Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare proteine HLA del recettore delle cellule T ricumbinate solubili e peptidiche di qualità sufficiente per l'uso in analisi biofisiche e strutturali. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande nel campo dell'immunologia delle cellule T. Ad esempio, perché le cellule T non rispondono in modo robusto al cancro?

Il vantaggio principale di questa tecnica è che otteniamo dati meccanicistici ad altissima risoluzione che spiegano come i recettori delle cellule T riconoscono i loro bersagli, portando a risposte immunitarie mediate dalle cellule T. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di praticamente qualsiasi malattia umana perché le cellule T svolgono un ruolo fondamentale nella maggior parte delle risposte immunitarie. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle risposte immunitarie delle cellule T, può essere applicato anche ad altri sistemi controllati dalle interazioni dei ligandi recettoriali.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è molto difficile generare proteine solubili e attive di qualità sufficiente per esperimenti biofisici e strutturali. Per iniziare la procedura di ripiegamento del peptide HLA a sei millilitri di tampone guanidina con 10 milometri di ditiotreitolo, aggiungere 30 milligrammi di corpi di inclusione HLA-A2, 30 milligrammi di corpi di inclusione beta 2-M e quattro milligrammi del peptide desiderato di interesse. Incubare la miscela per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, diluire la miscela con un litro di HLA refold buffer, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius e mescolare la miscela per tre ore a quella temperatura. Dializzare la miscela due volte contro 20 litri di tris da 10 millimolari, pH 8,1, per 24 ore ciascuna. Per iniziare la procedura di ripiegamento del TCR, a sei millilitri di tampone guanidina con 10 millimolari di ditiotreitolo, aggiungere 30 milligrammi ciascuno di TCR alfa e beta a catena IB.

Incubare la miscela per 30 minuti a 37 gradi Celsius e diluire la miscela in un litro di tampone refold TCR pre-raffreddato. Mescolare e dializzare la miscela diluita di TCR refold allo stesso modo della miscela di peptidi HLA. Filtrare entrambe le miscele refold dializzate attraverso un filtro a membrana da 0,45 micrometri.

Successivamente, caricare una delle preparazioni refold filtrate su una colonna di resina a scambio anionico da 7,9 millilitri e 50 micrometri, pre-bilanciata con 20 millilitri di tris da 10 millimolari, pH 8,1. Eluire la proteina con un sistema tampone a gradiente salino a cinque millilitri al minuto. Raccogli frazioni da un millilitro e analizza le frazioni con SDS-Page.

Combina le frazioni contenenti la proteina ripiegata. Mettere la miscela proteica in un concentratore centrifugo da 10 kilodalton di taglio del peso molecolare. Centrifugare la miscela per 20 minuti o per il tempo necessario, a 4000 volte g, per concentrare la miscela a 500 microlitri.

Scartare il flusso attraverso. Modellare il preparato proteico concentrato in un circuito di iniezione da due millilitri e iniettare la proteina su una colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni da 24 millilitri, pre-bilanciata con il tampone di elusione appropriato. Eluire la proteina con un volume di colonna di tampone a 0,5 millilitri al minuto.

Raccogli frazioni da un millilitro, analizza le frazioni con SDS-Page e combina le frazioni contenenti la proteina di interesse. Preparare 10 diluizioni seriali della soluzione di TCR, in un intervallo di concentrazione compreso tra 10 volte al di sopra e 10 volte al di sotto della KD dell'interazione HLA del peptide TCR specifico, se nota. In caso contrario, iniziare da una concentrazione di TCR di 200 micromolari.

Successivamente, attivare un chip sensore rivestito di destrano carbossimetilato facendo scorrere una miscela uno a uno di 100 millimolari e N-idrossisuccinimide e 400 millimolari EDC sul chip a una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto per 10 minuti, a 25 gradi Celsius. Quindi, caricare 110 microlitri di streptavidina da 200 microgrammi per millilitro e 10 millimolari di acetato pH 4,5 in tutte e quattro le celle di flusso per funzionalizzare la superficie del chip. Disattivare tutti i gruppi reattivi rimanenti con 100 microlitri di un molare di etanolammide cloridrato.

Quindi, far scorrere una soluzione di circa un peptide micromolare HLA nel tampone fornito dal produttore del chip sulla superficie del chip a 10 microlitri al minuto fino a quando il numero di unità di risposta non aumenta da 500 a 600. Saturare la superficie del chip con un millimolare di biotina e il tampone fornito dal produttore per 60 secondi. Quindi, iniettare le 10 diluizioni seriali della soluzione TCR a 30 microlitri al minuto a 25 gradi Celsius.

Calcola la costante di legame di equilibrio ed esegui un'analisi cinetica. Eseguire una serie di esperimenti SPR in questo modo, variando solo la temperatura alla quale vengono iniettate le diluizioni di TCR. Determinare la costante di legame di equilibrio per ogni temperatura e calcolare le energie di Gibbs e altri parametri termodinamici.

Collegare le energie di Gibbs alla temperatura utilizzando un adattamento di regressione non lineare. Concentrare la soluzione di peptide HLA a 0,2 millimolari e tampone di cristallizzazione mediante centrifugazione a 3.000 volte g, in un concentratore centrifugo con cutoff di peso molecolare da 10 kilodalton. Preparare una soluzione 0,1 millimolare di TCR uno a uno e HLA peptidico per la cristallizzazione del co-complesso.

Utilizzando un robot di cristallizzazione e un kit di screening, preparare le prove di cristallizzazione utilizzando la tecnica della goccia seduta in una piastra a 96 pozzetti. Con 60 microlitri di tampone di cristallizzazione in ogni serbatoio e ogni goccia composta da 200 nanolitri ciascuno di soluzione proteica e tampone. Fai crescere i cristalli a 18 gradi Celsius.

Punteggio per i cristalli al microscopio dopo 24 ore, 48 ore, 72 ore e poi settimanalmente. Una volta che i singoli cristalli sono cresciuti di qualità sufficiente, raccogliere i singoli cristalli con un ciclo compatibile con il criogeno e conservare i cristalli in azoto liquido. Eseguire la diffrazione dei raggi X di sincrotrone sotto un flusso di azoto gassoso a 100 kelvin, analizzare i dati e risolvere le strutture con il software appropriato.

Calcola i contatti, la complementarità della superficie e l'angolo di incrocio dalle strutture risolte. Utilizzando questi metodi, le molecole di TCR e peptide HLA sono state espresse e ripiegate in una forma solubile. Il peptide nelle molecole di peptide HLA era l'antigene gp100.

SPR è stato utilizzato per determinare l'affinità di legame del TCR PMEL17 per l'antigene a varie temperature. Sono state quindi utilizzate sia la titolazione calorimetrica SPR che quella calorimetrica isotermica, per determinare i parametri termodinamici dell'interazione proteina-proteina. Il complesso PMEL17 TCR A2-YLE-9V è stato cristallizzato e valutato con diffrazione di raggi X di sincrotrone.

Sono stati identificati i loop TCR CDR e i residui peptidici HLA entrati in contatto con la proteina TCR ed è stata studiata la natura dei contatti. Anche le molecole di peptide HLA con forme mutate del peptide sono state purificate e cristallizzate in questo modo. Studiare le differenze strutturali che potrebbero impedire le interazioni di legame con il TCR.

È stato riscontrato che la mutazione del terzo o quinto residuo modifica significativamente la posizione della prolina quattro, interrompendo molti dei contatti con il TCR CDR-3 Alpha Loop. Durante il tentativo di questa procedura, è importante selezionare solo le proteine più pure per ulteriori analisi. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la colorazione con peptidi HLA tetrameri, possono essere eseguiti utilizzando le proteine solubili al fine di isolare le cellule T antigene-specifiche dal sangue del paziente per la diagnostica e ulteriori analisi.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia delle cellule T per esplorare il legame HLA del peptide TCR in modo squisitamente dettagliato, consentendo lo sviluppo di nuovi farmaci per il cancro e altre malattie umane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare proteine TCR e peptidiche HLA di qualità sufficiente per eseguire analisi biofisiche e strutturali.