Name: Vasodilatazione dei vasi isolati e lisolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri l'isolamento della matrice extracellulare cardiaca e la vasodilatazione ex vivo nei topi tight-skin per studiare gli effetti del peptide inibitorio IRF5 sulla progressione della malattia cardiovascolare.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) e HL-102836 (KAP) e Cimphoni Life Sciences (parte dello stipendio DW). Gli autori ringraziano Meghann Sytsma per l'editing del manoscritto.

<ol><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+expression+in+human+ductal+carcinoma+correlates+with+disease+stage+and+contributes+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).</li>
<li>Dideberg, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insertion-deletion+polymorphism+in+the+interferon+regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+gene+confers+risk+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases.</a> Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).</li>
<li>Graham, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+regulates+splicing+and+expression+and+is+associated+with+increased+risk+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Genet%22%5BJournal%5D)">A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus.</a> Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).</li>
<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
<li>Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+in+human+autoimmunity+and+murine+models+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease.</a> Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).</li>
<li>Mayes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochip+analysis+identifies+multiple+susceptibility+Loci+for+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).</li>
<li>Dimitroulas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-and+Macrovascular+Treatment+Targets+in+Scleroderma+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease.</a> Curr Pharm Des. , (2013).</li>
<li>Botstein, G. R., LeRoy, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+heart+disease+in+systemic+sclerosis+%28scleroderma%29%3A+advances+in+clinical+and+pathologic+features%2C+pathogenesis%2C+and+new+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches.</a> Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).</li>
<li>Oram, S., Stokes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+scleroderma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Heart+J%22%5BJournal%5D)">The heart in scleroderma.</a> Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4F+decreases+IRF5+expression+and+activation+in+hearts+of+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice.</a> PLoS One. 7 (12), 52046(2012).</li>
<li>Steen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Rheumatol.Rep%22%5BJournal%5D)">The heart in systemic sclerosis.</a> Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).</li>
<li>Deshpande, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCSB+Protein+Data+Bank%3A+a+redesigned+query+system+and+relational+database+based+on+the+mmCIF+schema%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema.</a> Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).</li>
<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+biolayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Matthew, A. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/drug-discovery/p97058-current-biosensor-technologies-in-drug-discovery-summer-06.html">Current biosensor technologies in drug discovery.</a> Drug Discovery. , 69(2006).</li>
<li>Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+MED-SuMo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">A review of MED-SuMo applications.</a> Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).</li>
<li>Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mucosal+immunization+of+recombinant+adenovirus-based+vaccine+expressing+F1+protein+fragment+induces+protective+mucosal+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Titration+Series+with+Biolayer+Interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry.</a> PloS one. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
<li>Hoogenboom, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+phage+display+technology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibody phage display technology and its applications.</a> Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).</li>
<li>Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+colorimetric+assay+for+cell+proliferation+and+viability+utilizing+the+tetrazolium+salt+XTT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT.</a> J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).</li>
<li>Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C+5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C+5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
<li>Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoy%2C+S+%22Autoimmune+Disorders+-+Pathogenetic+Aspects%22">Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects</a>. Mavragani, C. , 35(2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;obiettivo era quello di progettare un inibitore IRF5 per chiarire il ruolo di IRF5 sulla infiammazione, la fibrosi e la funzione vascolare nei cuori di Tsk / + topi. I risultati sono che IRF5D non ha indotto la proliferazione o l&#39;apoptosi. Inoltre, l&#39;infiammazione si è ridotta e la funzione vascolare migliorata. Questi dati suggeriscono che IRF5 svolge un importante ruolo meccanicistica nello sviluppo di infiammazione e fibrosi nel cuore di Tsk / + topi e che ha il potenziale per servire come un obiettivo ...

<html> Regolazione della crescita cellulare e la morte cellulare risposte immunitarie è fondamentale per il ruolo del fattore di trascrizione famiglia di fattori regolatori interferone. IRF5 è evidenziato come cruciale per la regolazione delle risposte immunitarie tra il tipo 1, una risposta infiammatoria promuovendo e di tipo 2, una riparazione dei tessuti risposta immunitaria targeting. IRF5 è fondamentale nel cancro 1, e l&#39;autoimmunità 2, 3, 4, 5. Il mouse tight-pelle (Tsk / +) è un modello per la fibrosi dei tessuti e la sclerodermia a causa di una mutazione duplicazione nel fibrillin-1 gene. Questa mutazione si traduce in una stretta-pelle e un aumento del tessuto connettivo. Questi topi sviluppano infiammazione del miocardio, fibrosi e infine insufficienza cardiaca 5, 6, 7,&gt; 8, 9. La sclerodermia è una malattia fibrotica autoimmune che colpisce circa 150.000 pazienti negli Stati Uniti 6. Le caratteristiche di questa malattia sono la fibrosi degli organi interni compreso il cuore 7, 8, 9, 10, 11. La natura dello studio richiedeva la progettazione di un peptide inibitorio. L&#39;approccio software è stato scelto per un approccio tradizionale utilizzando un phage display. L&#39;approccio è il più semplice e meno che richiede tempo. La banca dati RCSB viene utilizzato per identificare opportuni siti di legame 12. Per studiare l&#39;interazione del peptide di nuova concezione con la proteina ricombinante e di concentrarsi sui parametri di legame, è stata utilizzata una tecnica chiamata interferometria biolayer. Biolayer interferometria è un biosensore basato technique che determina affinità di legame, di associazione e dissociazione utilizzando un biosensore e un campione vincolante. Il biosensore può essere fluorescente, luminescently, radiometricamente e colorimetricamente etichettato. La misura si basa sulla aggiunta di massa o l&#39;esaurimento simile associazione e dissociazione 13, 14. Lo scopo di questo studio è stato quello di comprendere il ruolo di IRF5 in infiammazione del miocardio e fibrosi. L&#39;obiettivo era quello di ottenere una conoscenza approfondita del ruolo della IRF5 nello sviluppo della fibrosi dei tessuti e la sclerodermia.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 marcato con anticorpo IgG di capra anti-topo&nbsp;</td><td>Reagente Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensori</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspasi-3/7 Substrato</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Kit di test sulla proliferazione cellulare</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindo)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>Diluizione 1:1.000 in PBS</td></tr><tr><td>asino anti ratto Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>Diluizione 1:1.000 in PBS</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Dopo molti tentativi ed errori, siamo tornati a questo</td></tr><tr><td>microscopio Eclipse TE 200-U con software di scansione laser EZ C1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capra anti coniglio Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Diluizione 1:1.000 in PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-capra</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10.000 diluizione in TBS</td></tr><tr><td>HRP asino anti-topo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>Diluizione 1:10.000 in TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1 anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>Diluizione 1:200 in anticorpo PBS</td></tr><tr><td>IRF5 (H56)</td><td>Santa Cruz Biotecnologie</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Micro lettore di piastre Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP marcatore neutrofilo</td><td>Santa Cruz</td><td>Biotechnologies sc-133821</td><td>Diluizione 1:200 in PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>legame proteina-proteina</td></tr><tr><td>Design del peptide&nbsp; Software Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sintesi proteica IRF5 ricombinante</td><td>TopGene Technologies Espressione</td><td></td><td>proteica, servizio di sintesi</td></tr><tr><td>sodio dodecil fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Farmacia</td><td></td><td>Tabella III sostanza controllata, prescrizione richiesta&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Stereomicroscopio zoom da dissezione trinoculare con luci a LED a collo d'oca</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endoteliale Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contiene supplemets per la crescita</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatazione dei vasi isolati e l&#39;isolamento della matrice extracellulare di topi tight-pelle

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Il fattore regolatore dell'interferone 5 (IRF5) è fondamentale per le cellule per determinare se rispondono in modo pro-infiammatorio o anti-infiammatorio. La capacità di IRF5 di passare le cellule da un percorso all'altro è molto interessante come bersaglio terapeutico. Abbiamo progettato un peptide esca IRF5D con un software di modellazione molecolare per la progettazione di piccole molecole e peptidi.
IRF5D ha inibito IRF5, ridotto le alterazioni nella matrice extracellulare e migliorato la vasodilatazione endoteliale nel topo a pelle stretta (Tsk/+). Il Kd di IRF5D per IRF5 ricombinante è 3,72 ± 0,74 x 10-6 M come determinato da esperimenti di legame utilizzando esperimenti di interferometria a biostrato. La proliferazione e l'apoptosi delle cellule endoteliali (EC) sono rimaste invariate utilizzando concentrazioni crescenti di IRF5D (da 0 a 100 μg/mL, 24 ore). I topi Tsk/+ sono stati trattati con IRF5D (1 mg/kg/die per via sottocutanea, 21 giorni). Le espressioni di IRF5 e ICAM sono diminuite dopo il trattamento con IRF5D. La funzione endoteliale è stata migliorata, come valutato dalla vasodilatazione delle arterie facciali di topi Tsk/+ trattati con IRF5D rispetto ai topi Tsk/+ senza trattamento con IRF5D. Come fattore di trascrizione, IRF5 passa dal citosol al nucleo. La traslocazione è stata valutata mediante immunoistochimica su miociti cardiaci coltivati sulle diverse matrici extracellulari cardiache. Il trattamento con IRF5D del topo Tsk/+ ha portato a una riduzione del numero di nuclei IRF5 positivi rispetto agli animali senza trattamento con IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Questi risultati dimostrano l'importante ruolo che IRF5 svolge nell'infiammazione e nella fibrosi nei topi Tsk/+.

I risultati hanno dimostrato nella figura 1 mostrano come progettare un peptide. Figura 1, in alto a sinistra, mostra la regione (tra le 2 frecce gialle, aminoacidi (aa) 425-436) in IRF5 che viene fosforilato da un certo numero di chinasi. Figura 1, in alto a destra, mostra una forma ovale di colore giallo dove dominio fosforilata di IRF5 lega. La struttura dimerica del 3DSH è stato ruotato di osservare una fessura o valle a fianco della...

Descriviamo l'isolamento della matrice extracellulare cardiaca da topi di controllo C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5. Descriviamo anche gli studi di vasodilatazione sui vasi isolati da C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5.

Vasodilatazione dei vasi isolati e l&#39;isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

L'obiettivo generale di queste procedure per l'isolamento della matrice extracellulare e la vasodilatazione ex vivo è studiare il trattamento con peptide inibitore di IRF5 nei roditori. Questo metodo può aiutare a comprendere in che modo i cambiamenti nella matrice extracellulare possano potenziare o attenuare il decorso della malattia. Il principale vantaggio degli studi di vasodilatazione consiste nel fornire un'analisi dei processi in vivo senza dover considerare tutti i componenti del segnale.L'isolamento della matrice extracellulare cardiaca può essere applicato ad altri organi come l'arto posteriore o il polmone. Abbiamo avuto questa idea per la prima volta quando abbiamo iniziato a concentrarci sulla duplicazione della fibrillina uno nel topo dal tessuto connettivo rigido, riconoscendo l'impatto di una matrice extracellulare alterata sul comportamento cellulare. Dopo aver anestetizzato il topo e averlo preparato per l'intervento chirurgico, aprire la cute utilizzando un paio di forbici.Tagliare dal torace lateralmente fino alla mascella, con attenzione a non disturbare i tessuti sottostanti nella parte anteriore della mandibola. Quindi dissezionare l'arteria fascialis rimuovendo i tessuti molli circostanti. Durante questa operazione, prestare attenzione a non danneggiare l'arteria.Immergere il tessuto esposto nel buffer MOPS affinché rimanga sano. Una volta completamente esposta l'arteria fasciale, afferrare l'arteria fasciale in prossimità della porzione prossimale della prima biforcazione distale rispetto al punto in cui l'arteria verrà recisa. Quindi, reciderla dall'arteria principale ed afferrare l'arteria fasciale con la pinzetta.Recidere i due rami che si diramano dal fascialis, quindi sollevare delicatamente il vaso recidendo i collegamenti con i tessuti circostanti fino a raggiungere la biforcazione. Alla biforcazione, recidere entrambe le arterie figlie per liberare il vaso e trasferirlo in una capsula contenente tampone mops, dove rimarrà idratato fino al momento dell'utilizzo. Per misurare la vasodilatazione, prepararsi innanzitutto a cannuccare i vasi.Caricare le pipette di vetro con un diametro terminale compreso tra 125 e 175 micron con tampone mops. Riempire anche i serbatoi della soluzione con mops. Procedere ora alla cannullazione dei vasi isolati.Legarli a pipette di vetro utilizzando sutura oftalmica. Assicurarsi di prevenire la formazione di bolle d'aria nelle pipette. Successivamente, montare le camere per vasi su un microscopio invertito dotato di videocamera.Eseguire il video attraverso il sistema di misurazione con calibro video per ottenere una misurazione su schermo dei vasi. Ora pressurizzare i vasi utilizzando un processo in due fasi. Innanzitutto, sollevare i serbatoi riempiti di mop ad un'altezza tale da generare una pressione di 20 millimetri di mercurio.Aprire il circuito con lo straccio verso il vaso. Mentre il vaso si pressurizza, verificare la presenza di perdite intorno ai legacci e lungo tutta la lunghezza del vaso. Se non vengono rilevate perdite, sollevare i serbatoi per generare una pressione di 60 millimetri di mercurio.Quindi ispezionare nuovamente i vasi per verificare la presenza di perdite. Una volta che la pressione è stata mantenuta senza perdite, equilibrare il vaso per 30 minuti a questa pressione. Dopo l'equilibrazione, misurare la vasodilatazione in risposta a un composto di interesse.Prima di tutto, restringere il vaso di metà fino a tre quarti aggiungendo U46619. Lasciare che la soluzione bagni i vasi per sei minuti per stabilizzarli. Successivamente, aggiungere gradualmente il composto in esame alla soluzione del bagno, ad esempio acetilcolina.Ogni due minuti, aumentare la concentrazione della soluzione di prova nel bagno di 10, partendo da 0,00001 molare e arrivando fino a 0,01 molare. I cambiamenti nella vasodilatazione hanno sollevato interrogativi riguardo al segnale. Ma il nostro focus è sul cuore.Per ridurre l'uso di animali, abbiamo scelto di isolare la matrice extracellulare cardiaca per concentrarci sui segnali provenienti dall'esterno. Iniziare prelevando il cuore da un topo anestetizzato. Trasferirlo in un becher contenente 15 millilitri di solfato di sodio dodecilsolfato ipertonico all'uno per cento.Mantenere la soluzione in leggera agitazione su un agitatore magnetico a temperatura ambiente per 18 ore. Il giorno successivo, sostituire la soluzione con 15 millilitri di Triton X100 al 5% per 30 minuti, seguiti da 15 millilitri di PBS per 15 minuti. Successivamente, congelare rapidamente la matrice extracellulare (ECM) e l'azoto liquido in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.Dopo il congelamento, trasferire il tessuto in un mortaio e pestello preraffreddati e macinarlo fino a ottenere una polvere. Sospendere la polvere in PBS con antibiotico aggiunto alla concentrazione 1:100 in una soluzione viscosa. Sottoporre la sospensione a sonicazione per 30-60 secondi in bagno di ghiaccio a intensità elevata.La proteina della matrice extracellulare è ora isolata e deve rimanere fredda. Prima di utilizzare la proteina, misurarne la concentrazione mediante saggio di Bradford. Il peptide IRF5D è un peptide inibitorio che differisce notevolmente dall'IRF5 normale.IRF5D è composto da soli 17 aminoacidi e si lega al sito di fosforilazione di IRF5. Questo impedisce la fosforilazione e l'omodimerizzazione, interferendo così con la formazione dello stato attivo di IRF5. Topi eterozigoti con pelle stretta sono stati trattati con IRF5D per via sottocutanea per tre settimane.Il numero di neutrofili e di CD64 è risultato diminuito, come determinato mediante immunohistochemia, nel numero medio di cellule colorate per campo microscopico. I trattamenti con IRF5D hanno migliorato la vasodilatazione indotta dall'acetilcolina nelle arterie fascialis di topi eterozigoti con pelle rigida trattati con IRF5D, rispetto a quelli trattati con tampone fosfato. In miociti coltivati derivati dal tessuto cardiaco di topi transgenici, erano presenti un numero maggiore di cellule positive per IRF5 nelle colture provenienti da topi eterozigoti con pelle rigida rispetto ai topi di controllo.Il trattamento di una delle colture con IRF5D ha determinato una riduzione dei nuclei positivi per IRF5. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come decellularizzare un cuore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere trasposta a molti organi e aiutare a rispondere a una varietà di domande. E ricordare che è importante non digerire eccessivamente la matrice.È necessario inoltre avere una buona conoscenza delle tecniche per dissezionare e posizionare l'arteria fascialis. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica richiede circa 60 minuti ed è applicabile pressoché a qualsiasi letto vascolare. È fondamentale ricordare quanto sia fragile l'endotelio; pertanto, procedere con cautela durante la dissezione.Non è raro osservare un muscolo liscio sano e un endotelio danneggiato.

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