Name: X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 학습하세요 T세포 수용체와 펩타이드 HLA 단백질을 생성하여 X선 결정학과 생물물리학 분석을 수행하는 방법을. 이 기법은 암 면역요법을 위한 고해상도 구조 데이터를 제공합니다.

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BM은 영국 암 연구 박사 과정 재학 지원됩니다. AG는 생명 과학 연구 네트워크 웨일즈 박사 과정 재학 지원됩니다. VB는 암 연구 웨일즈 박사 과정 재학 지원됩니다. DKC는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 연구 경력 개발 연구원 (WT095767)입니다. AKS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 탐정이다. GHM은 공동으로 생명 과학 연구 네트워크 웨일즈 Tenovus 암 치료 박사 과정 재학 재정 지원된다. 우리는 시설과 지원을 제공하기 위해 다이아몬드 광원에서 직원을 감사드립니다.

1. 단백질 발현 <ol><li> 앞서 17, 18에서 상세히 설명한 바와 같이, 가용성 TCR도 및 pHLAs의 생성에 유전자 작 제물을 만든다. 5 &#39;를 BamH1 및 3&#39;는 pGMT7 벡터에 삽입 EcoR1 제한 사이트 구성 각 디자인합니다. </li><li> 4 ℃에서 50 내지 200 NG / 5 분 동안 대장균의 5 μL와 μL 플라스미드 1 μL를 배양하여 관심의 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 pGMT7 유래 플라스미드 벡터로 대장균 로제타 (DE3) pLysS를 변환 42 ℃에서 2 분, 4 ℃에서 5 분, 50 밀리그램 / L의 카르 베니 실린이 보충하는 LB 한천 플레이트에 37 ℃에서 하룻밤 접시. </li><li> 개별 식민지를 선택하고 정지 할 때까지 100 μM의 카르 베니 실린이 보충 된 37 ° C, 220 rpm으로 30 ㎖ TYP 미디어에서 (16g /의 L 트립 톤, 16g / L의 효모 추출물, 및 5g / L HK 2 O 4)로 성장 광학 드에 도달nsity 0.4 내지 0.6의 (OD 600). </li><li> 3 시간 동안 0.5 mM의 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 도입하여 5 ㎖ 분취 량의 단백질 생산을 유도한다. 와 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석 유도없이 현탁액 20 μL를 유지하고, 겔을 염색. </li><li> 100 μM의 카르 베니 실린이 보충 TYP 1 L에 스타터 배양액을 첨가하고, 현탁액을 0.4 내지 0.6 사이에서 OD (600)에 도달 할 때까지 단계 130에서 전술 한 바와 같이 세포를 성장한다. </li><li> 0.5 mM의 IPTG와 함께 3 시간 동안 단백질 발현을 유도한다. 3,000 XG에서 20 분 동안 세포를 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 붓는다. </li><li> 2의 간격을 이용하여 30 분간 60 %의 전력에 대해, 얼음에 초음파 처리를 용해 완충액 40 ㎖의 펠렛을 용해시키고 (10 % 글리세롤, 10 mM 염화 마그네슘,의 MgCl 2, 150 mM의 NaCl을 10 mM 트리스, pH를 8.1) 0.1 g / L DNase를 30 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다. </li><li> 가 SUS 치료세척 완충액 100㎖로 봉입체 (IB)의 형태로 함유하는 단백질 연금 (0.5 % 트리톤 X-100, 50 mM 트리스, pH가 8.1, 100 mM의 염화나트륨 및 10 mM의 EDTA). </li><li> 4 ° C에서 20 분 8,000 XG에 대한 샘플을 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 다시 서스펜션 버퍼 100 ㎖의 펠렛 일시 중지 재 (100 mM의 NaCl을 50 mM 트리스, pH가 8.1 mM의 EDTA, pH가 8.1, 10), 원심 분리기 이전 8,000 XG에 조심스럽게 상층 액을 붓는다. </li><li> 마지막으로, 구아니딘 완충액 10ml에 펠렛을 용해 (6 M 구아니딘, 50 mM 트리스, pH가 8.1, 2 mM의 EDTA, pH가 8.1, 100 mM의 염화나트륨)과 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서의 단백질 농도를 측정한다. </li></ol> 2. pHLA 및 TCR 리 폴딩 <ol><li> pHLA의 refolds 들어, 최종 부피 수욕에서 37 ℃에서의 IB를 (비오틴 태그 또는 HLA-A2) β2m의 IB 30 ㎎, 30 분 동안 펩티드 4 mg의 HLA-A2의 30 mg을 혼합 10 mM의 디티 오 트레이 톨로 보충 구아니딘 완충액 6 mL를(DTT). </li><li> 미리 냉각 된 HLA의 폴딩 완충액 1 L의 이전 믹스를 희석하여 단백질을 리 폴딩을 시작 (50mM 트리스, pH가 8.1 400 밀리미터 L 아르기닌, 2 mM의 EDTA, pH가 8.1 6 밀리미터 시스 테 아민, 4 밀리미터 시스 타민). </li><li> HLA 3 시간 동안 4 ℃에서 교반 접힘 후 12.4 kDa의 MWCO로 (분자량 컷 - 오프) 투석 튜브를 전송하고 10 mM 트리스, 산도 8.1의 20 L에 대해 24 시간 동안 두 번 투석 둡니다. </li><li> TCR에의 refolds를 들어, 10 mM의 DTT 보충 구아니딘 완충액 6 mL의 수욕에서 37 ° C에서 30 분 동안 TCR α 쇄의 IB 30 mg의 TCR β 사슬의 IB 30mg을 섞는다. </li><li> 미리 냉각 된 TCR의 폴딩 완충액 1 L로 변성 TCR 혼합물을 희석하여 단백질을 리 폴딩을 시작 (50mM 트리스, pH가 8.1, 2.5 M 우레아, 4 밀리미터 시스 타민 2 mM의 EDTA, pH가 8.1, 6 밀리미터 시스 테 아민) 3 대 시간. </li><li> 12.4-kDa의 MWCO 투석 튜브에 접힘을 전송하고 10 mM 트리스, 산도 8.1의 20 L에 대해 24 시간 동안 두 번 투석. </li><li> pHLA 또는 TCR 심판 모두 필터정제 단계는 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 세. </li></ol> 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 3. 정제 (FPLC) <ol><li> 7.9 mL의에 필터링 된 폴딩 준비 (pHLA 또는 TCR를)로드, 50 μm의 음이온 교환 수지 컬럼은 10 mM 트리스, 유연하고 직관적 인 크로마토 그래피 시스템의 pH 8.1의 20 mL로 미리 평형. </li><li> (8 열 권 이상, 10 mM 트리스에서 0-500 밀리미터의 NaCl, pH를 8.1) 소금 그라데이션 5 mL / 분에서 단백질을 용출하고 1 ML의 분수를 수집합니다. </li><li> 함께 관심있는 단백질을 함유하는 분획을 풀링, SDS-PAGE에 의해 관심의 단백질에 대응하는 분획을 분석하고 4000 XG에서 20 분 동안 원심 분리에 의해 10 kDa의 500 μL에 MWCO 20 또는 10 kDa의 MWCO 4 그들을 집중 상기 플로우 스루 폐기. </li><li> 24 mL의 크기 배제 크로마토 그래피 칼럼에 2 mL를 주입 루프에 집중 단백질 제제를로드 앱으로 미리 평형ropriate 용출 완충액 : 인산 완충 식염수 (PBS), HBS (10 mM의 HEPES, pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 3.4 mM의 EDTA, 0.005 % 계면 활성제), 또는 결정 완충액 (10 mM 트리스, pH가 8.1, 10 mM의 NaCl을 ). </li><li> 0.5 mL / 분 칼럼 부피 일 이상의 유동 속도에서의 단백질을 용출; SDS-PAGE에 의해 확인 관심의 단백질을 포함하는 1 ML의 분수를 수집합니다. 참고 :이 방법은 수용성 PMEL17 TCR 및 gp100 TCR도뿐만 아니라 본 연구에 사용 된 pHLAs의 모든으로 생성하는 데 사용했다 : HLA-A를 * 0201와 YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 도 7a) 또는 YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석 <ol><li> CM5 센서 칩 (19)을 구비 한 분자 상호 작용의 분석 시스템을 사용하여 평형 결합 분석 또는 열역학적 분석을 수행한다. </li><li> F에 의해 CM5 칩을 활성화과 같은 1 : 10 μL / 분의 유속 및 25 ℃에서 10 분 동안 100 mM의 N- 히드 록시 숙신이 미드 (NHS), 400 mM의 1- 에틸 -3- (3- 디메틸) -carboiimide (EDC)의 혼합물 1 기음. </li><li> 네 플로우 셀에 상기 칩 표면에 결합 및 해제 1 M 에탄올 아민 염산염 100 μL를 사용하여 공유 결합에 의해로드 약 5000 반응 단위 (10mM의 아세트산에서 200 μg의 110 μL가 / ㎖, pH를 4.5) (RU) 스트렙 타비 딘 나머지 반응기. </li><li> pHLA 커플 약 500-600 RU 10 μL / 분의 느린 유속에서 CM5 센서 칩 (제조사에 의해 제공됨) 상용 버퍼 ~ 1 μM에서 칩 표면에 균일 한 분포를 보장한다. </li><li> 60 초 동안 (제조업체에서 제공) 상업 버퍼에 1 mM의 비오틴과 칩 표면을 포화. </li><li> 25 ° C에서 30 μL / 분의 높은 유량에 관련된 유동 - 세포 위에 가용성 TCR도 십 희석액을 주입한다. </li><li> 평형 결합 상수를 계산(K D (E))은 비선형 곡선 맞춤 (Y = (P1x) / (P2 + X)) (20)를 이용하여 값. 참고 : Y = 응답 장치, X = 애널리스트 농도, P1 = r에 최대, P2 = K D. </li><li> 1 가정 동력학 분석을 수행한다 : 1 랭 뮤어 결합 및 소프트웨어 패키지 (2)의 글로벌 맞춤 알고리즘을 사용하여 데이터를 장착한다. </li><li> 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, 30 ° C (19) 다음의 온도에서이 방법을 반복하여 열역학 실험을 수행합니다. </li><li> 표준 열역학 식 (ΔG ° = -RTlnK D) (19)를 사용하여 ° ΔG를 계산하기 위해 다른 온도에서 SPR에 의해 결정되는 K D 값을 사용합니다. 참고 : R = 기체 상수, T K에서 = 온도, LN = 자연 로그. </li><li> 19 - 깁스 - 헬름홀츠 방정식 (TΔS ° ΔG ° = ΔH)에 따라 열역학적 매개 변수를 계산합니다. </리&gt; <li> (세 파라미터 방정식에 맞는 비선형 회귀를 이용하여 온도에 대한 결합 자유 에너지, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), (K)를 플롯 Y = ΔH + ΔCp * (X-298)를 -x * ΔS- X * ΔCp * LN (X / 298)) 19. 참고 : X = ΔG °, K에서 Y = 온도. </li></ol> 5. 등온 적정 열량계 (ITC) <ol><li> 등온 적정 열량계를 사용하여 ITC 실험을 수행합니다. 주사기에 열량계 셀 및로드 210 μM 가용성 TCR을에 30 μM pHLA을 주입한다. 20 mM의 헤 페스 150 mM의 NaCl을 함유하는 (PH 7.4) : 다음 버퍼 조건을 사용합니다. </li><li> 20 TCR 주사, 2 μL 볼륨의 각을 수행합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 ΔH 및 K D를 계산합니다. </li></ol> 6. 결정화, 회절 데이터 수집 및 모델 정교화 <ol><li> 결정화 로봇을 사용하여 결정화 실험을 수행합니다. </li><li> VAP에 의해 결정 성장또는 결정화 버퍼의 60 μL (모액) (21)를 포함하는 저수지와 96 웰 플레이트에 앉아 드롭 기술을 통해 18 ° C에서 확산. </li><li> 10 kDa의 분자량 컷 - 오프 원심 농축기에서 3,000 XG에서 회전에 의해 결정 버퍼에 약 10 ㎎ / ㎖ (0.2 밀리미터)에 용해 pHLA을 집중한다. </li><li> 약 10 ㎎ / ㎖ (0.1 mM)을 단백질 용액을 얻었다 : 1 몰비로 공동 복잡한 구조를 들면, 하나의 TCR 및 pHLA 섞는다. </li><li> 24 시간, 48 시간, 72 후 현미경으로 결정을 위해 TCR과 pHLA 1 몰비 믹스, 결정화 로봇을 사용하여 결정화 화면에서 각 저장 솔루션의 200 (NL)로하고 점수 : 단독 200 거리 nL pHLA의 추가 또는 1 시간 후 일주일에 한 번. </li><li> 수동 현미경에서 극저온 루프에서 그들을 장착하여 수확 단결정 잠수 및 액체 질소 (100 K)에 저장하여이를 냉동은-냉각. 참고 :로드 결정 prac 약간의 소요TICE 및 데이터 수집을위한 충분있는 결정 결정은 경험을 함께 제공됩니다. 경험상, 더 크고 일정한 결정수록있다. </li><li> 100 K. 질소 가스의 스트림 데이터를 수집 참고 :이 데이터는 다이아몬드 광원 (DLS) 영국의 국가 싱크로 과학 시설에 인수되었다. </li><li> 두 MOSFLM 22을 사용 xia2와 반사 강도를 추정하여 데이터를 분석 및 XDS 23 패키지화하고 SCALA 또는 목적이 (24)와 CCP4 패키지 (25)와 데이터 크기. </li><li> PHASER (26)를 사용하여 분자 교체와 구조를 해결합니다. </li><li> 닭 (27)와 모델을 조정하고 REFMAC5 28 모델을 수정. </li><li> 파이 몰 29 그래픽 표현을 준비합니다. </li><li> &quot;연락처&quot;를 사용하여 연락처를 계산CCP4 패키지 프로그램입니다. 반 데르 발스 연락처에 대한 4 Å 차단 및 수소 결합과 소금 교량에 대한 3.4 Å 차단을 사용합니다. </li><li> CCP4 패키지의 &quot;SC&quot;프로그램을 사용하여 표면 보완을 계산합니다. </li><li> 30 바와 같이, TCR-pHLA 복합체의 교차 각도를 계산한다. 참고 :이 연구를 위해, 반사 데이터와 최종 모델의 좌표가 PDB 데이터베이스에 기탁 하였다 (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB : 5EU6, A2-YLE PDB : 5EU3, A2-YLE-3A PDB : 5EU4 및 A2 -YLE-5A의 PDB : 5EU5). </li></ol>

저자는 이해 상충이나 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 인간 질병의 맥락에서 T 세포 반응의 분자 세포 절개하기위한 프레임 워크를 제공한다. 암 연구의 주요 초점했지만, 우리는 바이러스 32, 33, 34, 35에 대한 T 세포 반응을 조사하기 위해 매우 유사한 접근 방식을 사용하고 (36), (37) 및자가 면역 38, 39, 40 중. 더욱이, 우리는 T 세포 항원 인식 2, 19, 41, 42에 적용되는 분자 원리를 이해하기 더 넓게 이러한 기술을 사용했다. 실제로, 수정의 예측할 수없는 본질은, 심지어을 잔류 물을 펩티드TCR을 접촉 잔기의 외부에서 충격 T 세포 인식되어 헤테로 펩티드의 디자인을위한 중요한 의미를 갖는다. 이러한 결과는 직접적으로 개선 진단 프로그램 (45), (46), (47)뿐만 아니라, 펩타이드 백신 6 43 인공 고친 화성 TCR도 3, 4, 5, 20, 44을 포함한 신규 한 T 세포 치료법의 개발에 기여 하였다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 고순도, 기능성 단백질의 생성은이 문서에 설명 된 방법 모두를위한 필수적이다. 수정 및 문제 해결 고순도의 단백질을 생성하는 어려움은 종종 매우의 발현과 관련순수한, 대장균 발현 시스템에서 불용성의 IB. 통상적으로, 발현 프로토콜 (예를 들어, 다양한 E. 콜라이 균주를 사용하는 상이한 광학 밀도에서 유도 또는 다른 매체를 사용하여 형성)를 수정하는 것은 이러한 문제를 해결한다. 기술의 한계 이러한 기술은 일반적으로 세포 표면에 발현되는 가용성 단백질 분자 (TCR 및 pHLA)를 사용한다. 따라서, 구조 / 생물 리 학적 결과는 생물학적 중요성을 확인하기 위해 셀룰러 방식과 일치하는 것을 보장하는 것이 중요하다. 기존의 / 대안적인 방법에 대한 기술의 중요성 X 선 결정학 및 기능 분석을 통해 입증 된 생물 물리학의 사용을 통해, 우리와 다른 암 항원에 대한 TCR도의 특정은 일반적으로 낮은 결합 친화도 (48)에 의해 특징 있음을 증명하고있다. 이 낮은 TCR 선호도는 T 세포가 아칸소 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다전자 암을 취소에서 자연적으로 효과가 없습니다. 항암 TCR도하고 동족 종양 항원 간의 복합체의 고해상도 원자 구조는이 약한 선호도에 대한 분자 적 기초를 공개하기 시작했다. 또한, 이들 연구는 미래에 개선 (16)을 시드,이 문제를 극복하기위한 치료 적 개입을 기초 메커니즘을 결정하는 데 유용하다. 이 연구에서 우리는 gp100의 HLA-A * 0201 제한 흑색 종 항원 복잡한에 자연 발생 αβTCR의 첫 번째 구조를 조사 하였다. 에 대한 심도있는 생물 리 학적 검사와 결합 구조는, 상호 작용의 전체 바인딩 모드를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한 및 CD8 + T 세포 인식 (작용 성 실험) (표면 플라즈몬 공명을 이용하여 평가 된) 결합 TCR 폐기 펩티드의 변이 형태 발생 예기치 분자 스위치, 폭로. HLA 항원 presentati의 새로운 메커니즘을 입증하는 경우에만 가능했다기재된 고해상도 방법에 사용. 이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램이나 방향 강력한 기능 분석과 결합 될 때 전반적으로, 우리의 결과는 X 선 결정학 및 생물 물리학 적 방법의 힘을 보여줍니다. 이러한 접근법을 사용하면, T 세포 항원 인식을 적용 정확한 분자 메커니즘을 절개 할 수있다. 실제로, 구조적 변화가 항원 차별 49, 50, 51 중 역할을 할 수있는 방법을 보여주는 unligated TCR도의 구조를 해결하기 위해이 방법을 사용하는 것도 가능하다. TCR-pHLA 상호 작용을 뒷받침 매우 복잡하고 동적 인 특성의 이해는 치료 설계를위한 명백한 의미를 가지고있다. 직접 변형 항원 recognitio에 치료 표적이되고있는 분자뿐만 아니라 효과를 &quot;볼&quot;수 있다는N, 분명히 앞으로 이러한 의약품의 개발이 향상됩니다. 이 연구에서 우리는 심하게 TCR에 의해 결합되지 않은 단일 펩티드 잔류 심지어 변화가 예측할 수 차례, 극적으로 T 세포의 인식을 변화의 HLA-결합 된 펩타이드, 다른 잔류 물에 구조적 변화를 전송할 수 있음을 보여준다. 인간 질병의 광범위한 미래 요법을 설계 할 때 T 세포의 항원 인식시 사용되는 분자 기전의보다 완전한 이해는 상당히 유익 할 것이다.

X 선 결정학은 왔으며, 리간드 - 수용체 상호 작용의 성질을 이해하기 위해 매우 강력한 기술이 될 것. 원자 수준에서 이러한 상호 작용을 시각화함으로써뿐만 아니라 가능 다양한 생물학적 과정을 관리하는 분자 메커니즘을 밝히기 있지만 직접 치료 효과를위한 접촉 인터페이스를 변경하는 것도 가능하다. 이러한 표면 플라즈몬 공명과 (이름 단지 몇) 등온 적정 열량 측정법과 같은 기법을 결합 변형이어서 결합 친화력 상호 작용 동역학 및 열역학에 직접적인 영향을 평가할 biophysically 분석 될 수있다. 마지막으로, 중요한 세포 유형에서 기능 실험을 수행하여, 수용체 - 리간드 상호 작용에 대한 수정의 분자와 기능적 영향 상세한 그림이 매우 특정한 기계적인 정보를 제공하고, 얻을 수있다. 전반적으로, 이러한 종류의 방법 억제 ​​유효화 원자 해상도의 화상을 제공 할<html> 진단 및 치료의 발전을위한 부수적 인 의미와 함께 작동하는 방법을 생물학적 시스템의 mination. 우리 실험실에서 일상적으로자가 면역, 병원체, 암 인간 T 세포 매개 면역 수용체 공부 이러한 기술을 사용하여 이식시. 여기서, 우리는 T 세포 수용체 (TCR) 및 인간 백혈구 항원 (HLA) -restricted 종양 유래 펩티드 (pHLA) 사이의 상호 작용에 의해 매개되는 암 인간 CD8 + T 세포 반응에 초점을 맞춘다. CD8 + T 세포가 암 세포를 표적으로 할 수 있지만, 우리는 이전과 다른 항암 TCR도는 동족 suboptimally pHLA (1, 2)에 결합하는 것을 도시 한 때문에 중요하다. 따라서, 많은 실험실 변경 시도 어느 TCR 3, 4, 5 또는 펩티드 리간드 6면역 원성을 증가시키기 위해 더 좋은 표적 암세포 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; (7, 8). 그러나, 이러한 접근은 항상 효과적이지 오프 타겟 독성 4, 9, 10과 같은 심각한 부작용을 가질 수있다. 암 항원의 T 세포 인식을 지배하는 분자 메커니즘을 탐구 또한 연구는 이러한 부족을 극복하는 것이 중요 할 것이다. 본 연구에서, 우리는 가장 일반적 * 0201 (HLA-A에 의해 제공 100 (gp100)을 당 단백질 분화 멜라닌 세포 항원의 단편에 특이적인 CD8 + T 세포에 의해자가 흑색 종 세포에 대한 반응, gp100 280-288에 집중 -expressed 인간 pHLA 클래스 I). 이 항원은 흑색 종의 면역 요법을 위해 널리 연구 대상이었다 및 발린이 알라닌으로 대체되는 소위 &quot;헤테로 클리&quot;펩티드 개발되었으며앵커 위치 9시 pHLA 안정성 (11)을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 시험 관내에서 흑색 종의 CTL 반응의 유도를 향상시키는 데 사용하고, 성공적으로 임상 시험 (12)에 사용되어왔다. 그러나, 펩티드 잔기 변형 클리닉 6,13- 대부분 heterolitic 펩티드의 불량한 효능 입증 T 세포 특이성의 예측 효과를 가질 수있다. 사실, Glu3가 알라 치환 된 펩타이드 잔류 물에 gp100 280-288의 또 다른되어 헤테로 형태는, gp100 280-288 - 특정 T 세포 (14), (15)의 클론 집단에 의해 인정을 폐기. 우리는 이전에 펩타이드 앵커 잔류 물에 사소한 변화가 실질적으로 예측할 수없는 방법으로 6, 16 T 세포 인식을 변화시킬 수 있음을 증명하고있다. 따라서,이 연구는 빌드에 초점을 맞춘CD8 + T 세포의 TCR도 pHLA와 사이의 상호 작용의 gp100 어떻게 수정을 인식하는 방법의보다 상세한 그림을 보내고은이 기능에 영향을 미칠 수있다. 여기, 우리는 HLA-A * 0201 (A2-YLE)에 의해 제공 gp100 280-288에 대한 특정이 TCR도의 고순도, 수용성 형태뿐만 아니라 pHLA의 자연 및 변경 양식을 생성합니다. 이러한 시약은 헤테로 클리 A2-YLE 형태뿐만 아니라 unligated 형태 돌연변이 pHLAs 두 복잡한에서 인간 TCR의 삼원 원자 구조를 해결하기 위해 단백질 결정을 생성하기 위해 사용되었다. 그런 다음에 자세하게 생물 물리학 적 실험을 수행하여 TCR도에 치환 펩타이드의 효과를 입증하기 위해 펩티드 주사 방식을 사용 하였다. 마지막으로, 유전자 변형 CD8 + T 세포주를 생성하는 다양한 펩티드 변형의 생물학적 효과를 테스트하는 기능 실험을 수행하기 위해, A2-YLE 특정 TCR도 중 하나를 표현하는 재 - 프로그램. 이러한 데이터는도 MODI 입증fications 예측할 노크에 TCR 바인딩 및 T 세포 인식 폐지 인접 펩타이드 잔류에 영향을 미칠 수있는 TCR 결합 모티프의 외부에있는 잔류 물을 펩티드. 우리의 결과는 흑색이 중요한 치료 표적 T 세포 인식을 기본 구조 메커니즘의 제 1 예를 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>S.O.C. 미디어</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit 인큐베이터</td><td>산요</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린&nbsp;</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>퀵 쿠마시 스테인 세이프스테인&nbsp;</td><td>Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT 원심분리기&nbsp;</td><td>소르발</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리스&nbsp;</td><td>피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘&nbsp;</td><td>아르코스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소노펄스 HD 2070&nbsp;</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse&nbsp;</td><td>피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리톤</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구아니딘&nbsp;</td><td>피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나노드롭 ND1000&nbsp;</td><td>열</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펩타이드</td><td>펩타이드 단백질 연구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌&nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시스테아민&nbsp;</td><td>피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시스타민&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투석 튜브&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>우레아&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0.45 &mu; m 멤브레인 필터</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>응용 biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA 순수 FPLC 시스템&nbsp;</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>싸토리우스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO 비바스핀 4&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 칼럼&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수&nbsp;</td><td>옥소이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore 버퍼 HBS&nbsp;</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>바이오틴화 키트</td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM5 칩 커플링 키트</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal 부사장-ITC&nbsp;</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon 결정화 로봇</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-plate&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>결정화 스크린 및 시약</td><td>분자 치수</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 플라스크&nbsp;</td><td>Greiner 바이오 원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 필터</td><td>Miller-GP, Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 초원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP SW28 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 마이크로비즈&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티-CD3/CD28 다이나비드&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티-PE 마이크로비즈&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK 매체, PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TCRV&beta; mAb&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>다사티닙&nbsp;</td><td>축삭돌기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&beta; 및 TNF&alpha; 엘리사&nbsp;</td><td>R& D 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 51Cr&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Microbeta 카운터</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

x 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 t 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

인간 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)는 종양 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 이 기능을 수행하기 위해 세포 표면 발현 T 세포 수용체(TCR)는 인간 백혈구 항원(HLA) 제한 종양 유래 펩타이드(pHLA)를 기능적으로 인식해야 합니다. 그러나, 당사와 다른 연구자들은 대부분의 TCR이 종양 항원에 최적으로 결합하지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이러한 잘못된 인식을 정의하는 분자 메커니즘을 밝히는 것은 이러한 단점을 우회하는 새로운 표적 치료법의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 실제로, 이러한 분자적 이해가 결여된 현재의 치료법은 보편적으로 효과적이지 않다. 여기에서는 TCR과 pHLA 간의 상호 작용 특성이 T 세포 기능을 어떻게 제어하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 용해성 TCR 및 pHLA의 생성과 X선 결정학, 생물물리학적 분석 및 pHLA 다량체를 사용한 항원 특이적 T 세포 염색을 위한 이러한 시약의 사용이 포함됩니다. 이러한 접근 방식을 사용하고 구조 분석을 통해 TCR과 pHLA 간의 상호 작용을 수정한 다음 이러한 수정이 T 세포 항원 인식에 어떤 영향을 미치는지 테스트할 수 있습니다. 이러한 발견은 이미 여러 암 항원의 T세포 인식 메커니즘을 명확히 하는 데 도움이 되었으며 새로운 암 치료를 위한 변형된 펩타이드 및 변형된 TCR의 개발을 지시할 수 있습니다.

여기에서는 인간 백혈구 항원에 의해 제시되는 T-세포 수용체와 종양 항원 사이의 상호 작용의 본질이 T-세포 기능을 어떻게 지배하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 단백질 생산, X선 결정학, 생물 물리학 및 기능적 T 세포 실험이 포함됩니다.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

이 절차의 전반적인 목표는 생물물리학 및 구조 분석에 사용하기에 충분한 품질의 용해성 recumbinate T-세포 수용체 및 펩타이드 HLA 단백질을 생성하는 것입니다. 이 방법은 T세포 면역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, T 세포는 왜 암에 강력하게 반응하지 않는가?이 기술의 가장 큰 장점은 T-세포 수용체가 표적을 인식하여 T-세포 매개 면역 반응을 유도하는 방법을 설명하는 매우 높은 해상도의 기계론적 데이터를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 T 세포가 대부분의 면역 반응에서 중추적인 역할을 하기 때문에 거의 모든 인간 질병의 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 T 세포 면역 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 수용체 리간드 상호 작용에 의해 제어되는 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생물물리학 및 구조 실험을 위한 충분한 품질의 용해성 활성 단백질을 생성하는 것이 매우 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 10 milometer dithiothreitol이 포함된 6ml의 guanidine buffer로 펩타이드 HLA refolding 절차를 시작하려면 HLA-A2 봉입체 30mg, beta 2-M 봉입체 30mg 및 원하는 관심 펩타이드 4mg을 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 혼합물을 1리터의 HLA 재접힘 완충액으로 희석하고 섭씨 4도로 예냉각한 후 해당 온도에서 3시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 20리터의 10밀리몰 트리스, pH 8.1에 대해 각각 24시간 동안 혼합물을 두 번 투석합니다. TCR 재접힘 절차를 시작하려면 10밀리몰 디티오트레이톨이 함유된 6ml의 구아니딘 완충액에 TCR 알파 및 베타 사슬 IB를 각각 30mg씩 추가합니다.혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 혼합물을 미리 냉각된 TCR 재접힘 완충액 1리터에 희석합니다. 펩타이드 HLA 혼합물과 동일한 방식으로 희석된 TCR 재폴드 혼합물을 교반 및 투석합니다. 투석된 재접힘 혼합물을 0.45마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 필터링합니다.다음으로, 여과된 재접힘 제제 중 하나를 20ml의 10밀리몰 트리스, pH 8.1로 사전 평형화된 7.9ml 50마이크로미터 음이온 교환 수지 컬럼에 로드합니다. 염 구배 완충 시스템으로 단백질을 분당 5ml로 용리합니다. 1밀리리터 분획을 수집하고 SDS-Page로 분획을 분석합니다.refolded 단백질을 포함하는 분획을 결합합니다. 단백질 혼합물을 10 kilodalton 분자량 컷오프 원심 농축기에 넣습니다. 혼합물을 20분 동안 원심분리하거나 4000배 g에서 혼합물을 500마이크로리터로 농축하는 데 필요한 만큼 오래 원심분리합니다.플로우 스루를 버립니다. 농축된 단백질 준비물을 2ml 주입 루프로 성형하고 적절한 elusion buffer로 사전 평형을 이룬 24ml 크기의 배제 크로마토그래피 컬럼에 단백질을 주입합니다. 1 컬럼 부피의 완충액으로 단백질을 분당 0.5 밀리리터로 용리시킵니다.1 밀리리터 분획을 수집하고, SDS-Page로 분획을 분석하고, 관심 단백질을 포함하는 분획을 결합합니다. 특정 TCR 펩타이드 HLA 상호작용의 KD보다 10배 위에서부터 10배 아래까지의 농도 범위에서, TCR 용액의 10회 연속 희석액을 준비합니다(알고 있는 경우). 그렇지 않으면 200마이크로몰의 TCR 농도에서 시작하십시오.다음으로, 100 밀리몰과 N-하이드록시숙신이미드 및 400 밀리몰 EDC의 일대일 혼합물을 섭씨 25도에서 10분 동안 분당 10마이크로리터의 유속으로 칩 위에 흘려 카르복시메틸화 덱스트란 코팅 센서 칩을 활성화합니다. 그런 다음 4개의 플로우 셀 모두에 밀리리터당 200마이크로그램의 스트렙타비딘 110마이크로리터와 pH 4.5 10밀리몰의 아세테이트를 로드하여 칩 표면을 기능화합니다. 100마이크로리터의 1몰 에탄올아미드 염산염으로 남아 있는 반응기를 비활성화합니다.다음으로, 반응 단위 수가 500에서 600으로 증가할 때까지 칩 제조업체가 제공한 버퍼에 약 1마이크로몰 펩타이드 HLA 용액을 분당 10마이크로리터로 칩 표면 위로 흐릅니다. 칩 표면을 1밀리몰의 비오틴과 제조업체에서 제공한 완충액으로 60초 동안 포화시킵니다. 그런 다음 TCR 용액의 10 연속 희석액을 섭씨 25도에서 분당 30 마이크로 리터로 주입합니다.평형 결합 상수를 계산하고 동역학 해석을 실행합니다. 이러한 방식으로 일련의 SPR 실험을 수행하되 TCR 희석액이 주입되는 온도만 변경합니다. 각 온도에 대한 평형 결합 상수를 결정하고 Gibbs 에너지 및 기타 열역학 매개변수를 계산합니다.비선형 회귀 피팅을 사용하여 온도에 대해 Gibbs 에너지를 연결합니다. 펩티드 HLA 해결책을 0.2 millimolar와 결정화 완충액에 3, 000 시간 g에 원심분리에 의해, 10 kilodalton 분자량 커트오프 원심 집중 장치에 집중하십시오. 공복합 결정화를 위해 1:1 TCR과 펩타이드 HLA의 0.1 밀리몰 용액을 준비합니다.결정화 로봇과 스크리닝 키트를 사용하여 96웰 플레이트에서 좌식 낙하 기법을 사용하여 결정화 시험을 준비합니다. 각 저장소에는 60 마이크로 리터의 결정화 완충액이 있으며 각 방울은 각각 200 나노 리터의 단백질 용액과 완충액으로 구성됩니다. 섭씨 18도에서 결정을 성장시킵니다.24시간, 48시간, 72시간 후, 그리고 매주 현미경으로 결정에 대한 점수를 매깁니다. 충분한 품질의 단결정이 성장하면 극저온 호환 루프로 단결정을 수확하고 결정을 액체 질소에 저장합니다. 100켈빈의 질소 가스 흐름 아래에서 싱크로트론 X선 회절을 수행하고 데이터를 분석하고 적절한 소프트웨어로 구조를 해결합니다.해석된 구조로부터의 접촉, 곡면 상보성 및 교차 각도를 계산합니다. 이러한 방법을 사용하여 TCR 및 펩타이드 HLA 분자를 발현하고 용해성 형태로 다시 접혔습니다. 펩타이드 HLA 분자 내의 펩타이드는 gp100 항원이었습니다.SPR은 다양한 온도에서 항원에 대한 PMEL17 TCR의 결합 친화도를 측정하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 SPR과 등온 열량 적정을 모두 사용하여 단백질-단백질 상호 작용의 열역학적 매개변수를 측정했습니다. PMEL17 TCR A2-YLE-9V 복합체를 결정화하여 싱크로트론 X선 회절로 평가하였다.TCR CDR 루프와 TCR 단백질이 접촉한 펩타이드 HLA 잔기를 모두 확인하고 접촉의 특성을 연구했습니다. 펩타이드의 돌연변이된 형태를 가진 펩타이드 HLA 분자도 이러한 방식으로 정제 및 결정화되었습니다. TCR과의 결합 상호 작용을 방해할 수 있는 구조적 차이를 조사합니다.세 번째 또는 다섯 번째 잔기의 돌연변이는 프롤린 4의 위치를 크게 변화시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 TCR CDR-3 알파 루프와의 많은 접촉을 방해할 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 추가 분석을 위해 가장 순수한 단백질만 선택하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 진단 및 추가 분석을 위해 환자 혈액에서 항원 특이적 T 세포를 분리하기 위해 용해성 단백질을 사용하여 펩타이드 HLA 테트라머 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 T세포 면역학 분야의 연구자들이 TCR 펩타이드 HLA 결합을 정교하게 연구할 수 있는 길을 열었으며 암 및 기타 인간 질병에 대한 신약을 개발할 수 있도록 했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 생물물리학적 및 구조 분석을 수행하기에 충분한 품질의 TCR 및 펩타이드 HLA 단백질을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

여기에 제시된 것은 바로 사용할 수 있는 방사성 표지 합성 [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine([89Zr]Zr-DBN)을 사용하여 양전자 방출 단층 촬영(PET) 방사성 동위원소, 89Zr(t1/2 78.4 h)로 세포를 방사성 표지하는 프로토콜입니다. [89Zr]Zr-DBN을 사용한 방사성 표지 세포는 투여 후 최대 7일 동안 PET를 사용하여 체내에서 투여된 방사성 표지 세포의 비침습적 추적 및 이미징을 가능하게 합니다.

세포 이동의 양전자 방출 단층 촬영 이미징: 세포 방사선 표지 방법

학습하세요 T세포 수용체와 펩타이드 HLA 단백질을 생성하여 X선 결정학과 생물물리학 분석을 수행하는 방법을. 이 기법은 암 면역요법을 위한 고해상도 구조 데이터를 제공합니다.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

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