Name: Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri come generare proteine TCR e HLA solubili per analisi biofisiche e strutturali mediante cristallografia a raggi X. Questo metodo rivela i meccanismi di riconoscimento degli antigeni tumorali da parte dei recettori delle cellule T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BM è sostenuto da una borsa di studio di dottorato Cancer Research UK. AG è sostenuto da una borsa di studio Life Science Research Network Wales PhD. VB è sostenuto da una borsa di studio di ricerca sul cancro Galles PhD. DKC è un Wellcome Trust Research Fellow Career Development (WT095767). AKS è un investigatore Wellcome Trust. GHM è finanziato da una joint-Life Science Research Network Galles e Tenovus Cancer Care PhD Studentship. Ringraziamo lo staff di Diamond Light Source per la fornitura di servizi e supporto.

1. Protein Expression <ol><li> Realizzare costrutti genici per la generazione di TCR solubili e pHLAs, come descritto in dettaglio in precedenza 17, 18. Progettare ciascuna costruzione con un 5 &#39;BamH1 e 3&#39; sito EcoR1 di restrizione per l&#39;inserimento nel vettore pGMT7. </li><li> Transform coli Rosetta (DE3) pLysS E. con un vettore plasmidico pGMT7 derivato contenente la sequenza codificante la proteina di interesse incubando 1 ml di 50-200 ng / ml plasmide con 5 ml di E.coli per 5 minuti a 4 ° C , 2 min a 42 ° C e 5 min a 4 ° C, e la piastra durante la notte a 37 ° C su una piastra di agar LB supplementato con 50 mg / L carbenicillina. </li><li> Raccogliere singole colonie e crescere a 37 ° C e 220 rpm in 30 mL di TYP mezzi (16 g / L di triptone, 16 g / estratto di lievito L, e 5 g / L HK 2 O 4) integrato con 100 pM carbenicillina fino sospensione raggiunge un de otticansity (OD 600) compreso tra 0,4 e 0,6. </li><li> Indurre la produzione di proteine ​​in un mL un&#39;aliquota 5 con l&#39;introduzione di 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 3 ore. Mantenere 20 ml di sospensione con e senza induzione di elettroforesi gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) analisi e macchiare il gel. </li><li> Aggiungere colture starter a 1 L di TYP supplementato con 100 pM carbenicillina e crescere cellule come sopra descritto al punto 1.3 fino alla sospensione raggiunge un OD 600 tra 0,4 e 0,6. </li><li> Indurre l&#39;espressione di proteine ​​per 3 ore con 0,5 mM IPTG. Centrifugare le cellule per 20 min a 3000 xg e versare con cautela il surnatante. </li><li> Sciogliere il pellet in 40 ml di tampone di lisi (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM cloruro di magnesio, MgCl 2; 150 mM NaCl e 10% glicerolo), ultrasuoni in ghiaccio per potere 30 min a 60% utilizzando un 2 s intervallo , e incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti con 0,1 g / L DNasi. </li><li> Trattare il suspensione contenente le proteine ​​in forma di corpi di inclusione (IB) con 100 ml di tampone di lavaggio (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl e 10 mM EDTA). </li><li> Centrifugare il campione per 20 minuti a 4 ° C e 8.000 xg e versare cautamente il surnatante. Risospendere il pellet in 100 ml di tampone risospensione (50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl, e 10 mM EDTA, pH 8.1), centrifugare come prima a 8.000 xg, e versare con cautela il surnatante. </li><li> Infine, sciogliere il precipitato in 10 ml di tampone guanidina (6 M guanidina; 50 mM Tris, pH 8,1, 2 mM EDTA, pH 8,1 e 100 mM NaCl) e misurare la concentrazione di proteine ​​a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. </li></ol> 2. Phla e TCR ripiegamento <ol><li> Per i ripiega Phla, miscelare 30 mg di HLA-A2 (o HLA-A2 con un tag biotina) IBs, 30 mg di β2m IBs e 4 mg di peptide per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua in un volume finale 6 mL di tampone guanidina integrato con 10 mM ditiotreitolo(DIGITALE TERRESTRE). </li><li> Avviare ripiegamento proteico diluendo la miscela precedente in 1 L di tampone HLA ripiegare pre-raffreddata (50 mM Tris, pH 8,1, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA, pH 8,1, 6 mM cisteamina e 4 mM cistamina). </li><li> Lasciare l&#39;HLA ripiegare agitazione a 4 ° C per 3 ore e poi trasferisce in un kDa MWCO 12,4 (peso molecolare cut-off) tubo di dialisi e Dializzare due volte per 24 ore contro 20 L di 10 mM Tris, pH 8,1. </li><li> Per i ripiega TCR, miscelare 30 mg di TCR catena α IBS e 30 mg di TCR catena β IBs per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua in 6 mL di tampone guanidina supplementato con 10 mM DTT. </li><li> Avviare ripiegamento proteico diluendo la miscela denaturato TCR in 1 L di tampone pre-raffreddata TCR ripiegare (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urea, 2 mM EDTA, pH 8,1, 6 mM cisteamina e 4 mM cistamina) per 3 h. </li><li> Trasferire il ripiegare in un tubo di dialisi 12,4 kDa MWCO e dializzare due volte per 24 ore contro 20 L di 10 mM Tris, pH 8,1. </li><li> Filtrare sia il Phla o TCR refolds usando un filtro a membrana da 0,45 micron per le fasi di purificazione. </li></ol> 3. Purificazione da Fast Protein cromatografia liquida (FPLC) <ol><li> Caricare la preparazione refold filtrato (sia Phla o TCR) su un 7,9 mL, 50 um anionico colonna di resina a scambio pre-equilibrata con 20 ml di 10 mM Tris, pH 8.1 su un sistema di cromatografia flessibile ed intuitiva. </li><li> Eluire la proteina a 5 mL / min con un gradiente salino (0-500 mM NaCl in 10 mM Tris, pH 8,1, su 8 volumi di colonna) e raccogliere frazioni da 1 ml. </li><li> Analizzare le frazioni corrispondenti alla proteina di interesse mediante SDS-PAGE, raggruppare le frazioni contenenti la proteina di interesse insieme, e concentrarli fino a 500 microlitri con 10-kDa MWCO 20 o 10 kDa MWCO 4 mediante centrifugazione per 20 minuti a 4000 xg , scartando il flusso passante. </li><li> Caricare i preparati proteici concentrati in un mL ciclo 2 iniezione su una colonna di cromatografia di esclusione 24 dimensione mL pre-equilibrata con l&#39;applicazioneBuffer ropriate eluizione: tampone fosfato salino (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA, e 0,005% di tensioattivo), o buffer di cristallo (10 mM Tris, pH 8,1, e 10 mM NaCl ). </li><li> Eluire proteine ​​ad una portata di 0,5 ml / min oltre 1 colonna Volume; raccogliere 1 frazioni mL contenenti la proteina di interesse verificato per SDS-PAGE. NOTA: Questi metodi sono stati utilizzati per generare solubili PMEL17 TCR e GP100 TCR, così come tutti i pHLAs utilizzati in questo studio: HLA-A * 0201 con YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), o YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. risonanza plasmonica di superficie (SPR) Analisi <ol><li> Eseguire analisi dell&#39;equilibrio vincolante o analisi termodinamica utilizzando un sistema di analisi interazioni molecolari dotato di CM5 chip del sensore 19. </li><li> Attivare il chip CM5 da flowing 1: 1 miscela di 100 mM N-idrossisuccinimmide (NHS) e 400 mM 1-etil 3--(3-dimetilpropil) -carboiimide (EDC) per 10 minuti a una velocità di flusso di 10 ml / min ed a 25 ° C. </li><li> Caricare circa 5.000 unità di risposta (RU) di streptavidina (110 ml di 200 mg / ml a 10 mM acetato, pH 4,5) per covalente collegano alla superficie del chip in tutti e quattro portate cellule e utilizzare 100 ml di 1 M etanolammina cloridrato per disattivare eventuali gruppi reattivi rimanenti. </li><li> Coppia di circa 500-600 UR di Phla, a ~ 1 mM in tampone commerciale (fornito dal produttore), al chip sensore CM5 ad una portata lenta di 10 microlitri / min per assicurare una distribuzione uniforme sulla superficie del chip. </li><li> Saturare la superficie del chip con 1 mM biotina in tampone commerciale (fornita dal produttore) per 60 s. </li><li> Iniettare dieci diluizioni seriali di TCR solubili oltre pertinenti portate cellule ad una elevata portata di 30 microlitri / min a 25 ° C. </li><li> Calcolare la costante di equilibrio vincolante(K D (E)) valori utilizzando una misura lineare curva (y = (P1x) / (P2 + x)) 20. NOTA: le unità y = risposta, x = concentrazione analista, P1 = r max, P2 = K D. </li><li> Eseguire l&#39;analisi cinetiche ipotizzando un 1: 1 Langmuir vincolante e adattare i dati utilizzando un algoritmo globale-fit nel pacchetto software 2. </li><li> Eseguire termodinamica esperimenti ripetendo questo metodo alle seguenti temperature: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C e 30 ° C 19. </li><li> Utilizzare i valori K D determinati da SPR a temperature diverse per calcolare DeltaG ° utilizzando l&#39;equazione termodinamico standard (DeltaG ° = -RTlnK D) 19. NOTA: R = costante dei gas, T = temperatura in K, ln = logaritmo naturale. </li><li> Calcolare i parametri termodinamici secondo l&#39;equazione di Gibbs-Helmholtz (DeltaG ° = d H - TΔS °) 19. </li&gt; <li> Tracciare le energie di legame liberi, DeltaG ° (DeltaG ° = -RTlnK D), contro temperatura (K) utilizzando una regressione non lineare per adattare l&#39;equazione a tre parametri (y = d H + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19. NOTA: y = temperatura in K, x = DeltaG °. </li></ol> 5. Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) <ol><li> Effettuare esperimenti ITC utilizzando un calorimetro di titolazione isotermica. Iniettare 30 pM Phla nella cella del calorimetro e di carico 210 pM solubile TCR nella siringa. Utilizzare le seguenti condizioni tampone: 20 mm Hepes (pH 7,4) contenente 150 mM NaCl. </li><li> Eseguire 20 iniezioni TCR, ciascuna di un volume 2 microlitri. Calcolare d H e K D utilizzando il software di analisi. </li></ol> 6. Cristallizzazione, raccolta dati di diffrazione, e modello Refinement <ol><li> Eseguire prove di cristallizzazione utilizzando un robot cristallizzazione. </li><li> Crescere cristalli di vapo diffusione a 18 ° C tramite la tecnica calo seduto in una piastra a 96 pozzetti con un serbatoio contenente 60 ml di tampone cristallizzazione (acqua madre) 21. </li><li> Concentrare il Phla solubile a circa 10 mg / ml (0,2 mM) in tampone cristallo facendo girare a 3000 xg in una centrifuga concentratore cut-off di peso molecolare 10 kDa. </li><li> Per le strutture co-complesso, mescolare il TCR e Phla in un rapporto 1: 1 molare per ottenere una soluzione proteica di circa 10 mg / ml (0,1 mM). </li><li> Aggiungere 200 nL di Phla sola, o 1: 1 rapporto molare della miscela di TCR e Phla, a 200 nL di ciascuna soluzione serbatoio dalla schermata di cristallizzazione utilizzando un robot cristallizzazione e segnare per cristalli al microscopio dopo 24 h, 48 h, 72 h, e poi una volta a settimana. </li><li> Harvest cristalli singoli di montarli manualmente in crio-loop sotto un microscopio e crio-raffreddare immergendo e la loro memorizzazione in azoto liquido (100 K). NOTA: Caricamento cristalli prende un po &#39;di PRACTice, e decidere quali cristalli sono abbastanza buono per la raccolta dei dati viene con l&#39;esperienza. Come regola generale, il più grande e più regolare il cristallo, il migliore. </li><li> Raccogliere dati in un flusso di gas di azoto a 100 K. NOTA: questi dati è stata acquisita presso il Diamond Light Source (DLS) impianto di scienza di sincrotrone nazionale nel Regno Unito. </li><li> Analizzare i dati stimando le intensità di riflessione con xia2 utilizzando sia 22 MOSFLM e XDS pacchetti 23, e poi scalare i dati con SCALA o AIMLESS 24 e il pacchetto CCP4 25. </li><li> Risolvere le strutture con la sostituzione molecolare utilizzando PHASER 26. </li><li> Regolare il modello con COOT 27 e perfezionare il modello con REFMAC5 28. </li><li> Preparare rappresentazioni grafiche con PyMOL 29. </li><li> Calcolare i contatti utilizzando il &quot;contatto&quot;programma nel pacchetto CCP4. Utilizzare un cut-off 4 A per van der Waals e un 3.4 un cut-off per i legami idrogeno e ponti salini. </li><li> Calcola complementarità superficie utilizzando il programma &quot;SC&quot; nel pacchetto CCP4. </li><li> Calcolare l&#39;angolo di incrocio del complesso TCR-Phla, come descritto 30. NOTA: Per questo studio, i dati di riflessione e le coordinate finali del modello sono stati depositati presso la banca dati PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 e A2 -YLE-5A PDB: 5EU5). </li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse o interessi finanziari concorrenti.

I protocolli descritti qui forniscono un quadro per la dissezione molecolare e cellulare di risposte delle cellule T nel contesto di una malattia umana. Anche se il cancro è stato l&#39;obiettivo principale di questo studio, abbiamo utilizzato metodi molto simili a indagare le risposte delle cellule T a virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 e durante l&#39;autoimmunità 38, 39, 40. Inoltre, abbiamo usato queste tecniche in modo più ampio per comprendere i principi molecolari che governano cellule T riconoscimento dell&#39;antigene 2, 19, 41, 42. In effetti, la natura imprevedibile di modifiche al peptide residui, anche quellial di fuori della dei residui di contatto TCR, il riconoscimento impatti delle cellule T ha importanti implicazioni per la progettazione di peptidi eterocliti. Questi risultati hanno contribuito direttamente allo sviluppo di nuove terapie cellule T, i vaccini peptidici 6, 43 e TCR alta affinità artificiali 3, 4, 5, 20, 44, nonché della diagnostica potenziate 45, 46, 47. Passaggi critici all&#39;interno del protocollo La generazione di una proteina altamente pura, funzionale è essenziale per tutti i metodi descritti nel presente documento. Modifiche e risoluzione dei problemi Le difficoltà nel generare proteine ​​altamente puro spesso interessano la espressione altamentepuro al, insolubile IBs dal sistema di espressione di E. coli. Di solito, la modifica del protocollo di espressione (ad esempio, inducendo a differenti densità ottiche, utilizzando diversi ceppi di E. coli, o con diverse formazioni di media) risolve questi problemi. Limitazioni della tecnica Queste tecniche utilizzano molecole proteiche solubili (TCR e Phla) che normalmente vengono espressi sulla superficie cellulare. Pertanto, è importante garantire che / risultati biofisici strutturali sono coerenti con approcci cellulari per confermare significato biologico. Importanza della tecnica rispetto ai metodi esistenti / alternativi Attraverso l&#39;uso di cristallografia a raggi X e biofisica giustificati attraverso l&#39;analisi funzionale, noi e altri hanno dimostrato che il TCR specifico per epitopi tumorali sono generalmente caratterizzati da bassi affinità di legame 48. Questa bassa affinità TCR può aiutare a spiegare il motivo per cui le cellule T are non naturalmente efficace a chiarire il cancro. Ad alta risoluzione delle strutture atomiche di complessi tra TCR anti-cancro e antigeni tumorali affini stanno iniziando a rivelare le basi molecolari per questa affinità debole. Inoltre, questi studi sono utili per determinare i meccanismi che sono alla base degli interventi terapeutici volti a superare questo problema, semina futuri miglioramenti 16. In questo studio, abbiamo esaminato la prima struttura di un αβTCR presenti naturalmente in complesso con un gp100 HLA-A * 0201-ristretta melanoma epitopo. La struttura, combinata con un esame biofisico approfondito, ha rivelato la modalità generale vincolante dell&#39;interazione. Abbiamo anche scoperto un interruttore molecolare, inaspettato, che si è verificato in una forma mutata del peptide, che ha abrogato TCR vincolante (valutata mediante risonanza plasmonica di superficie) e CD8 + riconoscimento delle cellule T (esperimenti funzionali). E &#39;stato possibile solo per dimostrare questo nuovo meccanismo di HLA Presentati antigeneon utilizzando i metodi descritti ad alta risoluzione. Le future applicazioni o direzioni Dopo aver imparato questa tecnica Nel complesso, i nostri risultati dimostrano il potere della cristallografia a raggi X e metodi biofisici quando combinato con robuste analisi funzionali. Utilizzando questi approcci, è possibile sezionare meccanismi molecolari precise che governano riconoscimento dell&#39;antigene T-cellule. Infatti, è anche possibile utilizzare questo approccio per risolvere la struttura di unligated TCR, dimostrando come cambiamenti conformazionali possono svolgere un ruolo durante antigene discriminazione 49, 50, 51. Una migliore comprensione della natura altamente complesso e dinamico che è alla base delle interazioni TCR-Phla ha anche implicazioni evidenti per la progettazione della terapia. Poter direttamente &quot;vedere&quot; le molecole che vengono terapeuticamente mirati, nonché l&#39;effetto che le modifiche hanno sulle antigene recognition, sarà chiaramente migliorare lo sviluppo di questi farmaci per il futuro. In questo studio, dimostriamo che anche modifiche in un singolo residuo peptide che non è fortemente impegnata da un TCR possono imprevedibilmente trasmettere modifiche strutturali ad altri residui del peptide HLA-bound, che, a sua volta, altera drasticamente riconoscimento T-cellule. Una comprensione più completa dei meccanismi molecolari utilizzati durante il riconoscimento dell&#39;antigene T-cella sarà estremamente utile quando si progetta future terapie per una vasta gamma di malattie umane.

Cristallografia a raggi X è stata e continuerà ad essere, una tecnica estremamente potente per comprendere la natura delle interazioni ligando-recettore. Visualizzando queste interazioni in dettaglio atomico, non solo è possibile divulgare i meccanismi molecolari che regolano molti processi biologici, ma è anche possibile modificare direttamente interfacce contatti beneficio terapeutico. Accoppiato con tecniche come la risonanza plasmonica di superficie e Calorimetria isotermica di titolazione (solo per citarne un paio), tali modifiche possono poi essere analizzati biofisico, per valutare l&#39;impatto diretto sulla affinità di legame, cinetiche di interazione, e la termodinamica. Infine, effettuando esperimenti funzionali in tipi di cellule interessate, un quadro dettagliato dell&#39;impatto molecolare e funzionale delle modifiche alle interazioni recettore-ligando possono essere raccolte, fornendo informazioni molto specifiche meccanicistico. In generale, questi tipi di metodi forniscono un&#39;immagine atomico risoluzione permettendo scoraggiare<html> minazione di come i sistemi biologici lavorare, con implicazioni connesse per i progressi diagnostici e terapeutici. Il nostro laboratorio utilizza abitualmente queste tecniche per studiare i recettori che mediano l&#39;immunità umana a cellule T agli agenti patogeni e tumori, in autoimmunità, e durante il trapianto. Qui, ci concentriamo sulla risposta delle cellule T CD8 + umani al cancro, mediato da una interazione tra il recettore delle cellule T (TCR) e antigene leucocitario umano (HLA) peptidi tumorali derivate -restricted (Phla). Questo è importante perché, anche se le cellule T CD8 + sono in grado di indirizzare le cellule tumorali, noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che TCR anti-cancro subottimale si legano alla loro Phla cognate 1, 2. Così, molti laboratori hanno tentato di alterare sia il TCR 3, 4, 5 o il ligando peptide 6,class = &quot;xref&quot;&gt; 7, 8 per aumentare l&#39;immunogenicità e per meglio cellule tumorali bersaglio. Tuttavia, questi approcci non sono sempre efficaci e possono avere gravi effetti collaterali, tra cui fuori bersaglio tossicità 4, 9, 10. Ulteriori ricerche esplorando i meccanismi molecolari che regolano il riconoscimento delle cellule T di antigeni tumorali sarà fondamentale per superare queste carenze. Nel presente studio, ci siamo concentrati sulle risposte contro le cellule di melanoma autologhe da cellule T CD8 + specifiche per un frammento dell&#39;antigene differenziazione dei melanociti glicoproteina 100 (gp100), gp100 280-288, presentati da HLA-A * 0201 (il più comunemente -expressed classe Phla umana I). Questo antigene è stato un obiettivo ampiamente studiato per il melanoma immunoterapia ed è stato sviluppato come un cosiddetto peptide &quot;eterocliti&quot; in cui una valina sostituisce alaninain posizione di ancoraggio 9 per migliorare la stabilità Phla 11. Questo approccio è stato utilizzato per migliorare l&#39;induzione di CTL melanoma-reattiva in vitro ed è stato usato con successo in studi clinici 12. Tuttavia, modifiche ai residui peptidici possono avere effetti imprevedibili sulla specificità delle cellule T, dimostra la scarsa efficacia della maggior parte dei peptidi heterolitic nella clinica 6, 13. Infatti, un&#39;altra forma eterocliti di gp100 280-288, in cui i residui del peptide Glu3 sostituito da Ala, abrogata riconoscimento da parte di una popolazione policlonale di GP100 280-288 cellule T specifico d&#39;14, 15. Abbiamo precedentemente dimostrato che anche piccoli cambiamenti nei residui del peptide di ancoraggio possono alterare in modo sostanziale il riconoscimento delle cellule T in modo imprevedibile 6, 16. Pertanto, lo studio ha analizzato costruireing un quadro più dettagliato di come le cellule T CD8 + riconoscono GP100 e come modifiche dell&#39;interazione tra TCR e Phla potrebbe avere un impatto tale funzione. Qui, abbiamo generato, forme solubili altamente pure di due TCR specifici per gp100 280-288 presentati da HLA-A * 0201 (A2-YLE), nonché le forme naturali e alterati di Phla. Questi reagenti sono stati utilizzati per generare cristalli di proteine ​​per risolvere la struttura atomica ternaria di un TCR umana in complesso con forma eterocliti di A2-YLE, nonché due dei pHLAs mutanti in forma unligated. Abbiamo poi utilizzato un approccio di scansione peptide per dimostrare l&#39;impatto delle sostituzioni peptidici il TCR eseguendo approfondita esperimenti biofisici. Infine, abbiamo generato una linea di cellule T CD8 + geneticamente modificati, ri-programmati per esprimere uno dei TCR specifici A2-YLE-, per eseguire esperimenti funzionali per testare l&#39;impatto biologico delle varie modifiche peptidici. Questi dati dimostrano che anche Modìfiche di peptide residui che si trovano al di fuori del motivo di legame TCR può avere imprevedibili effetti a catena sui residui peptidici adiacenti che abrogare vincolante TCR e il riconoscimento delle cellule T. I nostri risultati rappresentano il primo esempio dei meccanismi strutturali sottostanti riconoscimento cellule T di questo importante obiettivo terapeutico per il melanoma.

<table><tbody><tr><td>S.O.C. media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit incubatore</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbenicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Fisher</tr><tr><td>Quick Coomassie Stain SafeStain&nbsp;</td><td>Centrifuga Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT&nbsp;</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio Fisher&nbsp;</td><td>Arcos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td> Fisher<td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls HD 2070&nbsp;</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Fisher</tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Guanidina di Fisher</td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Fisher</tr><tr><td>NanoDrop ND1000&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptidi</td><td>Peptidi Ricerca</td><td></td><td></td>sulle proteine</tr><tr><td>ditiotreitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arginina&nbsp;</td><td>Cisteamina SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cistamina di Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi Fisher&nbsp;</td><td>Urea Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0.45 &mu; m filtro a membrana</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>Biosistemi</td><td></td><td></td> applicati</tr><tr><td>&Auml; Sistema FPLC puro KTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare Scienze</td><td></td><td></td>della vita</tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&nbsp;</td><td>Colonna Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato</td><td>Oxoid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore tampone HBS&nbsp;</td>Kit di biotinilazione per le scienze <td></td><td></td><td>della vita di GE Healthcare</td></tr><tr><td></td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td> Kit di accoppiamento chip CM5 per <td>le scienze</td><td></td><td></td>della vita</tr><tr><td></td><td>di GE Healthcare Streptavidina per le scienze</td><td></td><td></td>della vita</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal VP-ITC&nbsp;</td><td>GE Healthcare Scienze</td><td></td><td></td>della vita</tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon robot di cristallizzazione</td><td>Art Robbins Strumenti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-plate&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schermi e reagenti per cristallizzazione</td><td>Dimensioni</td><td></td><td></td>molecolari</tr><tr><td>75 cm2 pallone&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtri</td><td>Miller-GP, provetta per ultracentrifuga Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP con rotore SW28</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 microsfere&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3/CD28 Dynabeads&nbsp;</td><td>Microsfere anti-PE Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK medium, PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TCRV&beta; mAb&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>dasatinib&nbsp;</td><td>Assone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&beta; e TNF&alfa; ELISA&nbsp;</td><td>R& </td><td></td><td></td>Sistemi D</tr><tr><td>&nbsp; 51Cr&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Contatore Microbeta</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando cristallografia a raggi x, biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule t del recettore riconoscimento di cancro antigeni

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

I linfociti T citotossici CD8+ umani (CTL) sono noti per svolgere un ruolo importante nel controllo dei tumori. Per svolgere questa funzione, il recettore delle cellule T (TCR) espresso sulla superficie cellulare deve riconoscere funzionalmente i peptidi derivati dal tumore (pHLA) ristretti dall'antigene leucocitario umano (HLA). Tuttavia, noi e altri abbiamo dimostrato che la maggior parte dei TCR si lega in modo sub-ottimale agli antigeni tumorali. Scoprire i meccanismi molecolari che definiscono questo scarso riconoscimento potrebbe aiutare nello sviluppo di nuove terapie mirate che aggirano queste carenze. In effetti, le terapie attuali che mancano di questa comprensione molecolare non sono state universalmente efficaci. Qui, descriviamo i metodi che comunemente impieghiamo in laboratorio per determinare come la natura dell'interazione tra TCR e pHLA governi la funzionalità delle cellule T. Questi metodi includono la generazione di TCR solubili e pHLA e l'uso di questi reagenti per la cristallografia a raggi X, l'analisi biofisica e la colorazione delle cellule T antigene-specifiche con multimeri pHLA. Utilizzando questi approcci e guidati dall'analisi strutturale, è possibile modificare l'interazione tra TCR e pHLA e quindi testare come queste modifiche influiscono sul riconoscimento dell'antigene delle cellule T. Questi risultati hanno già contribuito a chiarire il meccanismo di riconoscimento delle cellule T di un certo numero di antigeni tumorali e potrebbero indirizzare lo sviluppo di peptidi alterati e TCR modificati per nuove terapie antitumorali.

Qui, descriviamo i metodi che comunemente impieghiamo in laboratorio per determinare come la natura dell'interazione tra il recettore delle cellule T e gli antigeni tumorali, presentati dagli antigeni dei leucociti umani, governa la funzionalità delle cellule T; questi metodi includono la produzione di proteine, la cristallografia a raggi X, la biofisica e gli esperimenti funzionali sulle cellule T.

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare proteine HLA del recettore delle cellule T ricumbinate solubili e peptidiche di qualità sufficiente per l'uso in analisi biofisiche e strutturali. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande nel campo dell'immunologia delle cellule T. Ad esempio, perché le cellule T non rispondono in modo robusto al cancro?Il vantaggio principale di questa tecnica è che otteniamo dati meccanicistici ad altissima risoluzione che spiegano come i recettori delle cellule T riconoscono i loro bersagli, portando a risposte immunitarie mediate dalle cellule T. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di praticamente qualsiasi malattia umana perché le cellule T svolgono un ruolo fondamentale nella maggior parte delle risposte immunitarie. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle risposte immunitarie delle cellule T, può essere applicato anche ad altri sistemi controllati dalle interazioni dei ligandi recettoriali.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è molto difficile generare proteine solubili e attive di qualità sufficiente per esperimenti biofisici e strutturali. Per iniziare la procedura di ripiegamento del peptide HLA a sei millilitri di tampone guanidina con 10 milometri di ditiotreitolo, aggiungere 30 milligrammi di corpi di inclusione HLA-A2, 30 milligrammi di corpi di inclusione beta 2-M e quattro milligrammi del peptide desiderato di interesse. Incubare la miscela per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi, diluire la miscela con un litro di HLA refold buffer, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius e mescolare la miscela per tre ore a quella temperatura. Dializzare la miscela due volte contro 20 litri di tris da 10 millimolari, pH 8,1, per 24 ore ciascuna. Per iniziare la procedura di ripiegamento del TCR, a sei millilitri di tampone guanidina con 10 millimolari di ditiotreitolo, aggiungere 30 milligrammi ciascuno di TCR alfa e beta a catena IB.Incubare la miscela per 30 minuti a 37 gradi Celsius e diluire la miscela in un litro di tampone refold TCR pre-raffreddato. Mescolare e dializzare la miscela diluita di TCR refold allo stesso modo della miscela di peptidi HLA. Filtrare entrambe le miscele refold dializzate attraverso un filtro a membrana da 0,45 micrometri.Successivamente, caricare una delle preparazioni refold filtrate su una colonna di resina a scambio anionico da 7,9 millilitri e 50 micrometri, pre-bilanciata con 20 millilitri di tris da 10 millimolari, pH 8,1. Eluire la proteina con un sistema tampone a gradiente salino a cinque millilitri al minuto. Raccogli frazioni da un millilitro e analizza le frazioni con SDS-Page.Combina le frazioni contenenti la proteina ripiegata. Mettere la miscela proteica in un concentratore centrifugo da 10 kilodalton di taglio del peso molecolare. Centrifugare la miscela per 20 minuti o per il tempo necessario, a 4000 volte g, per concentrare la miscela a 500 microlitri.Scartare il flusso attraverso. Modellare il preparato proteico concentrato in un circuito di iniezione da due millilitri e iniettare la proteina su una colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni da 24 millilitri, pre-bilanciata con il tampone di elusione appropriato. Eluire la proteina con un volume di colonna di tampone a 0,5 millilitri al minuto.Raccogli frazioni da un millilitro, analizza le frazioni con SDS-Page e combina le frazioni contenenti la proteina di interesse. Preparare 10 diluizioni seriali della soluzione di TCR, in un intervallo di concentrazione compreso tra 10 volte al di sopra e 10 volte al di sotto della KD dell'interazione HLA del peptide TCR specifico, se nota. In caso contrario, iniziare da una concentrazione di TCR di 200 micromolari.Successivamente, attivare un chip sensore rivestito di destrano carbossimetilato facendo scorrere una miscela uno a uno di 100 millimolari e N-idrossisuccinimide e 400 millimolari EDC sul chip a una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto per 10 minuti, a 25 gradi Celsius. Quindi, caricare 110 microlitri di streptavidina da 200 microgrammi per millilitro e 10 millimolari di acetato pH 4,5 in tutte e quattro le celle di flusso per funzionalizzare la superficie del chip. Disattivare tutti i gruppi reattivi rimanenti con 100 microlitri di un molare di etanolammide cloridrato.Quindi, far scorrere una soluzione di circa un peptide micromolare HLA nel tampone fornito dal produttore del chip sulla superficie del chip a 10 microlitri al minuto fino a quando il numero di unità di risposta non aumenta da 500 a 600. Saturare la superficie del chip con un millimolare di biotina e il tampone fornito dal produttore per 60 secondi. Quindi, iniettare le 10 diluizioni seriali della soluzione TCR a 30 microlitri al minuto a 25 gradi Celsius.Calcola la costante di legame di equilibrio ed esegui un'analisi cinetica. Eseguire una serie di esperimenti SPR in questo modo, variando solo la temperatura alla quale vengono iniettate le diluizioni di TCR. Determinare la costante di legame di equilibrio per ogni temperatura e calcolare le energie di Gibbs e altri parametri termodinamici.Collegare le energie di Gibbs alla temperatura utilizzando un adattamento di regressione non lineare. Concentrare la soluzione di peptide HLA a 0,2 millimolari e tampone di cristallizzazione mediante centrifugazione a 3.000 volte g, in un concentratore centrifugo con cutoff di peso molecolare da 10 kilodalton. Preparare una soluzione 0,1 millimolare di TCR uno a uno e HLA peptidico per la cristallizzazione del co-complesso.Utilizzando un robot di cristallizzazione e un kit di screening, preparare le prove di cristallizzazione utilizzando la tecnica della goccia seduta in una piastra a 96 pozzetti. Con 60 microlitri di tampone di cristallizzazione in ogni serbatoio e ogni goccia composta da 200 nanolitri ciascuno di soluzione proteica e tampone. Fai crescere i cristalli a 18 gradi Celsius.Punteggio per i cristalli al microscopio dopo 24 ore, 48 ore, 72 ore e poi settimanalmente. Una volta che i singoli cristalli sono cresciuti di qualità sufficiente, raccogliere i singoli cristalli con un ciclo compatibile con il criogeno e conservare i cristalli in azoto liquido. Eseguire la diffrazione dei raggi X di sincrotrone sotto un flusso di azoto gassoso a 100 kelvin, analizzare i dati e risolvere le strutture con il software appropriato.Calcola i contatti, la complementarità della superficie e l'angolo di incrocio dalle strutture risolte. Utilizzando questi metodi, le molecole di TCR e peptide HLA sono state espresse e ripiegate in una forma solubile. Il peptide nelle molecole di peptide HLA era l'antigene gp100.SPR è stato utilizzato per determinare l'affinità di legame del TCR PMEL17 per l'antigene a varie temperature. Sono state quindi utilizzate sia la titolazione calorimetrica SPR che quella calorimetrica isotermica, per determinare i parametri termodinamici dell'interazione proteina-proteina. Il complesso PMEL17 TCR A2-YLE-9V è stato cristallizzato e valutato con diffrazione di raggi X di sincrotrone.Sono stati identificati i loop TCR CDR e i residui peptidici HLA entrati in contatto con la proteina TCR ed è stata studiata la natura dei contatti. Anche le molecole di peptide HLA con forme mutate del peptide sono state purificate e cristallizzate in questo modo. Studiare le differenze strutturali che potrebbero impedire le interazioni di legame con il TCR.È stato riscontrato che la mutazione del terzo o quinto residuo modifica significativamente la posizione della prolina quattro, interrompendo molti dei contatti con il TCR CDR-3 Alpha Loop. Durante il tentativo di questa procedura, è importante selezionare solo le proteine più pure per ulteriori analisi. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la colorazione con peptidi HLA tetrameri, possono essere eseguiti utilizzando le proteine solubili al fine di isolare le cellule T antigene-specifiche dal sangue del paziente per la diagnostica e ulteriori analisi.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia delle cellule T per esplorare il legame HLA del peptide TCR in modo squisitamente dettagliato, consentendo lo sviluppo di nuovi farmaci per il cancro e altre malattie umane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare proteine TCR e peptidiche HLA di qualità sufficiente per eseguire analisi biofisiche e strutturali.

using-x-ray-crystallography-biophysics-functional-assays-to-determine

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il saggio di rilascio di cromo, un test comune per rilevare l'attività delle cellule T citotossiche, ha diversi limiti. Utilizzando cellule T CD8 antigene-specifici e la linea tumorale umano cancro al seno, SKBR3, nel presente articolo, un approccio basato impedenza è stata esaminata per la capacità di rilevare uccisione delle cellule.

Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Un flusso di analisi basate su cytometry cellulare obbligatoria è descritto che è utilizzato principalmente come uno strumento di screening per identificare i composti che inibiscono il legame di un ligando di chemochine CXC fluorescente contrassegnato 12 (CXCL12) al recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4).

Un'analisi di citometria-basata di flusso per identificare i composti che interrompono il grippaggio del Ligand di Chemokine CXC fluorescente etichettati 12 al recettore di chemochine CXC 4

Questo documento utilizza un flusso cytometry-test per librerie di schermo di inibitori chimici per l'identificazione di inibitori e ai loro obiettivi che influenzano la segnalazione del ricevitore della T-cellula. I metodi descritti qui possono essere espanso per high throughput screening.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Qui, descriviamo un metodo di co-coltura in vitro di cellule di T del tumore targeting sfida in modo ricorsivo, che consente analisi fenotipica e funzionale di attività antitumorale delle cellule T.

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet per visualizzare in modo quadridimensionale le dinamiche del recettore superficiale nelle cellule vive. Qui vengono mostrati i recettori delle cellule T su CD4- cellule T primarie.

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.

Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

Qui viene presentato un protocollo per radiomarcare le cellule con un radioisotopo per tomografia a emissione di positroni (PET), 89 Zr (t1/2 78,4 h), utilizzando un sintetizzatore radiomarcante pronto all'uso, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina ([89Zr]Zr-DBN). La radiomarcatura delle cellule con [89Zr]Zr-DBN consente il monitoraggio e l'imaging non invasivi delle cellule radiomarcate somministrate nell'organismo con PET fino a 7 giorni dopo la somministrazione.

Tomografia a emissione di positroni Imaging del traffico cellulare: un metodo di radiomarcatura cellulare

Scopri come generare proteine TCR e HLA solubili per analisi biofisiche e strutturali mediante cristallografia a raggi X. Questo metodo rivela i meccanismi di riconoscimento degli antigeni tumorali da parte dei recettori delle cellule T.

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni (Video) | JoVE Journal

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Esplora altri video