Name: ADSC fogli trapianto per prevenire stenosi dopo esteso esofagea endoscopica della sottomucosa dissezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Scopri la tecnica di trapianto di fogli di ADSC per prevenire la stenosi esofagea dopo dissezione endoscopica della sottomucosa estesa in un modello suino. Questo metodo innovativo migliora i risultati chirurgici.

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Questo studio è stato sostenuto e finanziato dalla Fondazione Avenir (Fondation de l'Avenir, 255 rue de Vaugirard, 75719 Paris cedex 15, Parigi, Francia). Questo studio non sarebbe mai stato condotto senza il prezioso aiuto dell'équipe veterinaria del Laboratorio di Ricerca Biochirurgica della Fondazione Alain Carpentier.

Tutti gli animali sono stati trattati secondo il comitato etico Animal Research (linee guida del Ministero dell&#39;Agricoltura francese). Il protocollo ha ricevuto l&#39;approvazione del comitato etico locale autorizzato per sperimentazioni animali al Paris Descartes University (numero di registrazione MESR 2.035,02; Facoltà di Medicina Paris Descartes, Parigi, Francia). 1. ADSC cultura e etichettatura <ol><li> Ottenere ADSCs confermati da un istituto privato. Culture ADSCs allogeniche a 37 ° C e 5% di CO 2 con un minimo di alpha mezzo essenziale di cui 10% di siero di vitello fetale e 1% di antibiotici (penicillina e streptomicina). </li><li> Ottenere circa 24 x 10 6 ADSCs per animale utilizzando le procedure di espansione delle cellule normali (37 ° C e 5% di CO 2). Raccogliere le ADSCs utilizzando una soluzione di tripsina standard (10 ml per un piatto T150). Effettuare il conteggio delle cellule con un emocitometro. </li><li> Eseguire cellule etichettatura il giorno prima del trapianto con il pr PKH67 colorazioneocedure descritto di seguito. NOTA: L&#39;obiettivo della procedura di colorazione è quello di consentire il monitoraggio delle cellule dopo il trapianto. <ol><li> Al fine di etichettare 2 x 10 6 ADSCs, preparare Soluzione A (2 x 10 6 cellule con 100 ml di diluente C) e Soluzione B (4 ml di PKH67 con 1 ml di diluente C). </li><li> Incubare soluzioni A e B per 2 min. Quindi, aggiungere 100 ml di siero di vitello fetale per 1 min. </li><li> Lavare la soluzione con 300 ml di citrato RPMI (298,5 ml di RPMI e 1,5 ml di citrato) e centrifugare a 1500 xg per 5 min. Ripetere questa operazione 2 volte. Mantenere le cellule marcate e proteggerli dalla luce fino alla costruzione foglio. </li></ol></li></ol> 2. Fare doppio ADSC fogli Construct <ol><li> Il giorno prima del trapianto, preparare un sensibile alla temperatura piatto di coltura cellulare 12 pozzetti con 4 ml per pozzetto di mezzo di coltura cellulare, sopra descritti, prima PKH-etichettatura. Seme il piatto con 1,5 x 10 6 PKH-labeled cellule per pozzetto e incubare per 12 ore (37 ° C e 5% di CO 2). </li><li> Il giorno del trapianto, staccare il foglio di cellule confluenti incubando il piatto a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aspirare delicatamente un foglio ADSC con una pipetta e strato su un foglio idrofoba (1,5 cm di diametro). Utilizzare questo documento come una membrana di supporto. </li><li> Afferrare un altro foglio ADSC e delicatamente depositarlo sopra l&#39;altro per ottenere un costrutto doppio strato. </li><li> Ripetere queste procedure per ottenere il maggior numero di costrutti ADSC fogli, se necessario (4 per animale). </li></ol> 3. esofagea endoscopica della sottomucosa dissezione (ESD) <ol><li> Il giorno del trapianto, pre-medicare animali con 10 mg / kg di ketamina intramuscolare e indurli con 8 mg / kg di propofol endovenosa. Quindi, eseguire l&#39;intubazione endotracheale e mantenere l&#39;anestesia con isoflurano 2,5% inalazione. </li><li> Una volta che l&#39;animale è sotto anestesia generale, eseguire ESD con gastroscOPE, un videoscope, e un elettrobisturi. <ol><li> Utilizzare un coltello endoscopica e coagulazione morbido per ottenere i marchi dorsali emi-circonferenziale che vanno da 40 cm a 45 cm dal arcata dentale. </li><li> Iniettare una soluzione di glicerolo contenente indaco carminio colorante nello strato sottomucosa per la separazione dello strato mucoso dallo strato muscolare. </li><li> Utilizzare un coltello endoscopica con modalità endocut ho per ottenere incisioni circonferenziali. </li><li> Utilizzare un coltello endoscopica con modalità di coagulazione costretto ad eseguire la dissezione sottomucosa, spostando dall&#39;incisione prossimale all&#39;incisione distale. </li></ol></li><li> Al termine della procedura ESD, osservare l&#39;emi-circonferenziale, 5 cm-lunga cicatrice esofageo esponendo lo strato muscolare. </li></ol> 4. endoscopica Trapianto <ol><li> Subito dopo la ESD, per via endoscopica trapianto di animali con 4 costrutti doppio ADSC fogli. <ol><li> Afferrare un costrutto ADSC fogli con una pinza endoscopica eproteggerlo durante il trasporto al sito della ferita utilizzando un grande tappo endoscopica trasparente,. </li><li> Applicare l&#39;intera superficie del costrutto ADSC fogli al letto dell&#39;ulcera. </li><li> Applicare delicatamente il costrutto ADSC fogli per 10 minuti per ottenere un attecchimento completo e stabile. Per l&#39;applicazione, utilizzare una pinza endoscopica o un tappo endoscopica e applicare tutta la superficie del ADSC costruire sullo strato sottomucosa esofagea. </li></ol></li><li> Ripetere questa procedura quattro volte per ogni animale in modo da ottenere quattro doppi costrutti cellule fogli trapiantati ed aderenti. NOTA: L&#39;obiettivo è quello di coprire approssimativamente la metà della superficie feriti. </li></ol> 5. postoperatoria valutazione e di follow-up <ol><li> Per ciascun animale, garantire post-ESD analgesia con l&#39;iniezione intramuscolare di 0,2 mg / kg di morfina tre volte al giorno per il primo giorno e con 28 giorni di trattamento anti-acido di esomeprazolo (40 mg / die). Eseguire la profilassi antibiotica con amoxicillin (1 g / giorno) per 7 giorni. Autorizzare liquidi al giorno 1 e solidi il giorno successivo. </li><li> Follow-up con gli animali per 28 giorni. Ottenere valutazioni cliniche quotidiane utilizzando Mellow Pinkas punteggi disfagia 16 e le misure di variazione di peso. </li><li> Valutazione stenosi multimodale: in anestesia generale, nei giorni programmati 3, 14, e 28, effettuare una valutazione multimodale di stenosi occorrenza. <ol><li> Eseguire una valutazione endoscopica utilizzando descrizione cicatrice, la misurazione stenosi, e la rilevazione della membrana supporto cartaceo. Misurare la stenosi utilizzando il gastroscopio per attraversare attraverso la stenosi (il diametro del gastroscopio è di 8 mm). Osservare la cicatrice, prestando attenzione all&#39;aspetto infiammatoria (eritema della mucosa, edema della mucosa e della mucosa emorragie spontanee) e l&#39;assenza o la presenza della membrana supporto cartaceo all&#39;interno della cicatrice. </li><li> Applicare PCle sonda verde attraverso il canale operatore gastroscopio direttamente nel letto cicatrice. Cerca una spontaneae il segnale verde compatibile con PKH67 marcato ADSC fogli costrutto attecchimento organizzata. </li><li> Eseguire 2 incidenza ortogonali di barite esophagography con un cerchio radiologico (anteriore e incidenze lato sinistro). Mantenere l&#39;incidenza più stretto per la valutazione stenosi (grado di stenosi (%) = [1- (lunghezza dell&#39;asse breve sotto stenosi / lunghezza dell&#39;asse normale sotto stenosi) x 100)]) 17, 18. </li></ol></li><li> sacrificio animale. <ol><li> Il giorno 28, al termine del periodo di follow-up, eseguire il sacrificio di animali. Mentre l&#39;animale è ancora in anestesia generale, iniettare 100 mg / kg di fenobarbital endovenosa. Assicurarsi che la morte degli animali mediante esame clinico per l&#39;assenza di un battito cardiaco e la respirazione di movimento. </li><li> Dopo un&#39;esposizione sternotomia e organo, rimuovere l&#39;esofago di ogni sacrificati animali (con il 10% di fissaggio in formalina tamponata, paraffina, e le sezioni 4 micron di spessore). Colorare le diapositivecon ematossilina e Zafferano 15. Digitalizzare i vetrini per l&#39;analisi computerizzata e confrontare i gruppi di animali 15. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo modello di maiale, il trapianto di ADSC fogli era tecnicamente riuscita, e il vivo di valutazione PCle in permesso per il monitoraggio attecchimento delle cellule. valutazioni cliniche, endoscopici, radiologici e istologici hanno dimostrato l&#39;efficacia del foglio ADSC endoscopica alla prevenzione stenosi esofagea dopo ESD prolungato. Il trapianto endoscopica di una soluzione di glicerolo ADSC contenente un foglio di tintura indaco carminio è un approccio innov...

La gestione dei tumori esofagei superficiali è cambiato con lo sviluppo di nuove tecniche endoscopiche. Al giorno d&#39;oggi, la resezione endoscopica è il trattamento di prima linea. Infatti, è associata a tassi di morbilità e mortalità inferiori rispetto a un intervento chirurgico con risultati uguali oncologici 1, 2, 3. resezione endoscopica della mucosa (EMR) e la resezione endoscopica della sottomucosa (ESD) sono le tecniche più utilizzati. Nel caso di un tumore superficiale esteso, ESD è preferito. Rispetto a EMR, ESD permette resezione in blocco, indipendentemente dalle dimensioni della lesione e la forma 4, 5, 6. La principale complicazione ritardata di ESD è formazione di stenosi esofagea, che si verifica in genere tra una e due settimane dopo la resezione. studi pubblicati recenti hanno dimostrato che la formazione di stenosi è correlatodimensioni della resezione. Il giapponese endoscopica Society raccomanda di evitare ESD di dimensioni superiori a ¾ della circonferenza esofageo perché sono associati con lo sviluppo stenosi in più del 90% dei casi e sono responsabili di problemi di alimentazione severe e maggiore deterioramento della qualità della vita. La prevenzione della stenosi esofagea rimane difficile. Meccanismi coinvolti nella formazione di stenosi sono solo parzialmente noti. Stenosi formazioni sembra derivare dalla associazione di due diversi meccanismi: (1) pro-infiammatorie reclutamento cellulare e (2) un eccessivo sviluppo della fibrosi 7. Sono stati proposti diversi trattamenti preventivi. Tuttavia, i risultati non sono stati soddisfacenti, con pochi benefici e gli effetti collaterali gravi 8, 9. Recentemente, un team giapponese, Ohki et al. , Proposto trapiantare un strato di cellule monostrato di cellule della mucosa orale autologhe nella esophcicatrice ageal. Il trapianto è stato effettuato immediatamente dopo ESD 10, 11. Essi hanno dimostrato l&#39;efficacia di questo approccio innovativo, prima in un modello canino e poi nei pazienti. le cellule derivate dal tessuto adiposo stromali (ADSCs) sono promettenti nella medicina rigenerativa. La loro applicazione in diversi settori ha mostrato risultati interessanti, soprattutto nel processo di guarigione. Terapia ADSC offre diversi vantaggi, in quanto le cellule sono facilmente isolati e sono associati con proprietà anti-infiammatorie, effetti immunomodulanti locali, induzione neovascolarizzazione, e capacità di differenziazione in mesenchimali e linee non mesenchimali 12, 13, 14. In uno studio precedente, la nostra squadra ha dimostrato l&#39;efficacia del doppio trapianto endoscopica ADSC fogli per prev stenosi esofageaenzione dopo ESD prolungato in un modello di suini 15. In questo articolo, vengono presentati i rapporti di costruzione ADSC fogli e la tecnica di trapianto endoscopico.

<table><tbody><tr><td>Cappuccio endoscopico trasparente Q180 compatibile</td><td>Olympus Optical Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIF-Q180 gastroscopio&nbsp;</td>Sistema di videoscopio <td>ottico Olympus Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exera II&nbsp;</td>Ago per iniezione <td>Olympus Optical Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 G</td><td>Olympus Optical Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettrobisturi ERBE ICC 350&nbsp;</td><td>ERBE Tecnologia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indigo carmin 1%</td><td>Life</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coltello ibrido endoscopico</td><td>Life</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minisonde Z pCLE sonda verde</td><td>Mauna Kea Tecnologia</td><td></td><td>Devi imparare a usare la sonda. La manipolazione potrebbe essere difficile.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12105C</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T146</td><td></td></tr><tr><td>Alpha terreno essenziale minimo</td><td>Thermo Fisher</td><td>22561-021</td><td></td></tr><tr><td>Soluzioni saline tamponate con fosfato</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PKH67 kit colorante</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Mini67-KT</td><td></td></tr><tr><td>12 pozzetti cellula sensibile alla temperatura piatto di coltura</td><td>Upcell Thermo Scientific</td><td>174900</td><td>Sentire il peso con 4 ml di coltura media standard 30 minuti prima di seminare le cellule</td></tr><tr><td>Esomeprazolo 40 mg&nbsp;</td><td>Biogaran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moprhine solfato 50 mg/mL</td><td>Lavoisier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amoxicillina 1 g</td><td>Biogaran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 250 mg/5 mL</td><td>Panpharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propofol 10 mg/mL</td><td>Fresenius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta idrofobica</td><td>Carrefour</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adsc fogli trapianto per prevenire stenosi dopo esteso esofagea endoscopica della sottomucosa dissezione

ADSC-sheet Transplantation to Prevent Stricture after Extended Esophageal Endoscopic Submucosal Dissection

Negli anni passati, il costrutto cellule-foglio ha stimolato grande interesse nella medicina rigenerativa, in particolare per le procedure di chirurgia ricostruttiva. Lo sviluppo di tecnologie diversificate, che conciliano cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ADSCs) con vari biomateriali ha portato alla costruzione di numerosi tipi di sostituti tissutale, come le ossa, cartilagine e tessuto adiposo da roditore, suina o ADSCs umane. Esteso esofageo dissezione sottomucosa endoscopica (ESD) è responsabile della formazione di stenosi esofagea. prevenzione della stenosi rimane impegnativo, con trattamenti efficaci disponibili. Precedenti studi hanno riportato l&#39;efficacia del trapianto di cellule fogli mucosa in un modello canino e nell&#39;uomo. ADSCs vengono attribuite proprietà anti-infiammatorie, effetti di modulazione immunitaria locale, induzione neovascolarizzazione, e capacità di differenziazione in mesenchimali e lignaggi non mesenchimali. Questo studio originale descrive TRA endoscopicansplantation di un costrutto tissutale ADSC per evitare stenosi esofagea in un modello suina. Il costrutto ADSC era composto da due fogli ADSC allogeniche a strati l&#39;uno sull&#39;altro su una membrana di supporto cartaceo. Le ADSCs sono stati etichettati con il fluoroforo PKH67 per consentire sonda-based endomicroscopy laser confocale monitoraggio (PCle). Il giorno del trapianto, è stata effettuata una 5-cm e ESD emi-circonferenziale noti per indurre stenosi esofagea. Gli animali sono stati subito endoscopicamente trapiantati con 4 costrutti ADSC. L&#39;adesione completa dei costrutti ADSC stato ottenuto dopo 10 min di applicazione delicata. Gli animali sono stati sacrificati al giorno 28. Tutti gli animali sono stati trapiantati con successo. Il trapianto è stato confermato il giorno 3 con una valutazione PCle positivo. Rispetto agli animali trapiantati, gli animali di controllo hanno sviluppato gravi stenosi, con grande sviluppo del tessuto fibrotico, più frequenti problemi alimentari, e aumento di peso ridotto. Nel nostro modello, il trapianto di allogenic ADSCs, organizzati in fogli doppi cellulari, dopo ESD prolungato ha avuto successo e fortemente associata con un tasso di stenosi esofageo inferiore.

La cultura ADSCs e la procedura per ottenere il foglio ADSC è mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra la costruzione del trapianto, composto da due fogli ADSC livelli reciprocamente sulla loro membrana supporto cartaceo. ADSCs erano stati precedentemente etichettati con il fluoroforo PKH67 per consentire il monitoraggio del trapianto in vivo con PCle. La Figura 3 mostra le varie fasi estesa esofageo dissezione sottomuc...

Questo studio riporta un metodo efficace di endoscopico cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) -sheet trapianto per la prevenzione stenosi esofagea dopo una dissezione endoscopica della sottomucosa prolungato (ESD) in un modello suina.

ADSC fogli trapianto per prevenire stenosi dopo esteso esofagea endoscopica della sottomucosa dissezione

In past years, the cell-sheet construct has spurred wide interest in regenerative medicine, especially for reconstructive surgery procedures. The ...

Nella pratica clinica, l'insorgenza di stenosi esofagea è una delle principali limitazioni per la resezione endoscopica estesa della neoplasia esofagea superficiale. Questo video presenta una tecnica di trapianto su foglio ADSC che previene tali stenosi, rendendo possibile una resezione endoscopica estesa in un modello suino. Questo metodo può avanzare una questione chiave nel campo della prevenzione della stenosi esofagea dopo resezione endoscopica estesa.Il vantaggio principale di questa tecnica è che il trapianto endoscopico di foglio ADSC è significativo, efficace e non richiede tempo per prevenire tale stenosi esofagea. A dimostrare questa procedura saremo Gabriel Rahmi, un medico del mio laboratorio, e io. Raccogli circa 24 milioni di ADSC per suino utilizzando le procedure standard di espansione cellulare e i matracci di coltura T150.Raccogliere le ADSC utilizzando 10 millilitri di soluzione standard di tripsina per pallone. Quindi, contare le cellule utilizzando un citometro automatico. Caricare 1,5 milioni di cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti sensibile alla temperatura.Ora, rabboccare ogni pozzetto fino a quattro millilitri con terreno di coltura. Quindi, incubare le piastre per 12 ore durante la notte per il trapianto il giorno successivo. Il giorno del trapianto, staccare i fogli cellulari confluenti nei pozzetti della piastra incubandoli a temperatura ambiente per 30 minuti.Dopo mezz'ora, pipettare delicatamente un foglio ADSC e sovrapporlo su una carta idrofoba di 1,5 centimetri di diametro all'interno di un piatto di plastica. Usa questa carta come membrana di supporto. Avere pazienza e prestare attenzione quando si maneggiano i fogli ADSC.Sono molto fragili. Quindi, afferra un foglio ADSC e sovrapponilo delicatamente a un altro per creare una struttura a doppio strato. Crea quattro costrutti a doppio strato per animale.In anestesia generale, eseguire un'ESD sul maiale. Utilizzare un videogastroscopio e un'unità di elettrobisturi. In primo luogo, utilizzando un coltello endoscopico con coagulazione morbida, creare segni bianchi emicirconferenziali da 40 a 45 centimetri dorsali dall'arcata dentale per creare una lesione virtuale.Quindi, separare lo strato mucoso dallo strato muscolare iniettando una soluzione di glicerolo contenente colorante indaco carminio nello strato sottomucoso. Ora, praticare un'incisione circonferenziale dello strato mucoso attorno ai segni dorsali, utilizzando un coltello endoscopico con modalità di coagulazione forzata. Successivamente, eseguire la dissezione sottomucosa dall'incisione prossimale all'incisione distale.Quindi, completare la resezione mediante ESD, una cicatrice esofagea emicirconferenziale lunga cinque centimetri che espone lo strato muscolare. Ora, trapiantare endoscopicamente i quattro costrutti di fogli ADSC doppi. Afferrare il costrutto con una pinza endoscopica e coprirlo con un grande cappuccio endoscopico trasparente per proteggerlo durante il trasporto al sito della ferita.Quindi, stendere l'intera superficie del foglio ADSC sul letto dell'ulcera. Mantenere l'innesto in posizione per 10 minuti per garantire un attecchimento completo e stabile. Continuare ad applicare i fogli ADSC in modo che i quattro coprano circa la metà dell'area ferita.Il trasporto può essere difficile in un animale in anestesia generale che respira e deglutisce, quindi fai molta attenzione per evitare di danneggiare le lenzuola. Dopo aver eseguito la procedura descritta su diversi animali, tre giorni dopo è stata condotta una valutazione PCLE. I risultati positivi hanno confermato il successo dei trapianti.Il periodo di follow-up ha consentito un'analisi multimodale. Rispetto agli animali di controllo, il gruppo di animali trapiantati ha mostrato problemi alimentari meno frequenti e un maggiore aumento di peso il giorno 28. I risultati endoscopici e radiologici alla fine del periodo di follow-up hanno portato alla luce un animale del gruppo trapiantato che ha sviluppato una grave stenosi esofagea.L'analisi istologica ha dimostrato che, rispetto agli animali trapiantati, gli animali di controllo hanno sviluppato un significativo tessuto fibrotico. Dimostriamo che un'ESD seguita da un trapianto di foglio ADSC può essere eseguita in circa un'ora e mezza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i fogli ADSC sono fragili e devono essere manipolati con cautela.La chiave del successo è prendersi il tempo necessario per ogni fase della procedura. Dopo l'esposizione, questa tecnica apre la strada alla ricerca che mostra il campo della terapia cellulare per trattare endoscopicamente altre malattie digestive.

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