Name: Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Scopri come misurare il metabolismo cellulare in sottopopolazioni ordinate di comunità cellulari complesse utilizzando il tracciamento con isotopi stabili. Questo metodo combina citometria a flusso e spettrometria di massa.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Anas Kamleh per il prezioso aiuto nell'ottimizzazione dei metodi di spettrometria di massa e Annika von Vollenhoven per l'assistenza nella selezione cellulare. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione svedese per la ricerca strategica (sovvenzione n. FFL12-0220) e il programma strategico per la ricerca sul cancro (IR, RN); la Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); e Mary Kay Foundation (JW, MJ).

1. Estrazione Metabolite <ol><li> Estrazione da piatto <ol><li> cellule di coltura in una piastra da 6 pozzetti in triplicato in isotopi etichettato terreni di coltura stabile + supplementi dializzati (siero o altri integratori di crescita) fino a quando le cellule diventano il 75% confluenti. NOTA: Qui coltura cellule HeLa per 48 ore in RPMI contenente 40% di U- 13 C-glucosio e il 70% U 13 C, 15 N2-glutammina e 5% dializzato FBS (siero fetale bovino). Dializzato FBS viene usato per liberarsi dei piccoli metaboliti peso molecolare che possano contaminare i media etichettati. Si raccomanda coltura di cellule in appendice dializzato prima della esperimento reale per garantire cellule crescono normalmente in mezzo. I supplementi sono dializzati in 0,15 M di NaCl soluzione durante la notte utilizzando pelle di serpente tubo di dialisi. </li><li> Al giorno di terreni di coltura di estrazione degli scarti, lavare i pozzi due volte con 500 microlitri HBSS freddo e poi disfarsene. NOTA: Qui utilizzare HBSS contenente il 40% U-13 C-glucosio essendo anche nei mezzi di coltura. </li><li> Aggiungere 600 ml metanolo 100% pre-raffreddata in ghiaccio secco. </li><li> Trasferire il piatto di ghiaccio secco e rimuovere il materiale delle cellule con un raschietto cellulare. </li><li> pipetta con attenzione gli estratti di cellule in una provetta e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi spettrometria di massa. </li></ol></li><li> Estrazione di cellule ordinati finti <ol><li> cellule di coltura in un piatto 100 millimetri in triplice copia in isotopi etichettato terreni di coltura + supplementi dializzati stabili. NOTA: Qui coltura cellule HeLa per 48 h in piatto 100 millimetri perché un elevato numero di celle (~ 4 x 10 6) sono necessarie per ottenere 500.000 cellule ordinati. Questo numero di HeLa estratto cellule è stato richiesto per ottenere una buona misura di metaboliti. I terreni di coltura utilizzato era RPMI contenente 40% di U- 13 C-glucosio e il 70% U-13 C, 15 N2-glutammina e il 5% dializzato FBS. </li><li> Al giorno d&#39;estrazione, terreni di coltura scarti, lavare i pozzi wesimo 1.5 mL caldo HBSS e poi disfarsene. </li><li> Staccare cellule aggiungendo 1,5 ml di tripsina / EDTA per 4 min a 37 ° C. Effettuare le seguenti operazioni a 4 ° C o nel ghiaccio. </li><li> Disattivare tripsina con l&#39;aggiunta di 3 ml di ghiaccio HBSS freddo (soluzione salina bilanciata di Hank) + supplemento dializzato. </li><li> Raccogliere cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e 750 xg per 3 min. </li><li> Risospendere il pellet in HBSS + dializzata supplemento + 1 mM EDTA ad una concentrazione di 1-2 x 10 6 cellule / ml, passano attraverso 40 micron filtri cellulari per ottenere cellule singole, e trasferire in una provetta da 5 ml. </li><li> cellule ordinare attraverso cell sorter gating solo per canottiere, e le cellule centrifugare ordinato a 750 xg per 3 min a 4 ° C. NOTA: qui Trova cellule HeLa a una velocità di 1.000 eventi / s, con la pressione dello strumento 27 psi, e l&#39;utilizzo di un ugello 100 micron. cellule HeLa sono grandi quindi dovrebbero essere ordinati ad un tasso di eventi lento e grande bocchetta per ottenere pellet più intatto possibile. Mantenere le cellule in blocchi freddi throughout ordinamento per diminuire il metabolismo. Una descrizione approfondita della procedura di selezione è descritto in precedenza 12. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 50 microlitri di ghiaccio dH freddo 2 O per ottenere un pellet omogeneo prima di aggiungere metanolo. L&#39;aggiunta di metanolo freddo direttamente al pellet forma un pellet solido che è difficile da risospendere. </li><li> Estrarre metaboliti aggiungendo 540 ml di metanolo mantenuto in ghiaccio secco e mantenere estratti a -80 ° C fino cromatografia liquida - spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) analisi. </li></ol></li><li> Estrazione del ciclo cellulare allineati cellule <ol><li> cellule di coltura in un piatto 100 millimetri in triplice copia in cultura dei media + supplementi dializzati. NOTA: Qui cellule HeLa coltura contenenti Geminin Fucci verde (MAG1-hGem) sonda 13 che consente per l&#39;ordinamento di G1 (negativo) e le cellule SG2M (positive). Le celle possono essere coltivate in un supporto stabile isotopi traccia per uns tempo necessario. Qui li abbiamo in coltura per 46 ore in supporti senza etichetta, allora abbiamo passato a RPMI contenente 40% di U- 13 C-glucosio e il 70% U-13 C, 15 N2-glutammina 2 ore prima di iniziare l&#39;ordinamento. Ciò è stato fatto in modo da essere in grado di studiare le fasi del ciclo cellulare che richiede un breve impulso di etichettatura. </li><li> Al giorno d&#39;estrazione, terreni di coltura scarti, lavare i pozzetti con 1,5 ml caldo HBSS e poi disfarsene. </li><li> Staccare cellule aggiungendo 1,5 ml di tripsina / EDTA per 4 min a 37 ° C. Effettuare le seguenti operazioni a 4 ° C o nel ghiaccio. </li><li> Disattivare tripsina con l&#39;aggiunta di 3 ml di ghiaccio freddo HBSS + supplemento dializzato. </li><li> Raccogliere cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e 750 xg per 3 min. </li><li> Risospendere il pellet in HBSS + dializzata supplemento + 1 mM EDTA ad una concentrazione di 1-2 x 10 6 cellule / ml, passano attraverso 40 micron filtri cellulari per ottenere cellule singole, e trasferire in una provetta da 5 ml. </li><li> cellule ordinare attraverso il cell sorter gDELL&#39;INDICE DI i detriti e doppietti, quindi gating per il marcatore di cellule; e centrifugare le cellule filtrate a 750 xg per 3 min a 4 ° C. NOTA: qui Trova cellule HeLa a una velocità di 1.000 eventi / s, con la pressione dello strumento 27 psi, e l&#39;utilizzo di un ugello 100 micron. Mantenere le cellule in blocchi fredde tutto l&#39;ordinamento per diminuire il tasso di metabolismo. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 50 microlitri di ghiaccio dH freddo 2 O per ottenere un pellet omogeneo prima di aggiungere metanolo. L&#39;aggiunta di metanolo freddo direttamente al pellet forma un pellet solido che è difficile da risospendere. </li><li> Estrarre i metaboliti aggiungendo 540 ml di metanolo mantenuto in ghiaccio secco e mantenere estratti a -80 ° C fino all&#39;analisi LC-HRMS. </li></ol></li></ol> Analisi 2. Spettrometria di Massa Nota: Qui si descrive il protocollo per l&#39;analisi di estratti cellulari su un sistema LC-HRMS. Qualsiasi metodo metabolomica per analisi di estratti cellulari possono essere usati. Scansione completaanalisi potrebbe essere utile per rilevare una vasta gamma di metaboliti. <ol><li> Calibrare lo strumento utilizzando un mix di calibrazione di riferimento spettrometria di massa. </li><li> estratti cellulari Scongelare in ghiaccio per 30 minuti e vortex per 15 s. </li><li> Trasferire 100 microlitri dell&#39;estratto cellulare ad un filtro rotativo e centrifugare per 10 minuti a 13.000 xga 4 ° C. </li><li> Iniettare 12,5 ml di filtrato nel sistema LC-HRMS. </li><li> metaboliti separate utilizzando una zwitterionici interazione idrofilica cromatografia liquida (ZIC-HILIC) della colonna (150 mm x 4.6 mm 5 micron dimensione delle particelle) dotati di una colonna di guardia ZIC-HILIC (20 mm × 2,1 millimetri) con un gradiente di eluizione dello 0,1% formico L&#39;acido in acqua (a solvente) e acetonitrile (solvente B). Avviare il gradiente di eluizione a 20% di solvente A e aumentare fino al 80% in 17 min. Mantenere questa percentuale durante 4 minuti con un flusso di 400 ml min -1 e temperatura della colonna e vassoio di campione a 23 ° C e 4 ° C, rispettivamente. </li><li> Utilizzare un iNstrument accoppiato alla separazione cromatografica per il rilevamento metaboliti, un elettrospray riscaldata (H-ESI II) sia in modalità positivi e negativi come sorgente di ionizzazione, e una modalità di acquisizione scansione completa ad una massa risolvere potenza di 70.000 Figura Larghezza tempo massimo (FWHM) ( m / z 200). </li><li> Utilizzare azoto (purezza&gt; 99,995%) per il gas guaina e gas ausiliario ad una portata di 45 e 10 au (unità arbitrarie) e temperatura vaporizzatore impostata a 350 ° C e la tensione electrospray a 4 kV in modalità positiva e -3.5 kV in modalità negativa. </li></ol> Analisi 3. Dati <ol><li> Selezionare un numero di metaboliti per i quali sono disponibili gli standard e che mostrano picchi di qualità di campioni. picchi di buona qualità hanno un elevato rapporto segnale-rumore. E &#39;importante verificare la qualità di picco e assicurarsi di non includere falsi isotopi. picchi isotopici che differiscono in forma e / o tempo di ritenzione sono probabilmente false. </li><li> Per i campioni marcati con isotopi calcolano isotopomero di massa (MI) frazioni dividendo l&#39;area del picco di ogni MI con superficie totale di picco di tutti i MIS. </li><li> Calcolare le frazioni di carbonio / azoto etichettati, arricchimento del 13 C e 15 N, rispettivamente, come <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> dove n è il numero totale di atomi di carbonio (o atomi di azoto, rispettivamente) nel metabolita, e Mix è la frazione MI di x. NOTA: Tutti i calcoli possono essere eseguiti utilizzando linguaggi di programmazione. </li></ol>

<ol><li>Gregersen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+eQTLs+in+the+human+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific eQTLs in the human immune system.</a> Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).</li>
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<li>Moussaieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metabolic+mapping+of+cell+types+in+plant+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).</li>
<li>Johnson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+of+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature of colon cancer initiating cells.</a> Cancer Metab. 2, 32(2014).</li>
<li>Roci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+Profiling+and+Stable+Isotope+Tracing+in+Sorted+Subpopulations+of+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).</li>
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<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il nostro metodo si basa sul principio che MIDs in metaboliti cellulari riflettono la &quot;storia&quot; delle attività metaboliche di una cella. Questo rende possibile indagare attività metaboliche in sottopopolazione di cellule, come si è verificato nel complesso comunità di cellule, prima della procedura di cell sorting. Al contrario, le aree di picco di metaboliti differiscono notevolmente tra estratti di cellule ordinati e estrazione diretta dal piatto della cultura 11. In parte ciò è dovuto...

organismi superiori contengono comunità complesse di tipi cellulari diversi che collaborano per realizzare le funzioni più complesse. Ad esempio, i tumori contengono non solo le cellule cancerose, ma anche fibroblasti, cellule che costituiscono i vasi sanguigni e cellule immunitarie spesso infiltrati 1; sangue contiene una miscela complessa di decine di sottotipi di cellule immunitarie 2; e anche le linee cellulari in coltura possono consistere di più sottopopolazioni, come il lume e sottotipi basali delle cellule di carcinoma mammario 3. Inoltre, tipi di cellule distinte che coesistono può esibire metabolica &quot;collaborazione&quot;. Ad esempio, nel cervello, astrociti sono pensati per convertire il glucosio in lattato, che è poi &quot;alimentato&quot; ai neuroni che ossidano il substrato 4; I linfociti T sono in alcuni contesti dipendenti cellule dendritiche adiacenti come fonte di cisteina 5; e le cellule tumorali possono collaborare con Assofibroblasti ciati nei tumori 6. Per comprendere il comportamento metabolico di tali sistemi, è essenziale per separare e misurare le attività metaboliche dei vari tipi di cellule presenti. Di gran lunga il metodo più utilizzato per separare tipi cellulari è fluorescenza-attivato cell sorting. Questo metodo è ampiamente applicabile, a condizione che il tipo di cellula o lo stato di interesse possono essere &quot;etichettati&quot; con anticorpi fluorescenti, espressione di proteine ​​fluorescenti ingegnerizzate, o altri coloranti. Una possibilità è quella di tipi inizialmente separati cellule attraverso un cell sorter, ri-cultura dei singoli tipi di cellule ottenute, e quindi eseguire studi sul metabolismo di queste culture 7. Tuttavia, ciò è possibile solo se il tipo di cellula o fenotipo è stabile in condizioni di coltura, e non possono catturare comportamento transitorio come stati del ciclo cellulare, né la cooperazione metabolica in co-coltura. Per tali casi, il metabolismo deve essere misurata direttamente su cosìcellule ari. Questa è una sfida dal momento che la cellula di smistamento procedura sottopone cellule alle sollecitazioni che possono falsare il loro metabolismo 8, e siamo consapevoli di solo pochi studi che prendono questo approccio 9, 10. In particolare, abbiamo trovato che i principali metaboliti come aminoacidi può fuoriuscire dalle cellule tenuti in memoria di cella di smistamento, in modo che le misurazioni dell&#39;abbondanza metabolita assoluto non sono più affidabili 11 (anche se il confronto relativo tra le frazioni ordinate può essere ancora valido). Per aggirare questi problemi, etichettiamo le cellule con isotopi stabili prima di ordinamento e concentriamo sui MID di metaboliti cellulari, piuttosto che abbondanze di metaboliti. Dal momento che i MID si formano su scale temporali più lunghi, essi dovrebbero essere meno influenzati da esposizione a breve termine a condizioni di ordinamento. Abbiamo quantificare MID utilizzando la spettrometria di massa ad alta risoluzione full-scan, che è abbastanza sensibile per fornire data su centinaia di metaboliti a partire da circa 500.000 cellule ordinati, che richiede circa 30-60 minuti di tempo l&#39;ordinamento delle cellule. Un confronto tra un &quot;finto allineati&quot; controllo (cellule passati attraverso lo strumento sorter cella senza gating alcuna specifica popolazione) ed estrazione metabolita direttamente dal piatto di coltura è fatto per assicurare che le MIDs osservati sono rappresentativi di quelli nella cultura originale. A seconda della scelta di isotopi stabili, varie vie metaboliche possono essere studiate con questo metodo.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-13C-Glucosio</td><td>Isotopi Cambridge</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-13C,15N2-Glutammina</td><td>Isotopi Cambridge</td><td>CNLM-1275-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (JT Baker), grado HPLC</td> Filtri centrifughi <td>VWR</td><td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0,1 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3.000 UHPLC</td><td>Thermo Fisher Spettrometro di</td> massa Q-Exactive Orbitrap Colonna <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC (150 mm x 4,6&nbsp; mm, 5 &micro; m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC colonna di protezione (20 mm x 2,1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC-MS, vetro ambrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q acqua</td><td>Millipore</td><td></td><td>Prodotto con un sistema a gradiente Milli-Q</td></tr><tr><td>Myrsyra 99,5% Optima (acido formico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11423423</td><td></td></tr><tr><td>X100 Fiala a vite 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, ambra, 100 unità</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE Imballaggio 8-425 (tappi a vite)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MSCAL5</td><td>Kit di calibrazione</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&nbsp;</td>Ricerca <td></td><td></td><td>Wolfram</td></tr></tbody></table>

un metodo per misurare il metabolismo in ordinati sottopopolazioni di cellule comunità complessi utilizzando stable isotope tracing

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

I tipi di cellule dei mammiferi mostrano un metabolismo specializzato, e ci sono ampie prove che vari tipi di cellule coesistenti si impegnano nella cooperazione metabolica. Inoltre, anche le colture di un singolo tipo di cellula possono contenere cellule in stati metabolici distinti, come le cellule a riposo o in ciclo. I metodi per misurare le attività metaboliche di tali sottopopolazioni sono strumenti preziosi per comprendere il metabolismo cellulare. Le popolazioni cellulari complesse sono più comunemente separate utilizzando un selezionatore cellulare e le sottopopolazioni isolate con questo metodo possono essere analizzate con metodi metabolomici. Tuttavia, un problema con questo approccio è che la procedura di smistamento cellulare sottopone le cellule a stress che possono distorcere il loro metabolismo.
Per superare questi problemi, abbiamo ragionato che le distribuzioni di massa degli isotopomeri (MID) dei metaboliti provenienti da cellule coltivate con nutrienti marcati con isotopi stabili sono probabilmente più stabili delle concentrazioni assolute dei metaboliti, perché i MID si formano su scale temporali più lunghe e dovrebbero essere meno influenzati dall'esposizione a breve termine a condizioni di smistamento cellulare. Qui, descriviamo un metodo basato su questo principio, che combina la selezione cellulare con la cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS). La procedura prevede l'analisi di tre tipi di campioni: (1) estratti di metaboliti ottenuti direttamente dalla popolazione complessa; (2) estratti di cellule "finte selezionate" passate attraverso lo strumento di selezione cellulare senza gating di alcuna popolazione specifica; e (3) estratti delle popolazioni effettivamente selezionate. Le celle simulate selezionate vengono confrontate con l'estrazione diretta per verificare che i MID non vengano effettivamente alterati dalla procedura di smistamento delle cellule stessa, prima di analizzare le popolazioni effettivamente selezionate. Mostriamo esempi di risultati da cellule HeLa ordinate in base alla fase del ciclo cellulare, rivelando cambiamenti nel metabolismo dei nucleotidi.

Come esempio, qui si descrive un esperimento indagare il metabolismo delle cellule HeLa selezionati secondo fase del ciclo cellulare. Per etichettare una vasta gamma di metaboliti centrali su entrambi i carboni e atomi di azoto, abbiamo coltivato le cellule per 48 h utilizzando U- 13 C-glucosio e U- 13 C, 15 N-glutammina come traccianti. Per ottenere MID ricche per l&#39;esperimento di validazione, abbiamo scelto qui una miscela di 40% U- 13 C-...

Questo articolo descrive un metodo per studiare il metabolismo cellulare in comunità complesse di più tipi di cellule, utilizzando una combinazione di tracciamento di isotopi stabili, smistamento cellulare per isolare specifici tipi di cellule e spettrometria di massa.

Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare il tracciamento isotopico per misurare il metabolismo di popolazioni selezionate di comunità cellulari complesse. Quindi, con questo metodo, possiamo studiare le differenze metaboliche tra sottopopolazioni di comunità cellulari complesse e anche la collaborazione metabolica tra queste sottopopolazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combinando il tracciamento isotopico con la selezione cellulare, possiamo ottenere una misura più affidabile del metabolismo e possiamo anche convalidare l'affidabilità del metodo.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto combina diverse tecniche e il modo in cui le cellule vengono maneggiate e la durata della procedura potrebbero influenzare il metabolismo cellulare. Per l'estrazione dei metaboliti da una piastra, le cellule vengono prima coltivate in una piastra a sei pozzetti in un terreno di coltura marcato con isotopi stabili contenente integratori dializzati. Quando le cellule raggiungono il 75% di confluenza, sciacquare i pozzetti due volte con 500 microlitri di HBSS freddo contenente glucosio uniformemente marcato.Quindi aggiungere 600 microlitri di metanolo preraffreddato con ghiaccio secco al 100% a ciascun pozzetto e trasferire la piastra sul ghiaccio secco. Utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule, quindi trasferire con cura gli estratti da ciascun pozzetto in singole provette da microcentrifuga. Conservare le cellule a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi della spettrometria di massa.Per l'estrazione dei metaboliti delle cellule selezionate, le cellule vengono coltivate in un piatto da 100 millimetri in un terreno di coltura marcato con integratori dializzati, in modo che raggiungano il 75% di confluenza entro il giorno dello smistamento. Per la marcatura a impulsi di cellule selezionate nel ciclo cellulare, coltivare le cellule in un terreno non marcato contenente integratori dializzati fino a raggiungere il 75% di confluenza. Quindi, etichettare le cellule per due ore sostituendo il terreno con un terreno di coltura fresco marcato.Sciacquare il piatto con HBSS caldo contenente glucosio uniformemente etichettato e staccare le cellule con 1,5 millilitri di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius. Dopo quattro minuti, disattivare la tripsina con tre millilitri di HBSS ghiacciato contenente glucosio marcato e integratori dializzati e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in HBSS contenente glucosio marcato, integratori dializzati ed EDTA a una concentrazione da una a due volte 10 a sei cellule per millilitro e filtrare le cellule attraverso un colino da 40 micron per ottenere una sospensione di una singola cellula.Trasferire le cellule in una provetta da cinque millilitri e ordinarle su un citometro a flusso. Per l'estrazione dei metaboliti da cellule finte selezionate, espellere i detriti e selezionare solo i singoletto. Per l'estrazione dei metaboliti dalle cellule selezionate nel ciclo cellulare, eseguire l'andatura dei detriti e dei doppietti e suddividere le cellule in G1 e SG2M, in base alla fluorescenza della sonda di geminina.Al termine della cernita, raccogliere le celle per centrifugazione e risospendere il pellet in 50 microlitri di acqua distillata ghiacciata per ottenere un pellet omogeneo. Quindi estrarre rapidamente i metaboliti aggiungendo 540 microlitri di metanolo raffreddato con ghiaccio secco. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi LCMS.L'estrazione dei metaboliti dalle cellule selezionate deve essere ben pianificata in anticipo, con il lavoro sperimentale completato il più rapidamente possibile per ridurre al minimo le alterazioni metaboliche. Per l'analisi dei metaboliti estratti, selezionare innanzitutto un numero di metaboliti con gli standard disponibili corrispondenti che mostrano picchi di campione di buona qualità. Successivamente, verifica la qualità dei picchi, facendo attenzione a non includere falsi isotopi.Calcola l'isotopo di massa dalle nostre frazioni per i campioni marcati con isotopi dividendo l'area del picco di ciascun isotopo di massa dalla nostra frazione per le aree di picco totali di tutti gli isotopi di massa dalle nostre frazioni. Quindi, calcolare le frazioni di carbonio etichettate per l'arricchimento del carbonio-13 utilizzando la formula per l'arricchimento del carbonio. Infine, calcolare le frazioni di azoto etichettate per l'arricchimento di azoto-15 utilizzando la formula per l'arricchimento di azoto.In questo esperimento rappresentativo, 66 metaboliti selezionati dall'analisi dei dati erano presenti nelle cellule simulate selezionate, 60 delle quali sembravano essere marcate con un isotopo di massa simile dalle nostre distribuzioni tra gli estratti piatto e le cellule simulate selezionate. Ad esempio, l'isotopo di massa della nostra distribuzione di glutammato è simile tra la piastra e gli estratti selezionati simulati, indicando che l'isotopo di massa del glutammato della nostra distribuzione è affidabile anche nelle popolazioni cellulari selezionate. L'analisi delle cellule HELA ordinate in stadi del ciclo cellulare G0, G1 o SG2M utilizzando la sonda geminina FUCCI rivela la marcatura della citidina in entrambe le popolazioni con un arricchimento più elevato nello stadio SG2M, coerente con un aumento della sintesi de novo di nucleotidi durante la fase S.In questo esperimento, l'isotopo di massa della nostra distribuzione ha mostrato lo stesso pattern in entrambe le frazioni ordinate del ciclo cellulare, suggerendo che viene utilizzata la stessa via di sintesi, ma è più attiva nello stadio SG2M, dimostrando che le differenze metaboliche sono facilmente rilevabili con questo metodo, anche tra sottopopolazioni strettamente correlate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona conoscenza di come estrarre i metaboliti dalle frazioni ordinate e comprendere gli avvertimenti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare rapidamente le cellule durante lo smistamento e l'estrazione dei metaboliti, poiché il modo e la durata della manipolazione delle cellule possono influenzare il loro metabolismo.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore. Questa procedura può essere applicata ad altri tipi di cellule. Ad esempio, sottogruppi di cellule immunitarie nel sangue o diversi tipi di cellule all'interno di un tumore, utilizzando una varietà di sonde, anticorpi o metodi di colorazione per lo smistamento.

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Stabile mediante l'analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel...

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13 C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.

Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

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L'approccio di marcatore trofica dell'acido grasso, vale a dire, l'assimilazione degli acidi grassi come intera molecola e trasferimento nel tessuto dei consumatori con no o minori modifiche, è ostacolata da lacune nel metabolismo dell'acido grasso di invertebrati del suolo piccolo. Isotopologue profilatura viene fornito come un prezioso strumento per districarsi tra interazioni trofiche.

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Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

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Scopri come misurare il metabolismo cellulare in sottopopolazioni ordinate di comunità cellulari complesse utilizzando il tracciamento con isotopi stabili. Questo metodo combina citometria a flusso e spettrometria di massa.

Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing (Video) | JoVE Journal

Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

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