Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Siamo qui presso l'Istituto di Ricerca di Oncologia Molecolare del Tufts New England Medical Center. Mi chiamo Christina Lesco e sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio del Dottor Rick Van. Il nostro laboratorio si occupa dello studio della leucemia mieloide cronica umana, della CML e delle malattie simili alla CML.

Stiamo modellando questa malattia umana nei topi e il metodo che utilizziamo consiste nell'introdurre l'oncogene umano mediante un vettore retrovirale. La prima cosa da fare per introdurre questo oncogene umano nelle cellule murine è produrre il virus stesso. Il passaggio successivo sarà effettivamente concentrare il virus.

Quindi questa è la mia piastra con cellule 293T. Dovrò rimuovere il mezzo con PBS. Le cellule 293T sono cellule aderenti, tuttavia non sono fortemente aderenti, quindi ogni movimento deve essere molto delicato. Dopo il lavaggio, sostituiremo il PBS con tripsina.

Per disperdere le cellule dalla piastra, è necessario riposizionare la piastra nell'incubatore per circa tre minuti. Dopo circa due-tre minuti, le cellule si trovano effettivamente in sospensione. Aggiungeremo alcuni ml aggiuntivi di mezzo normale.

Questo neutralizzerà la tripsina. A questo punto, pipettiamo su e giù per assicurarci che tutte le cellule siano ben sospese, quindi trasferiamo la sospensione in un tubo da 50 ml e contiamo le cellule in presenza di blue triplo, utilizzando un emocitometro per effettuare il conteggio manuale. Ora preparo il mio diluizione come calcolato e successivamente piastrerò tre 10 alla sesta cellule per piastra.

In 4 ml di mezzo, verifichiamo che le cellule siano state ben seminate e reinseriremo le piastre nell'incubatrice per 16-18 ore, di solito fino al mattino successivo. Siamo quindi a 48 ore dall'infezione con il virus GFP. Il cloroichina viene utilizzata per aumentare l'assorbimento del DNA che andremo a somministrare sulle cellule.

Abbiamo delicatamente aspirato il mezzo dalle cellule, che ora si sono attaccate in modo gentile ai piatti lungo il lato del piatto. A questo punto, reinseriremo i piatti negli incubatori per circa un'ora. Nel frattempo, prepareremo la nostra miscela di DNA da applicare alle cellule: un primo plasmide che esprime un gene di resistenza alla neomicina e un altro che esprime effettivamente GFPI, utilizzando DNA XI per controllare l'intera trasfezione.

Infine, stiamo aggiungendo cloruro di calcio. L'uso del cloruro di calcio aumenta notevolmente l'efficienza di trasfezione. Siamo ora un'ora dopo; abbiamo prelevato le piastre con il mezzo contenente cloroquina e stiamo per aggiungere la nostra soluzione di trasfezione.

L'ultimo passaggio che dobbiamo eseguire consiste nell'aggiungere effettivamente un ml di HBS sterile 2x mentre si aggiunge la soluzione H2XHBS. È necessario vortexare il tubo contemporaneamente, procedendo lentamente, goccia a goccia. Questo passaggio serve a evitare precipitazioni; successivamente, si distribuisce immediatamente un ml di soluzione nella piastra di interesse, operando nuovamente goccia a goccia.

A questo punto, le cellule 293T sono molto sensibilizzate a causa del mezzo con cloroquina in cui si trovano. È necessario mantenere tutta l'area coperta e spostare le piastre il meno possibile; etichettare la piastra con il costrutto che si è aggiunto e ripetere l'operazione per il costrutto successivo.

A questo punto, reinserire le piastre nell'incubatore per sette-undici ore. Almeno sette, ma non più di undici, poiché le cellule sono molto sensibilizzate a causa della cloroquina e sarà necessario cambiare il mezzo dopo questo periodo. Siamo ora a circa 30 ore dopo la trasfezione.

Questa è la nostra ultima sostituzione del mezzo a questo punto, le cellule 2 9 3 C3 T hanno raggiunto la confluenza. Dobbiamo, ancora una volta, essere molto delicati durante l'aggiunta del nuovo mezzo sul lato della piastra. Sto utilizzando una siringa da 10 ml con ago.

Sostituirò l'ago con un filtro, quindi in questo momento sto mescolando bene il mezzo; abbiamo raccolto il nostro virus e possiamo conservarlo a meno 80 gradi fino al momento dell'uso. La prima cosa da fare è concentrare effettivamente il virus. Esistono diversi passaggi delicati nella produzione del virus, e il primo di questi è la corretta concentrazione delle cellule 293T.

Li stiamo seminando a tre 10 alla sesta cellule per piastra perché dopo 18 ore saranno circa all'80% di confluenza. Ciò lascia loro ancora tempo per crescere ulteriormente, in modo che quindi 24 ore dopo la trasfezione raggiungano il 100% di confluenza. È stato dimostrato che questo aspetto è molto importante per ottenere un ottimo titolo virale.

Il passaggio successivo consiste nell'utilizzo di cloroquina; in realtà, la cloroquina sensibilizza le cellule 2 9 3 e tutti i cambi di mezzo devono essere eseguiti con molta delicatezza per evitare che l'intero strato di cellule 2 9 3 T si stacchi dalla piastra. Infine, il DNA utilizzato per produrre il virus deve essere estremamente puro. Stiamo utilizzando DNA C bandato.

Una volta ottenuto il virus, lo conserviamo a meno 80 gradi. Di solito lo titoliamo una sola volta per ogni passaggio, il che riduce la concentrazione del virus di due volte. Pertanto, preferiamo congelare il virus che abbiamo prodotto e conservarlo in aliquota prima di effettuare il titolo effettivo del virus.

A seconda dei virus, possiamo avere un'espressione di GFP insieme al virus per tracciare le cellule effettivamente infette, oppure possiamo avere resistenza alla neomicina. È molto importante conoscere il titolo del virus prima di utilizzarlo, al fine di poter effettuare confronti tra esperimenti o tra diversi mutanti.