Name: Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri come produrre stock retrovirali difettivi per la replicazione mediante trasfezione transiente di cellule 293T. Questo metodo consente di introdurre oncogeni umani in modelli murini per studiare malattie mieloproliferative.

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<ol><li> La sera prima trasformazione, le cellule piastra 293T a 3-5x10 6 cellule / 6 cultureplate tessuto cm. Nota: utilizzare le cellule 293T per la loro facilità di trasfezione delle cellule e del virus efficacyas produzione. Queste cellule sono carenti nella confezione il virus a meno che un aiutante plasmide è introdotto. </li><li> La prima mattina, rimuovere delicatamente medie e sostituirlo con 4 ml di cellule 293T med contenente 25 mM clorochina. Messo in incubatrice per 1 ora. Nota: il piatto dovrebbe essere di circa l&#39;80% confluenti. </li><li> Nel frattempo, preparare virus-making miscela per 2 piatti alla volta, in provette da 5 ml: <ol><li> 2 x 10 mg costruire retrovirali plasmide </li><li> 2 x 5 mg confezione costruire (Ecopack), </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> completa di 1 ml con una soluzione sterile DDH 2 O Nota: Mentre il plasmide retrovirale codifica per l&#39;oncogene di interesse e di un marker, Ecopack codifica gag-pol-env. Insieme con le cellule 293T, produrranno un retrovirus ecotropic (RV) specifici per cellule di topo, ma non infettivo per le cellule umane. Sia Clorochina e CaCl 2 hanno dimostrato di aumentare l&#39;efficienza di trasfezione. </li></ol></li><li> Aggiungere 1ml di sterileHBS 2x goccia a goccia per la miscela, mentre delicatamente il tubo vortex. </li><li> Aggiungere immediatamente questa soluzione a 2 piastre, 1 ml ciascuna, dolcemente, goccia a goccia. </li><li> Messo in incubatrice per 7 a 11 ore. </li><li> In serata (da 7 a 11 ore. Successiva), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 5 ml di terreno fresco 293T. Messo in incubatrice fino a mezzogiorno, il giorno successivo. Nota: questo passaggio è importante, perché è necessario togliere la clorochina dalle cellule. Se mantenuto per lunghi periodi di tempo, la clorochina è tossico. La soluzione nei piatti sembra sfocata, a causa di una molto fine, di polvere come precipitazione della miscela di trasfezione. Nota: è importante fare tutti i cambiamenti dei media con estrema dolcezza, come le cellule sono stati sensibilizzati dalla clorochina, e può facilmente staccare dalla piastra. </li><li> Il giorno dopo, 18 a 24 ore. prima di recuperare il virus (intorno a mezzogiorno), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 3 ml di terreno fresco 293T. Sostituire in incubatore O / N. </li><li> La mattina del terzo giorno (18 a 24 ore. Successiva), lentamente succhiare il modulo di media i piatti con una siringa da 10 ml dotato di un ago 18 G. Questo surnatante contiene i retrovirus. </li><li> Cambiare l&#39;ago di siringa un filtro 45 mm, capovolgere diverse volte siringa per mescolare bene la soluzione, passano attraverso il filtro surnatante, e aliquota in cryotubes Nota: In alternativa, se si stanno facendo + 3 piastre di virus, piscina per tutte sopranatanti dello stesso virus in un tubo 0 5 ml. Mescolare bene, poi sopranatanti aliquota contenente il retrovirus in cryotubes filtrando. </li><li> I tubi contenenti il ​​virus pieno surnatanti sono conservati in -80 ° C fino al momento. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Quattro punti critici assicurerà il successo di una buona scorta virale: <ol><li> Le cellule 293T di produzione devono essere molto sano, nel senso che sono stati divisi su un programma molto regolare, non erano mai troppo lunghi, e sono placcati alla densità ottimale di 3,5-5000000 per 6 piastra di coltura tissutale cm, in modo che raggiungano una densità del 80% del piatto la mattina della trasfezione. </li><li> L&#39;aggiunta di clorochina migliora l&#39;efficienza di trasfezione e titolo del virus successivi, circa 3 - a...

Tutti i reagenti utilizzati per la trasfezione deve essere sterile, filtrata (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) e mantenuto sterile.

produzione di replica-difettoso da retrovirus trasfezione transiente di cellule 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

I nostri studi di laboratorio malattie umane mieloproliferative indotta da oncogeni come Bcr-Abl o recettore del fattore di crescita derivato oncogeni (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, ecc.) Siamo in grado di modellare e studiare un essere umano-come la malattia nel nostro modello di topo, con il trapianto di cellule del midollo osseo precedentemente infettati con un retrovirus che esprime l&#39;oncogene di interesse. Replica difettoso retrovirus che codifica una oncogene umano e un indicatore (GFP, RFP, gene di resistenza agli antibiotici, ecc) è prodotto da un protocollo di trasfezione transiente utilizzando cellule 293T, un essere umano linea di cellule renali epiteliali trasformate dal prodotto adenovirus gene E1A. 293 cellule hanno la proprietà di essere altamente insolito transfectable da fosfato di calcio (CAPO 4), con fino al 50-80% di efficienza di trasfezione facilmente raggiungibile. Qui, abbiamo co-trasfezione 293 cellule con un vettore retrovirale che esprime l&#39;oncogene di interesse e un plasmide che esprime la gag-pol-env funzioni packaging, come ad esempio il singolo genoma imballaggio costruisce kat o PCL, in questo caso la Ecopack plasmide. La transfezione iniziale è ulteriormente migliorata con l&#39;uso di clorochina. Gli stock di virus ecotropic, raccolti come supernatante di coltura 48 ore. post-trasfezione, possono essere conservati a -80 ° C ed utilizzati per l&#39;infezione di linee cellulari in vista della trasformazione e studi in vitro, o cellule primarie come le cellule del midollo osseo di topo, che possono poi essere utilizzati per il trapianto nel nostro modello di topo .

Questa tecnica mostra un modo efficace per preparare le scorte retrovirali replica difettoso codifica di un oncogene umano, e successivamente utilizzata per l&#39;induzione di malattie mieloproliferative nel modello murino.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Il nostro laboratorio studia le malattie mieloproliferative umane indotte da oncogeni quali Bcr-Abl o oncogeni derivati da recettori dei fattori di crescita (ZNF198-FGFR1, ...

Siamo qui presso l'Istituto di Ricerca di Oncologia Molecolare del Tufts New England Medical Center. Mi chiamo Christina Lesco e sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio del Dottor Rick Van. Il nostro laboratorio si occupa dello studio della leucemia mieloide cronica umana, della CML e delle malattie simili alla CML.Stiamo modellando questa malattia umana nei topi e il metodo che utilizziamo consiste nell'introdurre l'oncogene umano mediante un vettore retrovirale. La prima cosa da fare per introdurre questo oncogene umano nelle cellule murine è produrre il virus stesso. Il passaggio successivo sarà effettivamente concentrare il virus.Quindi questa è la mia piastra con cellule 293T. Dovrò rimuovere il mezzo con PBS. Le cellule 293T sono cellule aderenti, tuttavia non sono fortemente aderenti, quindi ogni movimento deve essere molto delicato. Dopo il lavaggio, sostituiremo il PBS con tripsina.Per disperdere le cellule dalla piastra, è necessario riposizionare la piastra nell'incubatore per circa tre minuti. Dopo circa due-tre minuti, le cellule si trovano effettivamente in sospensione. Aggiungeremo alcuni ml aggiuntivi di mezzo normale.Questo neutralizzerà la tripsina. A qu

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Biologia

Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

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Scopri come produrre stock retrovirali difettivi per la replicazione mediante trasfezione transiente di cellule 293T. Questo metodo consente di introdurre oncogeni umani in modelli murini per studiare malattie mieloproliferative.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

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