Vasodilatazione dei vasi isolati e l'isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle
24 marzo 2017
Descriviamo l'isolamento della matrice extracellulare cardiaca da topi di controllo C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5. Descriviamo anche gli studi di vasodilatazione sui vasi isolati da C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5.
L'obiettivo generale di queste procedure per l'isolamento della matrice extracellulare e la vasodilatazione ex vivo è quello di studiare il trattamento con peptidi inibitori IRF5 nei roditori. Questo metodo può aiutare a rispondere a come i cambiamenti nella matrice extracellulare possono aumentare o attenuare la progressione della malattia. Il vantaggio principale degli studi di vasodilatazione è quello di darci un'idea dei processi in vivo senza dover prendere in considerazione tutti i componenti di segnalazione.
L'isolamento della matrice extracellulare cardiaca può essere applicato ad altri organi come gli arti posteriori o il polmone. Abbiamo avuto l'idea per la prima volta quando abbiamo iniziato a concentrarci sulla duplicazione della fibrillina uno nel topo con pelle tesa e abbiamo riconosciuto l'impatto della matrice extracellulare alterata e del comportamento cellulare. Dopo aver anestetizzato il topo e averlo preparato per l'intervento chirurgico, aprire la pelle utilizzando un paio di forbici.
Tagliare dal torace al lato dell'osso mascellare con cura per non disturbare il tessuto sottostante verso la parte anteriore della mascella. Quindi sezionare l'arteria fasciale rimuovendo il tessuto molle che la circonda. Mentre lo fai, fai attenzione a non danneggiare l'arteria.
Bagnare il tessuto esposto in un tampone per mop in modo che rimangano sani. Una volta che l'arteria fasciale è stata completamente esposta, afferrare la fascia prossimale alla prima biforcazione distale fino al punto in cui verrà tagliata l'arteria. Quindi, taglialo via dall'arteria madre e afferra l'arteria fasciale con il forcipe.
Tagliare i due rami che si staccano dalla fasciale e quindi sollevare delicatamente il vaso recidendo le connessioni con il tessuto circostante fino a raggiungere la biforcazione. Alla biforcazione, tagliare entrambe le arterie figlie per liberare il vaso e trasferirlo in un piatto di tampone per mop dove rimarrà idratato fino al momento del bisogno. Per misurare la vasodilatazione, prepararsi prima a incannulare i vasi.
Caricare pipette di vetro con un diametro terminale da 125 a 175 micron piene di tampone per mop. Riempire anche i serbatoi della soluzione con mop. Ora incannulare i vasi isolati.
Legarli su pipette di vetro utilizzando la sutura oftalmica. Assicurarsi di evitare la formazione di bolle d'aria nelle pipette. Quindi, montare le camere del recipiente su un microscopio invertito con l'attacco della videocamera.
Esegui il video attraverso il sistema di misurazione del calibro video per una misurazione su schermo dei recipienti. Ora pressurizzare i recipienti utilizzando un processo in due fasi. Per prima cosa sollevare i serbatoi pieni di mop ad un'altezza sopra il recipiente per 20 millimetri di mercurio di pressione.
Aprire la linea con i mop al recipiente. Mentre il recipiente è pressurizzato, cerca segni di perdite intorno ai lacci e lungo la lunghezza del recipiente. Se non vengono rilevate perdite, sollevare i serbatoi per produrre 60 millimetri di mercurio di pressione.
Quindi ispezionare nuovamente i recipienti per verificare la presenza di perdite. Una volta mantenuta la pressione senza perdite, equilibrare il recipiente per 30 minuti a questa pressione. Dopo essere stato equilibrato, misurare la vasodilatazione in risposta a un composto di interesse.
Per prima cosa restringere la nave da metà a tre quarti aggiungendo U46619. Lasciare che la soluzione bagni i vasi per sei minuti per stabilizzarli. Quindi, aggiungere gradualmente il composto di prova alla soluzione del bagno come l'acetilcolina.
Ogni due minuti, aumentare la concentrazione della soluzione di prova nel bagno di 10 iniziando da 000001 molare e progredendo fino al molare 001. I cambiamenti nella vasodilatazione hanno sollevato domande sulla segnalazione. Ma la nostra attenzione è rivolta al cuore.
Per ridurre l'uso di animali, abbiamo scelto di isolare la matrice extracellulare cardiaca per concentrarci sulla segnalazione avviata dall'esterno. Inizia raccogliendo il cuore da un topo anestetizzato. Trasferiscilo in un becher caricato con 15 millilitri di sodio dodecil solfato ipertonico all'uno per cento.
Conservare la soluzione mescolando delicatamente su una piastra di cottura a temperatura ambiente per 18 ore. Il giorno successivo, cambiare la soluzione con 15 millilitri di tritone X100 al 5% per 30 minuti seguiti da 15 millilitri di PBS per 15 minuti. Quindi congelare a scatto l'ECM e l'azoto liquido in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Una volta congelato, trasferire il fazzoletto in un mortaio e pestello pre-raffreddati e macinarlo in polvere. Sospendere la polvere in PBS con l'aggiunta di antibiotico a una concentrazione di 1:100 in una soluzione viscosa. Sonicare la sospensione per 30-60 secondi in un bagno di ghiaccio a un'impostazione di sonicazione elevata.
La proteina ECM è ora isolata e deve rimanere fredda. Prima di utilizzare la proteina, misurarne la concentrazione utilizzando un saggio di Bradford. Il peptide IRF5D è un peptide inibitorio che differisce notevolmente dal normale IRF5.
IRF5D ha solo 17 amminoacidi e si lega al sito di fosforilazione di IRF5. Ciò impedisce la fosforilazione e l'omodimerizzazione, interferendo così con la formazione dello stato attivo di IRF5. I topi eterozigoti a pelle stretta sono stati trattati con IRF5D per via sottocutanea per tre settimane.
Il numero di neutrofili e CD64 è diminuito come determinato dall'immunoistochimica nel numero medio di cellule colorate per campo visivo. I trattamenti con IRF5D hanno migliorato la vasodilatazione indotta dall'acetilcolina delle arterie fasciali nei topi eterozigoti a pelle stretta trattati con IRF5D rispetto a quelli trattati con tampone fosfato. Nei miociti in coltura derivati dal tessuto cardiaco dei topi transgenici, c'erano più cellule IRF5 positive nelle colture di topi eterozigoti con pelle stretta rispetto ai topi di controllo.
Il trattamento di entrambe le colture con IRF5D ha determinato una riduzione dei nuclei IRF5 positivi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come decellularizzare un cuore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere trasposta a molti organi e aiutare a rispondere a una varietà di domande E ricorda che è importante non digerire eccessivamente la matrice.
Dovresti anche avere una buona comprensione di come sezionare e appendere l'arteria fasciale. Una volta padroneggiata, questa tecnica dovrebbe richiedere circa 60 minuti e può essere utilizzata su quasi tutti i letti vascolari. È importante ricordare quanto sia fragile l'endotelio, procedere con cautela durante la dissezione.
Non è raro avere una muscolatura liscia sana e un endotelio danneggiato.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta l'isolazione della matrice extracellulare cardiaca da diversi modelli murini e i successivi studi sulla vasodilatazione. L'attenzione è rivolta alla comprensione degli effetti del trattamento con un peptide inibitore di IRF5 sulla progressione della malattia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cardiovascolare
- Ricerca sulla matrice extracellulare
Sfondo
- L'isolamento della matrice extracellulare è fondamentale per studiarne il ruolo nelle malattie.
- IRF5 è implicato nel decorso di alcune malattie.
- I topi con pelle stretta mostrano alterazioni nelle proprietà della matrice extracellulare.
- Gli studi sulla vasodilatazione forniscono informazioni sul funzionamento vascolare.
Scopo dello studio
- Isolare la matrice extracellulare cardiaca per ulteriori analisi.
- Valutare l'impatto del peptide inibitore di IRF5 sulle risposte vascolari.
- Comprendere come le alterazioni della matrice extracellulare influenzino la progressione della malattia.
Metodi Utilizzati
- Isolamento della matrice extracellulare cardiaca da modelli murini.
- Studi di vasodilatazione ex vivo su vasi isolati.
- Confronto delle risposte tra topi di controllo e trattati.
- Preparazione chirurgica dei topi per l'isolamento della matrice.
Risultati principali
- Isolamento riuscito della matrice extracellulare cardiaca da diverse linee di topi.
- Le risposte di vasodilatazione hanno mostrato variazioni tra i topi di controllo e quelli trattati con il peptide IRF5.
- Acquisizione di nuove conoscenze sul ruolo della matrice extracellulare nella funzione vascolare.
- Potenziali applicazioni del metodo di isolamento ad altri organi.
Conclusioni
- Lo studio evidenzia l'importanza della matrice extracellulare nella salute cardiovascolare.
- Il trattamento con peptide inibitore di IRF5 mostra potenzialità nel modificare le risposte vascolari.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare le implicazioni per la gestione delle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la riduzione del rischio meccanicistico di IRF5 come bersaglio terapeutico, collegando il rimodellamento della matrice extracellulare alla disfunzione vascolare nella fibrosi infiammatoria. Il saggio di vasodilatazione ex vivo fornisce letture quantitative e riproducibili della funzione endoteliale indipendenti da fattori confondenti sistemici, supportando la validazione del bersaglio in modelli preclinici. L'isolamento della matrice extracellulare rilevante per la malattia facilita lo screening fenotipico e la chiarificazione dei percorsi per la scoperta di farmaci antifibrotici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica secondo cui l'inibizione di IRF5 riduce il segnale pro-infiammatorio e il deposito di matrice extracellulare nei topi con pelle sclerodermica.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale del bersaglio mediante la misurazione della traslocazione nucleare di IRF5 e dell'espressione di ICAM a valle nei miociti cardiaci.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio dimostrando un miglioramento della vasodilatazione endoteliale come biomarcatore funzionale dell'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: La matrice extracellulare cardiaca isolata fornisce un sistema standardizzato e rilevante per la patologia per valutare gli effetti dei composti sul comportamento cellulare e sulle vie di segnalazione.
- Output quantitativo: Le misurazioni es vivo della vasodilatazione mediante curve dose-risposta all'acetilcolina consentono una valutazione precisa della funzione endoteliale in arterie facciali isolate.
- Riutilizzo della piattaforma: Il protocollo di isolamento della matrice extracellulare può essere adattato a letti vascolari di arto posteriore, polmone o di altri organi per supportare la validazione incrociata dei bersagli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Utilizza il modello murino tight-skin, che presenta fibrosi e disfunzione vascolare analoghe a quelle della sclerodermia umana.
- Continuità traslazionale: Collega l'inibizione di IRF5 a una riduzione delle alterazioni della matrice extracellulare e a un miglioramento della vasodilatazione, supportando una de-risking meccanicistica per la traduzione clinica.
- Utilità del modello preclinico: Permette decisioni di avanzamento ponderate sui rischi, dimostrando un miglioramento mediato dal target della funzione vascolare dopo somministrazione sottocutanea cronica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione dell'efficacia preclinica, consentendo la progettazione iterativa di composti modulatori dell'IRF5 basata su fenotipi vascolari e della matrice.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando la matrice extracellulare per studiare la segnalazione dal di fuori verso l'interno che induce l'attivazione di IRF5 e le risposte pro-infiammatorie.
- Screening: Fornisce tessuti vascolari pronti per il saggio con risposte riproducibili di vasodilatazione per valutare la potenza e la selettività dei composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative delle variabili dipendenti (variazioni del diametro del vaso) e risultati statistici (EC50, percentuale di vasodilatazione) per confrontare gli effetti dei trattamenti tra gruppi diversi.
- Ricerca traslazionale: Collega l'interazione con il bersaglio molecolare (riduzione nucleare di IRF5) a esiti a livello tissutale (rimodellamento della matrice extracellulare) e a un miglioramento funzionale (vasodilatazione) in un sistema rilevante per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per lo studio delle interazioni tra matrice extracellulare e sistema vascolare in diversi sistemi organici e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica isolando la funzione vascolare dalle variabili sistemiche, aumentando la fiducia nelle relazioni tra bersaglio e malattia.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di vasodilatazione e di isolamento della matrice extracellulare, migliorando la riproducibilità tra laboratori e consentendo collaborazioni interfunzionali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti correlando l'inibizione del bersaglio a esiti funzionali vascolari, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi antifibrotici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei trattamenti diretti contro IRF5 aggiustata per il rischio, basata sul miglioramento dimostrato della funzione endoteliale e dell'omeostasi della matrice.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione microvascolare, nella miografia a pressione e nella biochimica della matrice extracellulare.
- Si basa su strumentazione specializzata, tra cui sistemi video calibro, microscopi invertiti e serbatoi a pressione per studi di vasodilatazione.
- Necessita di standardizzazione nella manipolazione dei tessuti, nella composizione del buffer (MOPS) e nei protocolli di contrazione (pre-costrizione con U46619) per garantire la comparabilità dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica l'isolamento della matrice extracellulare a tessuti non cardiaci, inclusa l'ottimizzazione dei reagenti per la decellularizzazione (SDS, Triton X-100) e della durata.
- Limite pratico: la fragilità dell'endotelio isolato richiede una tecnica meticolosa per evitare danni meccanici durante il cannulamento e la pressurizzazione del vaso.
