Name: Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri come produrre stock retrovirali difettivi per la replicazione mediante trasfezione transiente di cellule 293T. Questo metodo consente di introdurre oncogeni umani in modelli murini per studiare malattie mieloproliferative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> La sera prima trasformazione, le cellule piastra 293T a 3-5x10 6 cellule / 6 cultureplate tessuto cm. Nota: utilizzare le cellule 293T per la loro facilità di trasfezione delle cellule e del virus efficacyas produzione. Queste cellule sono carenti nella confezione il virus a meno che un aiutante plasmide è introdotto. </li><li> La prima mattina, rimuovere delicatamente medie e sostituirlo con 4 ml di cellule 293T med contenente 25 mM clorochina. Messo in incubatrice per 1 ora. Nota: il piatto dovrebbe essere di circa l&#39;80% confluenti. </li><li> Nel frattempo, preparare virus-making miscela per 2 piatti alla volta, in provette da 5 ml: <ol><li> 2 x 10 mg costruire retrovirali plasmide </li><li> 2 x 5 mg confezione costruire (Ecopack), </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> completa di 1 ml con una soluzione sterile DDH 2 O Nota: Mentre il plasmide retrovirale codifica per l&#39;oncogene di interesse e di un marker, Ecopack codifica gag-pol-env. Insieme con le cellule 293T, produrranno un retrovirus ecotropic (RV) specifici per cellule di topo, ma non infettivo per le cellule umane. Sia Clorochina e CaCl 2 hanno dimostrato di aumentare l&#39;efficienza di trasfezione. </li></ol></li><li> Aggiungere 1ml di sterileHBS 2x goccia a goccia per la miscela, mentre delicatamente il tubo vortex. </li><li> Aggiungere immediatamente questa soluzione a 2 piastre, 1 ml ciascuna, dolcemente, goccia a goccia. </li><li> Messo in incubatrice per 7 a 11 ore. </li><li> In serata (da 7 a 11 ore. Successiva), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 5 ml di terreno fresco 293T. Messo in incubatrice fino a mezzogiorno, il giorno successivo. Nota: questo passaggio è importante, perché è necessario togliere la clorochina dalle cellule. Se mantenuto per lunghi periodi di tempo, la clorochina è tossico. La soluzione nei piatti sembra sfocata, a causa di una molto fine, di polvere come precipitazione della miscela di trasfezione. Nota: è importante fare tutti i cambiamenti dei media con estrema dolcezza, come le cellule sono stati sensibilizzati dalla clorochina, e può facilmente staccare dalla piastra. </li><li> Il giorno dopo, 18 a 24 ore. prima di recuperare il virus (intorno a mezzogiorno), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 3 ml di terreno fresco 293T. Sostituire in incubatore O / N. </li><li> La mattina del terzo giorno (18 a 24 ore. Successiva), lentamente succhiare il modulo di media i piatti con una siringa da 10 ml dotato di un ago 18 G. Questo surnatante contiene i retrovirus. </li><li> Cambiare l&#39;ago di siringa un filtro 45 mm, capovolgere diverse volte siringa per mescolare bene la soluzione, passano attraverso il filtro surnatante, e aliquota in cryotubes Nota: In alternativa, se si stanno facendo + 3 piastre di virus, piscina per tutte sopranatanti dello stesso virus in un tubo 0 5 ml. Mescolare bene, poi sopranatanti aliquota contenente il retrovirus in cryotubes filtrando. </li><li> I tubi contenenti il ​​virus pieno surnatanti sono conservati in -80 ° C fino al momento. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Quattro punti critici assicurerà il successo di una buona scorta virale: <ol><li> Le cellule 293T di produzione devono essere molto sano, nel senso che sono stati divisi su un programma molto regolare, non erano mai troppo lunghi, e sono placcati alla densità ottimale di 3,5-5000000 per 6 piastra di coltura tissutale cm, in modo che raggiungano una densità del 80% del piatto la mattina della trasfezione. </li><li> L&#39;aggiunta di clorochina migliora l&#39;efficienza di trasfezione e titolo del virus successivi, circa 3 - a...

Tutti i reagenti utilizzati per la trasfezione deve essere sterile, filtrata (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) e mantenuto sterile.

produzione di replica-difettoso da retrovirus trasfezione transiente di cellule 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

I nostri studi di laboratorio malattie umane mieloproliferative indotta da oncogeni come Bcr-Abl o recettore del fattore di crescita derivato oncogeni (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, ecc.) Siamo in grado di modellare e studiare un essere umano-come la malattia nel nostro modello di topo, con il trapianto di cellule del midollo osseo precedentemente infettati con un retrovirus che esprime l&#39;oncogene di interesse. Replica difettoso retrovirus che codifica una oncogene umano e un indicatore (GFP, RFP, gene di resistenza agli antibiotici, ecc) è prodotto da un protocollo di trasfezione transiente utilizzando cellule 293T, un essere umano linea di cellule renali epiteliali trasformate dal prodotto adenovirus gene E1A. 293 cellule hanno la proprietà di essere altamente insolito transfectable da fosfato di calcio (CAPO 4), con fino al 50-80% di efficienza di trasfezione facilmente raggiungibile. Qui, abbiamo co-trasfezione 293 cellule con un vettore retrovirale che esprime l&#39;oncogene di interesse e un plasmide che esprime la gag-pol-env funzioni packaging, come ad esempio il singolo genoma imballaggio costruisce kat o PCL, in questo caso la Ecopack plasmide. La transfezione iniziale è ulteriormente migliorata con l&#39;uso di clorochina. Gli stock di virus ecotropic, raccolti come supernatante di coltura 48 ore. post-trasfezione, possono essere conservati a -80 ° C ed utilizzati per l&#39;infezione di linee cellulari in vista della trasformazione e studi in vitro, o cellule primarie come le cellule del midollo osseo di topo, che possono poi essere utilizzati per il trapianto nel nostro modello di topo .

Questa tecnica mostra un modo efficace per preparare le scorte retrovirali replica difettoso codifica di un oncogene umano, e successivamente utilizzata per l&#39;induzione di malattie mieloproliferative nel modello murino.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Il nostro laboratorio studia le malattie mieloproliferative umane indotte da oncogeni quali Bcr-Abl o oncogeni derivati da recettori dei fattori di crescita (ZNF198-FGFR1, ...

Siamo qui presso l'Istituto di Ricerca di Oncologia Molecolare del Tufts New England Medical Center. Mi chiamo Christina Lesco e sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio del Dottor Rick Van. Il nostro laboratorio si occupa dello studio della leucemia mieloide cronica umana, della CML e delle malattie simili alla CML.Stiamo modellando questa malattia umana nei topi e il metodo che utilizziamo consiste nell'introdurre l'oncogene umano mediante un vettore retrovirale. La prima cosa da fare per introdurre questo oncogene umano nelle cellule murine è produrre il virus stesso. Il passaggio successivo sarà effettivamente concentrare il virus.Quindi questa è la mia piastra con cellule 293T. Dovrò rimuovere il mezzo con PBS. Le cellule 293T sono cellule aderenti, tuttavia non sono fortemente aderenti, quindi ogni movimento deve essere molto delicato. Dopo il lavaggio, sostituiremo il PBS con tripsina.Per disperdere le cellule dalla piastra, è necessario riposizionare la piastra nell'incubatore per circa tre minuti. Dopo circa due-tre minuti, le cellule si trovano effettivamente in sospensione. Aggiungeremo alcuni ml aggiuntivi di mezzo normale.Questo neutralizzerà la tripsina. A questo punto, pipettiamo su e giù per assicurarci che tutte le cellule siano ben sospese, quindi trasferiamo la sospensione in un tubo da 50 ml e contiamo le cellule in presenza di blue triplo, utilizzando un emocitometro per effettuare il conteggio manuale. Ora preparo il mio diluizione come calcolato e successivamente piastrerò tre 10 alla sesta cellule per piastra.In 4 ml di mezzo, verifichiamo che le cellule siano state ben seminate e reinseriremo le piastre nell'incubatrice per 16-18 ore, di solito fino al mattino successivo. Siamo quindi a 48 ore dall'infezione con il virus GFP. Il cloroichina viene utilizzata per aumentare l'assorbimento del DNA che andremo a somministrare sulle cellule.Abbiamo delicatamente aspirato il mezzo dalle cellule, che ora si sono attaccate in modo gentile ai piatti lungo il lato del piatto. A questo punto, reinseriremo i piatti negli incubatori per circa un'ora. Nel frattempo, prepareremo la nostra miscela di DNA da applicare alle cellule: un primo plasmide che esprime un gene di resistenza alla neomicina e un altro che esprime effettivamente GFPI, utilizzando DNA XI per controllare l'intera trasfezione.Infine, stiamo aggiungendo cloruro di calcio. L'uso del cloruro di calcio aumenta notevolmente l'efficienza di trasfezione. Siamo ora un'ora dopo; abbiamo prelevato le piastre con il mezzo contenente cloroquina e stiamo per aggiungere la nostra soluzione di trasfezione.L'ultimo passaggio che dobbiamo eseguire consiste nell'aggiungere effettivamente un ml di HBS sterile 2x mentre si aggiunge la soluzione H2XHBS. È necessario vortexare il tubo contemporaneamente, procedendo lentamente, goccia a goccia. Questo passaggio serve a evitare precipitazioni; successivamente, si distribuisce immediatamente un ml di soluzione nella piastra di interesse, operando nuovamente goccia a goccia.A questo punto, le cellule 293T sono molto sensibilizzate a causa del mezzo con cloroquina in cui si trovano. È necessario mantenere tutta l'area coperta e spostare le piastre il meno possibile; etichettare la piastra con il costrutto che si è aggiunto e ripetere l'operazione per il costrutto successivo.A questo punto, reinserire le piastre nell'incubatore per sette-undici ore. Almeno sette, ma non più di undici, poiché le cellule sono molto sensibilizzate a causa della cloroquina e sarà necessario cambiare il mezzo dopo questo periodo. Siamo ora a circa 30 ore dopo la trasfezione.Questa è la nostra ultima sostituzione del mezzo a questo punto, le cellule 2 9 3 C3 T hanno raggiunto la confluenza. Dobbiamo, ancora una volta, essere molto delicati durante l'aggiunta del nuovo mezzo sul lato della piastra. Sto utilizzando una siringa da 10 ml con ago.Sostituirò l'ago con un filtro, quindi in questo momento sto mescolando bene il mezzo; abbiamo raccolto il nostro virus e possiamo conservarlo a meno 80 gradi fino al momento dell'uso. La prima cosa da fare è concentrare effettivamente il virus. Esistono diversi passaggi delicati nella produzione del virus, e il primo di questi è la corretta concentrazione delle cellule 293T.Li stiamo seminando a tre 10 alla sesta cellule per piastra perché dopo 18 ore saranno circa all'80% di confluenza. Ciò lascia loro ancora tempo per crescere ulteriormente, in modo che quindi 24 ore dopo la trasfezione raggiungano il 100% di confluenza. È stato dimostrato che questo aspetto è molto importante per ottenere un ottimo titolo virale.Il passaggio successivo consiste nell'utilizzo di cloroquina; in realtà, la cloroquina sensibilizza le cellule 2 9 3 e tutti i cambi di mezzo devono essere eseguiti con molta delicatezza per evitare che l'intero strato di cellule 2 9 3 T si stacchi dalla piastra. Infine, il DNA utilizzato per produrre il virus deve essere estremamente puro. Stiamo utilizzando DNA C bandato.Una volta ottenuto il virus, lo conserviamo a meno 80 gradi. Di solito lo titoliamo una sola volta per ogni passaggio, il che riduce la concentrazione del virus di due volte. Pertanto, preferiamo congelare il virus che abbiamo prodotto e conservarlo in aliquota prima di effettuare il titolo effettivo del virus.A seconda dei virus, possiamo avere un'espressione di GFP insieme al virus per tracciare le cellule effettivamente infette, oppure possiamo avere resistenza alla neomicina. È molto importante conoscere il titolo del virus prima di utilizzarlo, al fine di poter effettuare confronti tra esperimenti o tra diversi mutanti.

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

Lentivirus Produzione

Lentivirus sono un valido strumento di ricerca per esplorare la funzione del gene, tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione di codifica lentivirus pantropic oncogeni noti o sospetti. In alternativa, vi presentiamo un protocollo più sicuro per l'utilizzo del lentivirus ecotropic su cellule umane modificate per esprimere la mSlc7a1 ecotropic recettore.

Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

In questo protocollo si descrive la produzione, purificazione e titolazione di vettori lentivirali. Forniamo un esempio di vettori lentivirali mediata consegna gene in colture primarie neuroni ed astrociti. I nostri metodi possono valere anche per altri tipi di...

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L'invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento...

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

Qui, usiamo trasduzione retrovirale e trasfezione concatemeric per creare una linea cellulare che può esprimere le componenti di un vettore lentivirale (LV) in assenza di tetraciclina. Questo LV codifica GFP ed è pseudotyped con una glicoproteina, SVGmu, che è specifico per un recettore sulle cellule dendritiche.

Una linea cellulare tetraciclina regolata produce vettori lentivirali ad alto titolo che si rivolgono specificamente cellule dendritiche

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.

Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Illustreremo un protocollo di 9 giorni per la trasduzione e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche del macaco rhesus che produce cellule con un'eccellente co-espressione dei geni di interesse in numero sufficiente per gli studi di infusione dell'efficacia cellulare.

Trasduzione ed espansione delle cellule T primarie in nove giorni con manutenzione del fenotipo della memoria centrale

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Scopri come produrre stock retrovirali difettivi per la replicazione mediante trasfezione transiente di cellule 293T. Questo metodo consente di introdurre oncogeni umani in modelli murini per studiare malattie mieloproliferative.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Esplora altri video