Name: Vasodilatazione dei vasi isolati e lisolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri l'isolamento della matrice extracellulare cardiaca e la vasodilatazione ex vivo nei topi tight-skin per studiare gli effetti del peptide inibitorio IRF5 sulla progressione della malattia cardiovascolare.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) e HL-102836 (KAP) e Cimphoni Life Sciences (parte dello stipendio DW). Gli autori ringraziano Meghann Sytsma per l'editing del manoscritto.

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<li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;obiettivo era quello di progettare un inibitore IRF5 per chiarire il ruolo di IRF5 sulla infiammazione, la fibrosi e la funzione vascolare nei cuori di Tsk / + topi. I risultati sono che IRF5D non ha indotto la proliferazione o l&#39;apoptosi. Inoltre, l&#39;infiammazione si è ridotta e la funzione vascolare migliorata. Questi dati suggeriscono che IRF5 svolge un importante ruolo meccanicistica nello sviluppo di infiammazione e fibrosi nel cuore di Tsk / + topi e che ha il potenziale per servire come un obiettivo ...

<html> Regolazione della crescita cellulare e la morte cellulare risposte immunitarie è fondamentale per il ruolo del fattore di trascrizione famiglia di fattori regolatori interferone. IRF5 è evidenziato come cruciale per la regolazione delle risposte immunitarie tra il tipo 1, una risposta infiammatoria promuovendo e di tipo 2, una riparazione dei tessuti risposta immunitaria targeting. IRF5 è fondamentale nel cancro 1, e l&#39;autoimmunità 2, 3, 4, 5. Il mouse tight-pelle (Tsk / +) è un modello per la fibrosi dei tessuti e la sclerodermia a causa di una mutazione duplicazione nel fibrillin-1 gene. Questa mutazione si traduce in una stretta-pelle e un aumento del tessuto connettivo. Questi topi sviluppano infiammazione del miocardio, fibrosi e infine insufficienza cardiaca 5, 6, 7,&gt; 8, 9. La sclerodermia è una malattia fibrotica autoimmune che colpisce circa 150.000 pazienti negli Stati Uniti 6. Le caratteristiche di questa malattia sono la fibrosi degli organi interni compreso il cuore 7, 8, 9, 10, 11. La natura dello studio richiedeva la progettazione di un peptide inibitorio. L&#39;approccio software è stato scelto per un approccio tradizionale utilizzando un phage display. L&#39;approccio è il più semplice e meno che richiede tempo. La banca dati RCSB viene utilizzato per identificare opportuni siti di legame 12. Per studiare l&#39;interazione del peptide di nuova concezione con la proteina ricombinante e di concentrarsi sui parametri di legame, è stata utilizzata una tecnica chiamata interferometria biolayer. Biolayer interferometria è un biosensore basato technique che determina affinità di legame, di associazione e dissociazione utilizzando un biosensore e un campione vincolante. Il biosensore può essere fluorescente, luminescently, radiometricamente e colorimetricamente etichettato. La misura si basa sulla aggiunta di massa o l&#39;esaurimento simile associazione e dissociazione 13, 14. Lo scopo di questo studio è stato quello di comprendere il ruolo di IRF5 in infiammazione del miocardio e fibrosi. L&#39;obiettivo era quello di ottenere una conoscenza approfondita del ruolo della IRF5 nello sviluppo della fibrosi dei tessuti e la sclerodermia.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 marcato con anticorpo IgG di capra anti-topo&nbsp;</td><td>Reagente Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensori</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspasi-3/7 Substrato</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Kit di test sulla proliferazione cellulare</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindo)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>Diluizione 1:1.000 in PBS</td></tr><tr><td>asino anti ratto Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>Diluizione 1:1.000 in PBS</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Dopo molti tentativi ed errori, siamo tornati a questo</td></tr><tr><td>microscopio Eclipse TE 200-U con software di scansione laser EZ C1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capra anti coniglio Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Diluizione 1:1.000 in PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-capra</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10.000 diluizione in TBS</td></tr><tr><td>HRP asino anti-topo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>Diluizione 1:10.000 in TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1 anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>Diluizione 1:200 in anticorpo PBS</td></tr><tr><td>IRF5 (H56)</td><td>Santa Cruz Biotecnologie</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Micro lettore di piastre Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP marcatore neutrofilo</td><td>Santa Cruz</td><td>Biotechnologies sc-133821</td><td>Diluizione 1:200 in PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>legame proteina-proteina</td></tr><tr><td>Design del peptide&nbsp; Software Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sintesi proteica IRF5 ricombinante</td><td>TopGene Technologies Espressione</td><td></td><td>proteica, servizio di sintesi</td></tr><tr><td>sodio dodecil fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Farmacia</td><td></td><td>Tabella III sostanza controllata, prescrizione richiesta&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Stereomicroscopio zoom da dissezione trinoculare con luci a LED a collo d'oca</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endoteliale Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contiene supplemets per la crescita</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatazione dei vasi isolati e l&#39;isolamento della matrice extracellulare di topi tight-pelle

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Il fattore regolatore dell'interferone 5 (IRF5) è fondamentale per le cellule per determinare se rispondono in modo pro-infiammatorio o anti-infiammatorio. La capacità di IRF5 di passare le cellule da un percorso all'altro è molto interessante come bersaglio terapeutico. Abbiamo progettato un peptide esca IRF5D con un software di modellazione molecolare per la progettazione di piccole molecole e peptidi.
IRF5D ha inibito IRF5, ridotto le alterazioni nella matrice extracellulare e migliorato la vasodilatazione endoteliale nel topo a pelle stretta (Tsk/+). Il Kd di IRF5D per IRF5 ricombinante è 3,72 ± 0,74 x 10-6 M come determinato da esperimenti di legame utilizzando esperimenti di interferometria a biostrato. La proliferazione e l'apoptosi delle cellule endoteliali (EC) sono rimaste invariate utilizzando concentrazioni crescenti di IRF5D (da 0 a 100 μg/mL, 24 ore). I topi Tsk/+ sono stati trattati con IRF5D (1 mg/kg/die per via sottocutanea, 21 giorni). Le espressioni di IRF5 e ICAM sono diminuite dopo il trattamento con IRF5D. La funzione endoteliale è stata migliorata, come valutato dalla vasodilatazione delle arterie facciali di topi Tsk/+ trattati con IRF5D rispetto ai topi Tsk/+ senza trattamento con IRF5D. Come fattore di trascrizione, IRF5 passa dal citosol al nucleo. La traslocazione è stata valutata mediante immunoistochimica su miociti cardiaci coltivati sulle diverse matrici extracellulari cardiache. Il trattamento con IRF5D del topo Tsk/+ ha portato a una riduzione del numero di nuclei IRF5 positivi rispetto agli animali senza trattamento con IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Questi risultati dimostrano l'importante ruolo che IRF5 svolge nell'infiammazione e nella fibrosi nei topi Tsk/+.

I risultati hanno dimostrato nella figura 1 mostrano come progettare un peptide. Figura 1, in alto a sinistra, mostra la regione (tra le 2 frecce gialle, aminoacidi (aa) 425-436) in IRF5 che viene fosforilato da un certo numero di chinasi. Figura 1, in alto a destra, mostra una forma ovale di colore giallo dove dominio fosforilata di IRF5 lega. La struttura dimerica del 3DSH è stato ruotato di osservare una fessura o valle a fianco della...

Descriviamo l'isolamento della matrice extracellulare cardiaca da topi di controllo C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5. Descriviamo anche gli studi di vasodilatazione sui vasi isolati da C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5.

Vasodilatazione dei vasi isolati e l&#39;isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

L'obiettivo generale di queste procedure per l'isolamento della matrice extracellulare e la vasodilatazione ex vivo è studiare il trattamento con peptide inibitore di IRF5 nei roditori. Questo metodo può aiutare a comprendere in che modo i cambiamenti nella matrice extracellulare possano potenziare o attenuare il decorso della malattia. Il principale vantaggio degli studi di vasodilatazione consiste nel fornire un'analisi dei processi in vivo senza dover considerare tutti i componenti del segnale.L'isolamento della matrice extracellulare cardiaca può essere applicato ad altri organi come l'arto posteriore o il polmone. Abbiamo avuto questa idea per la prima volta quando abbiamo iniziato a concentrarci sulla duplicazione della fibrillina uno nel topo dal tessuto connettivo rigido, riconoscendo l'impatto di una matrice extracellulare alterata sul comportamento cellulare. Dopo aver anestetizzato il topo e averlo preparato per l'intervento chirurgico, aprire la cute utilizzando un paio di forbici.Tagliare dal torace lateralmente fino alla mascella, con attenzione a non disturbare i tessuti sottostanti nella parte anteriore della mandibola. Quindi dissezionare l'arteria fascialis rimuov

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Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l'espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles

Questo manoscritto descrive un semplice protocollo per l'isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi myography elettrofisiologici, imaging e pressione del calcio.

Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo

Qui, presentiamo un protocollo per un saggio in vitro graffio utilizzando fibroblasti primari e per un saggio di guarigione della ferita della pelle in vivo nei topi. Entrambi i test sono metodi semplici per valutare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo.

Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite

La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Scopri l'isolamento della matrice extracellulare cardiaca e la vasodilatazione ex vivo nei topi tight-skin per studiare gli effetti del peptide inibitorio IRF5 sulla progressione della malattia cardiovascolare.

Vasodilatazione dei vasi isolati e l'isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle

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