Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing
February 4th, 2017
Questo articolo descrive un metodo per studiare il metabolismo cellulare in comunità complesse di più tipi di cellule, utilizzando una combinazione di tracciamento di isotopi stabili, smistamento cellulare per isolare specifici tipi di cellule e spettrometria di massa.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare il tracciamento isotopico per misurare il metabolismo di popolazioni selezionate di comunità cellulari complesse. Quindi, con questo metodo, possiamo studiare le differenze metaboliche tra sottopopolazioni di comunità cellulari complesse e anche la collaborazione metabolica tra queste sottopopolazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combinando il tracciamento isotopico con la selezione cellulare, possiamo ottenere una misura più affidabile del metabolismo e possiamo anche convalidare l'affidabilità del metodo.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto combina diverse tecniche e il modo in cui le cellule vengono maneggiate e la durata della procedura potrebbero influenzare il metabolismo cellulare. Per l'estrazione dei metaboliti da una piastra, le cellule vengono prima coltivate in una piastra a sei pozzetti in un terreno di coltura marcato con isotopi stabili contenente integratori dializzati. Quando le cellule raggiungono il 75% di confluenza, sciacquare i pozzetti due volte con 500 microlitri di HBSS freddo contenente glucosio uniformemente marcato.
Quindi aggiungere 600 microlitri di metanolo preraffreddato con ghiaccio secco al 100% a ciascun pozzetto e trasferire la piastra sul ghiaccio secco. Utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule, quindi trasferire con cura gli estratti da ciascun pozzetto in singole provette da microcentrifuga. Conservare le cellule a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi della spettrometria di massa.
Per l'estrazione dei metaboliti delle cellule selezionate, le cellule vengono coltivate in un piatto da 100 millimetri in un terreno di coltura marcato con integratori dializzati, in modo che raggiungano il 75% di confluenza entro il giorno dello smistamento. Per la marcatura a impulsi di cellule selezionate nel ciclo cellulare, coltivare le cellule in un terreno non marcato contenente integratori dializzati fino a raggiungere il 75% di confluenza. Quindi, etichettare le cellule per due ore sostituendo il terreno con un terreno di coltura fresco marcato.
Sciacquare il piatto con HBSS caldo contenente glucosio uniformemente etichettato e staccare le cellule con 1,5 millilitri di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius. Dopo quattro minuti, disattivare la tripsina con tre millilitri di HBSS ghiacciato contenente glucosio marcato e integratori dializzati e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in HBSS contenente glucosio marcato, integratori dializzati ed EDTA a una concentrazione da una a due volte 10 a sei cellule per millilitro e filtrare le cellule attraverso un colino da 40 micron per ottenere una sospensione di una singola cellula.
Trasferire le cellule in una provetta da cinque millilitri e ordinarle su un citometro a flusso. Per l'estrazione dei metaboliti da cellule finte selezionate, espellere i detriti e selezionare solo i singoletto. Per l'estrazione dei metaboliti dalle cellule selezionate nel ciclo cellulare, eseguire l'andatura dei detriti e dei doppietti e suddividere le cellule in G1 e SG2M, in base alla fluorescenza della sonda di geminina.
Al termine della cernita, raccogliere le celle per centrifugazione e risospendere il pellet in 50 microlitri di acqua distillata ghiacciata per ottenere un pellet omogeneo. Quindi estrarre rapidamente i metaboliti aggiungendo 540 microlitri di metanolo raffreddato con ghiaccio secco. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi LCMS.
L'estrazione dei metaboliti dalle cellule selezionate deve essere ben pianificata in anticipo, con il lavoro sperimentale completato il più rapidamente possibile per ridurre al minimo le alterazioni metaboliche. Per l'analisi dei metaboliti estratti, selezionare innanzitutto un numero di metaboliti con gli standard disponibili corrispondenti che mostrano picchi di campione di buona qualità. Successivamente, verifica la qualità dei picchi, facendo attenzione a non includere falsi isotopi.
Calcola l'isotopo di massa dalle nostre frazioni per i campioni marcati con isotopi dividendo l'area del picco di ciascun isotopo di massa dalla nostra frazione per le aree di picco totali di tutti gli isotopi di massa dalle nostre frazioni. Quindi, calcolare le frazioni di carbonio etichettate per l'arricchimento del carbonio-13 utilizzando la formula per l'arricchimento del carbonio. Infine, calcolare le frazioni di azoto etichettate per l'arricchimento di azoto-15 utilizzando la formula per l'arricchimento di azoto.
In questo esperimento rappresentativo, 66 metaboliti selezionati dall'analisi dei dati erano presenti nelle cellule simulate selezionate, 60 delle quali sembravano essere marcate con un isotopo di massa simile dalle nostre distribuzioni tra gli estratti piatto e le cellule simulate selezionate. Ad esempio, l'isotopo di massa della nostra distribuzione di glutammato è simile tra la piastra e gli estratti selezionati simulati, indicando che l'isotopo di massa del glutammato della nostra distribuzione è affidabile anche nelle popolazioni cellulari selezionate. L'analisi delle cellule HELA ordinate in stadi del ciclo cellulare G0, G1 o SG2M utilizzando la sonda geminina FUCCI rivela la marcatura della citidina in entrambe le popolazioni con un arricchimento più elevato nello stadio SG2M, coerente con un aumento della sintesi de novo di nucleotidi durante la fase S.
In questo esperimento, l'isotopo di massa della nostra distribuzione ha mostrato lo stesso pattern in entrambe le frazioni ordinate del ciclo cellulare, suggerendo che viene utilizzata la stessa via di sintesi, ma è più attiva nello stadio SG2M, dimostrando che le differenze metaboliche sono facilmente rilevabili con questo metodo, anche tra sottopopolazioni strettamente correlate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona conoscenza di come estrarre i metaboliti dalle frazioni ordinate e comprendere gli avvertimenti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare rapidamente le cellule durante lo smistamento e l'estrazione dei metaboliti, poiché il modo e la durata della manipolazione delle cellule possono influenzare il loro metabolismo.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore. Questa procedura può essere applicata ad altri tipi di cellule. Ad esempio, sottogruppi di cellule immunitarie nel sangue o diversi tipi di cellule all'interno di un tumore, utilizzando una varietà di sonde, anticorpi o metodi di colorazione per lo smistamento.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per studiare il metabolismo cellulare in comunità complesse di più tipi cellulari. La tecnica combina il tracciamento di isotopi stabili, l'ordinamento delle cellule e la spettrometria di massa per analizzare le differenze metaboliche e le collaborazioni tra sottopopolazioni.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Metabolismo cellulare
- Tracciamento degli isotopi
- Spettrometria di massa
Conoscenze di base
- Comprendere il metabolismo nelle comunità cellulari complesse è cruciale per vari studi biologici.
- Il tracciamento degli isotopi consente un'analisi dettagliata dei percorsi metabolici.
- L'ordinamento delle cellule aiuta a isolare tipi cellulari specifici per misurazioni più accurate.
- La spettrometria di massa fornisce una rilevazione sensibile dei metaboliti.
Obiettivo dello studio
- Misurare il metabolismo delle popolazioni ordinate all'interno di comunità cellulari complesse.
- Investigare le differenze metaboliche tra le sottopopolazioni.
- Esplorare le collaborazioni metaboliche tra diversi tipi cellulari.
Metodi utilizzati
- Coltivare le cellule in mezzo con isotopi stabili marcati.
- Ordinare tipi cellulari specifici utilizzando tecniche di ordinamento cellulare.
- Utilizzare la spettrometria di massa per l'analisi dei metaboliti.
- Validare l'affidabilità del metodo attraverso dimostrazioni visive.
Principali risultati
- Migliore comprensione delle differenze metaboliche nelle sottopopolazioni cellulari.
- Collaborazione dimostrata nel metabolismo tra diversi tipi cellulari.
- Validazione dell'affidabilità del metodo combinato.
- Fornire un quadro visivo per la procedura e il suo impatto sul metabolismo cellulare.
Conclusioni
- Il metodo offre un approccio robusto per studiare il metabolismo cellulare.
- Combinare il tracciamento degli isotopi con l'ordinamento cellulare produce dati metabolici affidabili.
- Questa tecnica può essere applicata a varie aree di ricerca che coinvolgono interazioni cellulari complesse.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in discovery biology: obtaining reliable metabolic measurements from heterogeneous cell populations without introducing sorting-induced artifacts. By leveraging stable isotope tracing and mass isotopomer distributions (MIDs), it enables de-risking of target validation through more confident assessment of subpopulation-specific pathway activity. The approach supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true metabolic differences from procedural noise, informing go/no-go decisions in portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by revealing metabolic differences between subpopulations, such as elevated nucleotide synthesis in SG2M versus G1 phases.
- Operational Value: Provides a validation step using mock-sorted controls to confirm that MIDs remain unaltered by sorting stress, ensuring data integrity before downstream analysis.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathway consistency (e.g., nucleotide synthesis) while quantifying activity differences across closely related states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible MID readouts from sorted fractions that are amenable to high-resolution mass spectrometry and scalable across sample sets.
- Screening Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline metabolic profiles in defined subpopulations.
- Platform Reuse: The workflow—combining isotope labeling, sorting, and LC-HRMS—can be adapted to immune subsets or tumor microenvironments using alternative probes or staining methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolic profiling to preclinical validation by enabling consistent measurement of pathway activity in sorted populations across experimental models.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates prioritization of targets or mechanisms based on subpopulation-specific metabolic dependencies, reducing false leads in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing metabolic resolution that complements genomic and proteomic subpopulation analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating metabolic signals specific to sorted subpopulations, such as cell cycle phases.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative metabolite enrichment data that enable reliable comparison of compound effects across defined fractions.
- Analytics: Generates mass isotopomer distributions and labeled carbon/nitrogen fractions that serve as stable, time-integrated readouts for pathway flux assessment.
- Translational Research: Enables continuity from sorted population analysis in vitro to preclinical models by preserving metabolic state fidelity through MID-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic phenotyping of any sortable subpopulation, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterogeneous systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal controls (mock-sorted samples) that verify methodological robustness.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier, more accurate go/no-go decisions based on subpopulation-specific metabolic dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting metabolic vulnerabilities in distinct cell states, informing combination therapy or biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stable isotope labeling, flow cytometry sorting, and LC-HRMS data analysis for metabolite enrichment calculations.
- Depends on access to cell sorters, mass spectrometry platforms, and isotope-labeled media with dialyzed supplements.
- Necessitates standardized handling procedures to minimize metabolic drift during sorting and extraction, particularly for time-sensitive samples.
- Involves adaptation considerations when applying the method to primary cells or tissues with varying fragility or sorting efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for rapid metabolite extraction post-sort to prevent ex vivo metabolic alterations, as noted in the protocol.
