sotto le facce esposte della vertebra T10 (G &quot;&gt; Figura 4A) e serrare con le viti del pollice fissate ai bracci ( Figura 2A ). </li><li> Rimuovere il processo spinoso T10 e la lamina (laminectomia) usando un micro-rongeur che espone il dura mater sul sovrastante il midollo spinale ( Figura 4B ). </li></ol> 2. Eseguire la ferita di contusione T10 utilizzando l&#39;Impactor LISA <ol><li> Ruotare la manopola del regolatore di pressione sul serbatoio di azoto per impostare l&#39;azoto compresso a 20 PSI o 138 kPa ( Figura 1A ) per questo studio. NOTA: La pressione è regolabile da 10 a 120 PSI. Una maggiore pressione comporterà un impatto maggiore. La punta del dispositivo SCI con un diametro di 1,2 mm è progettata per i topi e la punta con un diametro di 2,2 mm è progettata per i ratti. Quando si cambia da topi ai ratti, la punta di diametro maggiore può essere formata aggiungendo un anello alla punta metallica (id 1.2 mm / da 2.2 mm). Abbiamo usato la punta da 1,2 mm in questi topi SCI study. Sterilizzare la punta SCI prima dell&#39;uso. </li><li> Accendere il computer per avviare il software. Pulsante 1 ( Figura 1B ) per attivare la punta dell&#39;impulso in una posizione completamente estesa ( Figura 3A -1 ). NOTA: la funzione del pulsante 1 è quella di attivare o disattivare manualmente il cilindro pneumatico. </li><li> Posizionare il contenitore a forma di U con il mouse sul palco ( figura 2B ). Fissare lo stadio in posizione stringendo le viti del montante ( figura 2B ). </li><li> Sotto la zona &quot;SET ZERO LEVEL&quot; (verde), impostare il livello di zero, con un sensore laser che misura la distanza dalla punta dello stantuffo completamente esteso, facendo clic sul pulsante &quot;START READING&quot; ( Figura 3A ). La distanza verrà visualizzata nel parametro &quot;Campo&quot; in questa zona ( Figura 3A ). Fai clic sul pulsante &quot;SET ZERO&quot; ( ad esempio, 8.951 mm, mostrato in Figura 3A ). </li><li> Premere il pulsante 1 ( Figura 1B ) per ritirare la punta dell&#39;impulso ( Figura 3B -1 , indicata da una freccia superiore) e sbloccare la vite di fissaggio ( figura 2B ). Tirare la vite nella posizione giusta ( Figura 3B -1 , indicata da una freccia laterale) per spostare la punta dal percorso del fascio laser e ruotare la vite 90 ° in senso orario per bloccare la vite. </li><li> Spostare il palco regolando i micro-driver frontali e laterali ( Figura 1C ) per orientare il raggio laser sul centro del dorsale spinale esposto. Dopo aver individuato la posizione del pregiudizio, misurare la distanza del tessuto facendo clic sul pulsante &quot;INIZIO LETTURA&quot; sotto &quot;SET INJURY LEVEL &quot;(blu) ( Figura 3B e 3B-1 ). </li><li> Regolare lentamente la distanza tra il sensore e la spina dorsale tramite il microcircuito verticale ( Figura 1C ) per raggiungere il parametro di spostamento desiderato ( ad es. 0,500 mm, indicato nella casella dei parametri &quot;Injury&quot;) nella zona &quot;SET INJURY LEVEL&quot; (Azzurro) ( figura 3B ). <ol><li> Quando si raggiunge lo spostamento desiderato, registrare la distanza del tessuto ( es. 8.451 mm, indicata nella casella dei parametri &quot;Range&quot;) ( figura 3B ). Definire lo spostamento desiderato (lesione) = distanza della punta (Zero) - distanza del tessuto (intervallo) ( Figura 3B ). Quando si raggiunge il pregiudizio desiderato ( ad esempio, lo spostamento dei tessuti di 0,500 mm) ( Figura 3B ), fare clic sul pulsante &quot;SET JURISTY&quot; sotto la &quot;SET INJURY LEVEL&quot;Impostare il pregiudizio. </li></ol></li><li> Ruotare la vite 1 90 ° in senso antiorario per sbloccare la vite, spingere la punta di impatto nella traiettoria del fascio laser ( figura 3C -1 , direzione indicata da una freccia) e bloccare la vite 1 ruotandola 90 ° in senso orario. </li><li> Fare clic sul pulsante Esegui sotto la zona rossa &quot;RUN EXPERIMENT&quot; ( Figura 3C ) per eseguire l&#39;impatto. Le caselle dei parametri in questa zona mostreranno i tempi di lesione, la forza (mV), la velocità (m / s) e lo spostamento delle lesioni (mm) ( figura 3C ). </li><li> Dopo che tutti i dati di lesione sono registrati e salvati, togliere il tappo a forma di U con il mouse dalla scena. Confermare visivamente la lesione del midollo spinale sotto un microscopio chirurgico ( Figura 4C ). </li><li> Sutura i muscoli paravertebrali, fascia superficiale e la pelle utilizzando sutura continua con seta 3-0 (Henry Schein, 776-SK). </li><li> Iniettare il thE animale con 1 ml di 0,9% salina subcutanea per l&#39;idratazione e collocarlo su un tampone controllato a temperatura fino a quando non è stata ripresa la piena coscienza. Posizionare il mouse in una gabbia con cibo e acqua accessibili. </li><li> Per la cura post-operatoria, esprimere manualmente la vescica fino a quando il ritorno vomito spontaneo della vescica. Per analgesia, iniettare Buprenorfina (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 ore / giorno per 2 giorni. Se si verifica un&#39;infezione della vescica urinaria, iniettare Baytril (SQ, 5-10 mg / kg in 0,1 mL, 1 dose al giorno) per 7-10 giorni. Se si verifica un&#39;infezione regionale / sistemica, iniettare Gentamycin (SQ, 5-8 mg / kg, diluito in 1 ml di soluzione salina sterile ogni 8-12 h) per 4 giorni. </li><li> Rimuovere i fili di sutura a 14 giorni dopo SCI. </li><li> Nel 42 ° giorno dopo l&#39;infortunio, i topi saranno sacrificati per perfusione. Dopo un&#39;adeguata anestesia come 1,2, essi saranno perfusi con 30 ml di soluzione salina fosforata (PBS) e 30 ml di 4% di paraformaldeide in 0.01 M PBS. Un centimetro del midollo spinale incluso l&#39;epico lesioneEntrare verrà raccolto e elaborato per la sezione e l&#39;analisi istologica. </li></ol>

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</ol>

Christopher B. Shields, MD ha la proprietà del Louisville Injury System Apparatus (LISA) prodotto da Louisville Impactor System, LLC.

Nel 1911, Allen descrisse il primo modello di caduta di peso usando un peso fisso per indurre lesioni sui cavi spinali esposti dei cani 12 . Modelli di goccia di peso simili sono stati sviluppati in base al modello Allen, incluso l&#39;impatto dell&#39;impulso NYU / MASCIS 3 , 6 , 13 , 14 . Oltre al modello di drop weight, sono stati creati altri dispositivi SCI. Il modello OSU / ESCID 5 , 7 utilizza un meccanismo di spostamento dei tessuti per controllare la gravità del pregiudizio e il modello IH 4 , 8 utilizza la forza per creare un SCI graduabile. In questi sistemi, la stabilizzazione vertebrale è ottenuta bloccando i processi spinosi rostral e caudali al sito di lesioni. Questi dispositivi utilizzano basse velocità di lesioni, in particolare 0,33-0,9 m / s (NYU / MASCIS), 0,148 m / s (OSU / ESCID),E 0,13 m / s (IH). Stabilizzare i processi spinosi rostrali e caudali possono causare flessibilità della colonna vertebrale e spine durante l&#39;impatto, che possono influenzare l&#39;accuratezza dei lesioni. Il metodo LISA tenta di superare le carenze dei modelli esistenti, in particolare per quanto riguarda l&#39;instabilità della colonna vertebrale e la bassa velocità di lesione. Questo metodo utilizza la stabilizzazione bilaterale delle facce e evita gli artefatti di movimento associati al pregiudizio. Questo dispositivo utilizza una velocità ad alta impatto che può essere impostata tra 0,5-2 m / s 11 , 15 . Il sensore laser è più avanzato del Vibrator Ling utilizzato nel modello ESCID e misura esattamente la distanza dalla superficie del midollo spinale senza richiedere alcun contatto tissutale. Il modello è stato originariamente sviluppato per produrre un ratto SCI ed è stato adattato per produrre SCI sui topi e sui primati non umani 16 con modifiche. Colonna vertebraleL&#39;abilizzazione riduce la variabilità in tutti i metodi sperimentali SCI, in particolare nei modelli di spostamento dei tessuti. Il sensore di distanza laser determina la grandezza dello spostamento del midollo spinale durante i movimenti respiratori. È importante che il punto del midollo spinale in cui il laser sia concentrato dovrebbe essere il punto identico colpito dall&#39;impulso. Questo passaggio viene eseguito durante la fase di calibrazione ( Figura 3 ), quando la punta dell&#39;impulso e il raggio laser sono allineati. Una potenziale debolezza di questo modello è che la grandezza dello spostamento dei tessuti è misurata dalla superficie dura. Sebbene lo spessore della dura costituisca una differenza trascurabile tra gli animali, può esistere una variabilità significativa nello spazio subaracnoideo pieno di fluido cerebrospinale (CSF). La variabilità nei risultati di lesioni può verificarsi quando si produce una ferita di contusione molto lieve usando un piccolo spostamento dei tessuti. Nel complesso, la coerenza del pregiudizio dipende prevalentemente dall&#39;altoSulla precisione dello spostamento dei tessuti e anche sulla velocità e sul tempo di contatto del tessuto dello stantuffo. La portata dello spostamento dei tessuti è ampia (precisione: 0-10 ± 0.005 mm). Sulla base dei dati pilota precedenti e delle informazioni pubblicate su roditori e primati non umani, uno spostamento del 20% del diametro anteroposteriore della SC produce un leggero SCI, uno spostamento del 30-40% produce un SCI moderato e uno spostamento&gt; 50% Produce gravi SCI ad una velocità di 1 m / s. Ci saranno delle lievi differenze a seconda delle specie animali. Il tempo di sosta è regolabile da 0 a 5 s utilizzando un relè tempo. Nel nostro studio, il tempo di dimora è stato impostato a 300 ms. Questo può essere facilmente regolato per replicare i tempi di attesa di altri dispositivi SCI, inclusi i modelli NYU e IH. In sintesi, abbiamo sviluppato un modello basato sullo spostamento di SCUS contusivo nei topi adulti. Il modello utilizza uno stabilizzatore a forma di U per stabilizzare le sfaccettature laterali bilaterali evitando il cavoManufatti di movimento associati alla misura guidata dal laser della superficie del cavo. Questo modello può produrre lesioni a corda ad alta velocità da 0,5-2 m / s. Il sensore laser è più preciso del metodo convenzionale per determinare la velocità e la distanza dalla superficie di impatto. Il modello può produrre lesioni del midollo spinale a tutti i livelli, da lievi a gravi. Quando modificato, questo dispositivo può anche causare lesioni nei ratti e negli animali di grandi dimensioni come i primati non umani.

Il più comune lesione del midollo spinale (SCI) che si verifica negli esseri umani è un SCI 1 contusivo. Per studiare i meccanismi di lesione e le varie strategie terapeutiche a seguito di SCI, è necessario un modello SCI contusivo preciso, coerente e riproducibile nei roditori. Molti modelli di lesioni del contusivo del midollo spinale con vari meccanismi di produzione di lesioni sono stati utilizzati nella ricerca sperimentale SCI 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Tre modelli contusivi SCI - in particolare, l&#39;impatto di misura di 3 ( 6 ) dell&#39;Università di New York (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS), l&#39;impulso di impulso dell&#39;Università di Stato dell&#39;Ohio (OSU) e il dispositivo SCI (ESCID) elettromagnetico 5 , 7 , unD l&#39;impatto di impulso Infinite Horizon (IH) 4 , 8 - sono ampiamente accettati nel campo della ricerca SCI. Il misuratore NYU / MASCIS o un equivalente produce lesioni, riducendo un peso fisso da diverse altezze sul midollo spinale di destinazione per generare più severità di lesioni 3 , 6 . L&#39;OSU / ESCID provoca lesioni inducendo lo spostamento dei tessuti 5 , 7 . L&#39;impatto a impatto IH produce ferite applicando forze diverse al midollo spinale 4 , 8 . Ogni imputatore utilizza una velocità diversa, che è un parametro importante che influenza i risultati del pregiudizio. L&#39;apparecchio NYU / MASCIS genera velocità che vanno da 0,33-0,9 m / s. Il dispositivo IH ha una velocità massima di 0,13 m / s 4 . Il dispositivo di impatto OSU / ESCID ha una velocità fissa di 0,148 m / s 5 . In particolare, le velocità delSe i modelli sono inferiori a quelli osservati nelle velocità cliniche, che di solito superano 1,0 m / s 9 . Qui introduciamo un dispositivo SCI contusivo basato sullo spostamento, chiamato l&#39;apparato di sistema di lesioni di Louisville (LISA), per produrre SCI nei topi con una velocità di impatto elevata 10 . Questo sistema include uno stabilizzatore vertebrale, che stabilizza saldamente la vertebra nel luogo di lesioni, consentendo la produzione di un SCI costante e riproducibile. Il sensore laser del dispositivo assicura la precisa determinazione dello spostamento dei tessuti e la conseguente gravità dello SCI. La velocità dello stantuffo al punto di contatto con il midollo spinale può essere regolata da 0,5 a 2 m / s. Questi parametri di lesione strettamente replicano SCI traumatico visto clinicamente.

<table><tbody><tr><td>Ketamina (7,2 mg/mL)/Xilazina (0,475 mg/mL)/Acepromazina</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947</td><td>Agente anestetico</td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,03 mg/mL)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-9756</td><td>Agente antidolorifico</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>agente antibiotico</td></tr><tr><td>Purdue Products Betadine Surgical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>per la sterilizzazione della pelle</td></tr><tr><td>Spugne di garza Dukal</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>per la sterilizzazione della pelle</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>per la sterilizzazione della pelle</td></tr><tr><td>1 mL NORM-JECT</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>D-78532</td><td>per anestesia/sollievo dal dolore/iniezione di agente antibiotico</td></tr><tr><td>10 ml Siringa</td><td>TERUMO</td><td>REF SS-10L</td><td>per iniezione salina</td></tr><tr><td>Lacrime artificiali Unguento per gli occhi</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261</td><td>occhi provenzati da</td></tr><tr><td>unguento antiobiotico</td> secco <td>Webster Veterinary</td><td>07-877-0876</td><td>chirurgia provenzata tagliata dall'infezione</td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone Fisher</td><td>Scientific</td> 1006015 <td>fermare l'emorragia</td><td></td></tr><tr><td>Strumento Sterilizzatore</td><td>Strumenti di scienza</td> fine<td>18000-50</td><td>per sterilizzazione strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti di scienze</td> fini <td>11223-20</td><td>afferrare il tessuto</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>10003-12</td><td>taglio della pelle</td></tr><tr><td>Lama del bisturi #15</td><td>Fisher Scientific</td><td>10015-00</td><td>taglio della pelle</td></tr><tr><td>Emostatico</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>13004-14</td><td>fermare l'emorragia</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>16021-14</td><td>laminectomia</td></tr><tr><td>Divaricatore Agricola</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>17005-04</td><td>mantenere aperta la vista dell'intervento</td></tr><tr><td>chirurgico Forbici fini</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>14040-10</td><td>per il muscolo separato dalla colonna vertebrale</td></tr><tr><td>Suture sterili Strumenti di</td><td>Fine Science</td><td>12051-10</td><td>chiusura della pelle</td></tr><tr><td>Stabilizzatore vertebrale del mouse</td><td>Sistema di impatto di Louisville</td><td>N / A</td><td>Stabilizzare ed esporre la vertebra</td></tr><tr><td>LISA</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Produrre una lesione sperimentale da contusione del midollo spinale nei topi</td></tr></tbody></table>

un modello di lesioni del midollo spinale contusivo basato sullo spostamento tissutale nei topi

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Produzione di una lesione del midollo spinale contusivo coerente e riproducibile (SCI) è fondamentale per ridurre al minimo le variabilità comportamentali ed istologiche tra animali sperimentali. Sono stati sviluppati diversi modelli di contusive SCI per produrre lesioni con meccanismi diversi. La gravità dello SCI si basa sull&#39;altezza che viene lasciato cadere un dato peso, la forza di lesioni o lo spostamento del midollo spinale. Nello studio in corso, abbiamo introdotto un nuovo dispositivo SCI a contusivo del mouse, l&#39;impatto dell&#39;impatto dell&#39;impianto di lesioni di Louisville (LISA), che può creare un SCI a base di spostamento con elevata velocità e precisione di lesioni. Questo sistema utilizza sensori di distanza laser combinati con software avanzato per produrre lesioni classificate e altamente riproducibili. Abbiamo eseguito un SCI contusivo al 10 ° livello toracico vertebrale (T10) nei topi per dimostrare la procedura passo-passo. Il modello può essere applicato anche ai livelli spinali cervicali e lombari.

Questo dispositivo è costituito da cinque componenti principali: (1) un corpo con una punta di impatto ( figura 1C ), (2) un computer con software ( figura 1B ), (3) una scatola di controllo elettrica ( figura 1B ), (4) Stabilizzatore vertebrale ( figura 2A ), e (5) aria compressa per il sistema di controllo pneumatico ( figura 1A ). Per indurre un preciso spostamento dei tessuti, il sistema si basa su un sensore laser per misurare la distanza tra la punta del pistoncino completamente estesa e la superficie dorsale del midollo spinale. Il software tiene conto dello spessore di 4 mm della punta per il fatto che il raggio laser raggiunge solo la superficie riflettente dell'impulso ( figura 2B e figura 3A -1 ). Ci sono due posizioni in cui può essere posizionata la punta dello stantuffo: (1) iN il percorso del fascio laser ( figura 3A -1 ) o (2) in posizione laterale lontano dal fascio laser ( figura 3B -1 ). Quando lo stantuffo è nel percorso del fascio laser ( Figura 3A -1 ), misura la distanza dalla punta dell'impulso e controlla la velocità della punta dell'impulso durante il movimento tra estensione e retrazione. Quando lo stantuffo è in posizione laterale lontano dal percorso del fascio laser ( figura 3B -1 ), viene misurata la distanza tra il laser e il midollo spinale. La stabilizzazione della vertebra T10 usando il nostro stabilizzatore vertebrale è una componente integrale della procedura ( Figura 2A ) 10 , 11 . Le misurazioni affidabili di distanza usando il sensore laser dipendono dalle sLa tattività dell'obiettivo, che può essere distorta se il movimento è presente. Per determinare l'accuratezza e la coerenza di questo sistema, 8 topi sono stati sottoposti a lesioni di spostamento da 0,5 mm. Questi animali hanno mostrato una variabilità di spostamento di ± 0,001 mm (± SD), indicando che il sistema è altamente preciso e riproducibile. La Figura 4 mostra la vertebra bersaglio immobilizzata nello stabilizzatore ( Figura 4A ) e il midollo spinale T10 esposto prima ( Figura 4B ) e dopo ( Figura 4C ) contusione sotto un microscopio chirurgico. La pressione dell'aria compressa controlla la velocità dell'impatto sul momento dell'infortunio. I nostri dati dimostrano che la velocità di impatto è di 0,81 ± 0,0345 m / s (media ± SD) ad una pressione di 138 kPa. La manopola ( figura 1B ) sui comandi della scatola elettricaLa durata del contatto del cavo di punta (tempo di permanenza) a seguito della lesione e può essere regolata tra 0 e 5.000 ms. Il tempo di spostamento del cavo di punta nella maggior parte degli esperimenti è impostato a 0,32 ± 0,0147 s (media ± SD) ( Figura 5 ). Utilizzando questo dispositivo, lesioni contusive dipendenti da gravità possono essere prodotte con movimenti di tessuto di 0 mm (controllo sham), 0,2 mm (lesioni lievi), 0,5 mm (lesioni moderate) e 0,8 mm (lesioni gravi) nei topi adulti ( Figura 6 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig1.jpg"> Figura 1: Apparecchio di sistema di lesioni di Louisville (LISA). ( A ) Il sistema è costituito da un impatto, un sistema di controllo e una sorgente di aria compressa. ( B ) Il sistema di controllo comprende una scatola di controllo e un computer portatile. I pulsanti software e di controllo della casella di controllo consentono all'utente di stabilireParametri di lesione. ( C ) Il sensore laser è il componente chiave del dispositivo e misura la posizione del bersaglio di lesioni, la distanza dal midollo spinale al sensore e la velocità di infortunio. Il movimento veloce e rapido della punta di impatto è alimentato da aria compressa. La posizione del danno e la gravità dello spostamento del tessuto sono regolati da microdrivers, che controllano il movimento in tre dimensioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig2.jpg"> Figura 2: Lo stabilizzatore e il supporto del mouse. ( A ) Lo stabilizzatore della colonna è costituito da un vano a forma di U e due bracci metallici per contenere la vertebra del mouse. ( B ) Lo stabilizzatore è quindi montato sul dispositivo di impatto. TLa linea rossa indica il percorso del fascio laser. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig3.jpg"> Figura 3: Metodo per la produzione di un SCI contusivo. ( A - C ) Viene visualizzato il software GUI (Graphical User Interface) con tre parametri / zone di lesioni. ( A , A-1 ) La zona verde (SET ZERO LEVEL) calibra la distanza della punta dello stantuffo. La linea rossa indica il percorso del fascio laser. ( B , B-1 ) La zona blu viene utilizzata per impostare il livello di lesioni (SET LIVELLO DI LAVORO). L'impatto viene sollevato e spostato lateralmente al lato destro per consentire al raggio laser di raggiungere la superficie dorsale del midollo spinale per impostare il livello di zero. La linea rossa indica il laser b Percorso EAM. ( C , C-1 ) Prima dell'impatto, la punta viene spostata indietro sul percorso del raggio laser per eseguire la lesione (RUN). I parametri di lesione sono sotto la zona rossa (RUN EXPERIMENT). La linea rossa indica il percorso del fascio laser. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig4.jpg"> Figura 4: Esposizione e valutazione delle lesioni. ( A ) Le braccia metalliche dello stabilizzatore della colonna stabilizzano la vertebra T10. ( B ) T10 laminectomia per esporre il midollo spinale, con le vasi dorsali chiaramente visibili. ( C ) La contusione indotta dall'impatto (freccia) sulla superficie dorsale del midollo spinale conferma la lesione. Barra di scala = 2 mm.G4large.jpg "target =" _ blank "&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig5.jpg"> Figura 5: Parametri di infortunio. I parametri di lesione coerenti includono lo spostamento del tessuto (mm), la velocità di lesione (m / s) e il tempo di spostamento delle punte. N = 8, media ± SD. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig6.jpg"> Figura 6: valutazione istologica. Le sezioni trasversali rappresentative delle cordicelle spinali, colorate con Cresyl Violet e Eosin, mostrano lesioni dipendenti dalla gravità dello spostamento dopo ( A ) sham (0 mm), ( B ) lieve (0,2 mm), ( C D ) SCI gravosi (0,8 mm) contusivi a T10 utilizzando il dispositivo LISA. Le immagini sono state scattate all'epicentro della lesione. Barra di scala = 500 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Introduciamo un modello di lesioni del midollo spinale basato sullo spostamento tissutale che può produrre una lesione contusiva del midollo spinale in topi adulti.

Un modello di lesioni del midollo spinale contusivo basato sullo spostamento tissutale nei topi

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

L'obiettivo generale di questo video è quello di introdurre un nuovo modello di lesione contusiva del midollo spinale basata sullo spostamento dei tessuti, in grado di produrre una lesione contusiva costante del midollo spinale nei topi adulti. Questo modello di contusione può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo sperimentale delle lesioni del midollo spinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce lesioni del midollo spinale molto coerenti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della lesione del midollo spinale perché questo modello fornisce strumenti affidabili e riproducibili per studiare i meccanismi della lesione e gli effetti delle terapie sperimentali. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non hanno familiarità con il nuovo impattore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto diversi passaggi sono difficili da apprendere a causa delle operazioni manuali e software.Inizia portando gli strumenti chirurgici dell'autoclave e lo stabilizzatore della colonna vertebrale in metallo sul tavolo chirurgico pulito. Scaldare un termoforo a 37 gradi Celsius. Quindi, posizionare il termoforo sul tavolo operatorio e coprire con teli chirurgici sterili.Per questo studio vengono utilizzati topi femmina di 10 settimane, C57BL6J. Dopo aver somministrato un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina, verificare un livello adeguato di anestesia in assenza di qualsiasi risposta alla stimolazione della nocicezione indotta dal pizzico della zampa. Somministrare buprenorfina, un agente analgesico e carprofene, un farmaco antinfiammatorio non steroideo per via sottocutanea.Usa un tagliacapelli elettrico per radere i peli sulla colonna vertebrale toracolombare. Strofinare la pelle con una soluzione di betadina e salviettine imbevute di alcol al 70%. Applicare un unguento oftalmico sulle cornee, per proteggere gli occhi dalla secchezza.Dopo aver praticato un'incisione cutanea di 1,5 centimetri sulla parte posteriore dell'animale sopra le lamine vertebrali toraciche dalla nona all'undicesima, spingere rostralmente il tessuto adiposo sottocutaneo. Usando forbici sottili, pinze fini e un divaricatore agricolo, sezionare i muscoli paraspinali lontano dai processi spinosi e le lamine verso i fasci laterali su ciascun lato. Posizionare il mouse sul contenitore a forma di U dello stabilizzatore, bloccare bilateralmente i bracci in acciaio inossidabile sotto le faccette esposte della vertebra t10 e serrare i bracci con le viti a testa zigrinata ad essi attaccate.Utilizzare un micro rongeur per rimuovere il processo spinoso t10 e la lamina che espone il modello dura sovrastante il midollo spinale. Posizionare il contenitore a forma di U con il mouse sul tavolino dell'impattatore e fissare il tavolino in posizione serrando le viti a testa zigrinata del supporto. Per impostare l'impattatore, ruotare prima la manopola del regolatore di pressione sul serbatoio dell'azoto per impostare l'azoto compresso a 20 libbre per pollice quadrato o 138 kilopascal per lo studio.Sterilizzare la punta d'impatto da 1,2 millilitri con alcol al 70%. Quindi, apri il pacchetto software sul computer. Premere uno dei pulsanti della scatola di controllo per attivare la punta dell'impattatore in una posizione completamente estesa.Sullo schermo del computer, sotto il livello zero impostato, fare clic su Inizia lettura per misurare la distanza dalla punta dello stantuffo completamente estesa. La distanza verrà mostrata come parametro di portata in questa zona. Quindi fare clic su imposta zero e un numero in millilitri verrà visualizzato nella casella del parametro zero.Quindi, premere il pulsante uno sulla scatola di controllo per estrarre la punta dell'impattatore. Quindi, sbloccare la vite di fissaggio, tirare la vite per allontanare la punta dal percorso del raggio laser e ruotare la vite di 90 gradi in senso orario per bloccarla. Ora sposta il tavolino di montaggio, regolando i micro driver frontali e laterali per puntare il raggio laser al centro del midollo spinale dorsale esposto.Dopo aver individuato il punto della lesione, misurare la distanza dei tessuti facendo clic sul pulsante di avvio della lettura sotto il livello di lesione impostato. Utilizzare il microdriver verticale per regolare lentamente la distanza tra il sensore e il midollo spinale, fino a raggiungere il parametro di spostamento desiderato. Questo è al di sotto del livello di infortunio impostato, nella casella dei parametri degli infortuni.Quando viene raggiunto lo spostamento della lesione desiderato, registrare la distanza del tessuto mostrata nella casella dei parametri dell'intervallo, quindi definire lo spostamento o la lesione desiderati sottraendo la distanza o l'intervallo del tessuto dalla distanza della punta a zero. Quindi fare clic su imposta infortunio sotto il livello di infortunio impostato. Quindi, sbloccare la vite ruotandola di 90 gradi in senso antiorario.Spingere la punta dell'impatto nella traiettoria del raggio laser e bloccare la vite ruotandola di 90 gradi in senso orario, fare clic sul pulsante Esegui sotto l'esperimento di esecuzione per eseguire l'impatto. Le caselle dei parametri mostreranno il tempo di infortunio in secondi, la forza in microvolt, la velocità in metri al secondo e lo spostamento dell'infortunio in millimetri. Dopo che tutti i dati sulle lesioni sono stati registrati e salvati, rimuovere il trogolo a forma di U con il mouse dal tavolino.Quindi, confermare visivamente la lesione del midollo spinale al microscopio operatorio. Dopo aver suturato l'incisione a strati, iniettare all'animale un millimetro di soluzione fisiologica allo 0,9% per via sottocutanea per l'idratazione e posizionarlo su un tampone a temperatura controllata fino a quando non si riprende conoscenza. Quindi ospita il topo in una gabbia pulita con acqua e cibo facilmente accessibili.Questi dati mostrano parametri di lesione incoerenti, dimostrano che l'impattatore può produrre lesioni affidabili e riproducibili. Questa sezione trasversale rappresentativa colorata con cresil violetto-eosina, mostra la regione t10 del midollo spinale dopo una lesione fittizia con lo spostamento di 0 millimetri. Questa immagine mostra l'epicentro di una lieve lesione contusiva del midollo spinale a t10, utilizzando il dispositivo con uno spostamento di 0,2 millimetri.Questa lesione moderata è stata ottenuta utilizzando uno spostamento di 0,5 millimetri. Infine, questa grave lesione è il risultato di uno spostamento di 0,8 millimetri. Queste immagini dimostrano che questo nuovo impattatore può produrre lesioni da contusione graduale.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di impostare lo zero per la punta dell'impattatore nei bersagli del midollo spinale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle lesioni del midollo spinale, per esplorare meccanismi e terapie nei topi, nei ratti e nei primati non umani.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo impattatore per produrre lesioni contusive del midollo spinale.

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Un modello contusivo unilaterale di lesioni del midollo spinale cervicale Uso della Impactor Infinite Horizon

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