Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fabbricare una serie di nano-cluster proteici in un doppio strato lipidico supportato, compatibile con le tecniche di microscopia di superficie sensibile per applicazioni di biologia cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biofisica cellulare, in particolare, su come il nano-clustering dei ligandi influenzi l'attivazione e l'adesione delle cellule T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facilmente riproducibile nei laboratori biofisici standard ed è compatibile con le tecniche avanzate di microscopia sensibile alla superficie, come TIRF e RICM.

Sebbene questa tecnica sia progettata per fornire informazioni sull'immunologia, può essere applicata ad altri tipi di cellule con potenziali applicazioni in biologia cellulare, oncologia e ingegneria tissutale. Per iniziare questa procedura, pulire i vetrini di copertura e le camere di osservazione come indicato nel protocollo di testo. Quindi, depositare 70 microlitri di sospensione di perle di silice al 2% goccia a goccia su un vetrino di copertura tenuto a un'inclinazione di 15 gradi.

Capovolgere il bicchiere di 90 gradi ogni 15 secondi per un minuto mentre le sospensioni si asciugano. È fondamentale creare un monostrato di perle ravvicinato ed evitare la formazione di multistrati e grappoli d'olio. Per questo motivo, è necessario ottimizzare la concentrazione e il volume della soluzione del microsfone, nonché l'idrofilia del vetrino.

Dopo che il liquido è evaporato, posizionare il vetrino all'interno di un dispositivo di sputtering magnatron a radiofrequenza su una tavola rotante situata a 105 millimetri di distanza da un bersaglio di alluminio e silicio. Successivamente, utilizzare una pompa turbo-molecolare per diminuire la pressione nella camera di deposizione a 2,6 volte 10 al quarto pascal negativo. Introdurre un'atmosfera di argon puro con un flusso di 10 centimetri cubi standard al minuto e una pressione di 0,8 pascal.

Quindi, accendere il generatore di energia a radiofrequenza. Dopo che il plasma si è stabilizzato, spruzzare per due minuti mantenendo l'otturatore chiuso, per rimuovere eventuali impurità dalla superficie del bersaglio. Aprire l'otturatore e lasciare che lo sputtering continui per 60 minuti per depositare uno strato di alluminio spesso 200 nanometri sulla diapositiva.

Quindi tagliare il flusso di argon. Chiudere la valvola a saracinesca per isolare la pompa turbomolecolare dalla camera di deposizione. Successivamente, sfiatare la camera con azoto pulito per raggiungere la pressione ambiente.

Recuperare il vetrino rivestito in alluminio dalla camera. Immergere il vetrino recuperato in acqua ultrapura a temperatura ambiente e ultrasuoni a 50 watt e 50 hertz per 30 secondi. Quindi, depositare 0,5 millilitri di APTES sul fondo di un essiccatore.

Posizionare il vetrino su una griglia di ceramica. Posizionare la griglia nell'essiccatore. Collegare l'essiccatore a una pompa a membrana.

Quindi far funzionare la pompa alla massima potenza per 30 minuti per generare un basso vuoto. Chiudere la valvola dell'essiccatore e spegnere la pompa. Scaldare a 50 gradi Celsius per un'ora.

Dopodiché aprire l'essiccatore e raccogliere il vetrino. Posizionare il vetrino raccolto su un supporto in PTFE. Depositare 2 millilitri di 25 microgrammi per millilitro di biotina disciolta in PBS.

Lasciare riposare il vetrino per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi risciacquare 10 volte con PBS. Incubare il vetrino in una soluzione di idrossido di sodio e PBS a temperatura ambiente per una notte.

Successivamente, sciacquare lo scivolo 10 volte con acqua ultrapura. Dopo aver pulito la vasca Langmuir, posizionare i vassoi in PTFE nell'involucro in PTFE della vasca. Quindi riempilo con acqua ultrapura.

Impostare la pressione misurata a zero millinewton per metro. Utilizzando una siringa di vetro e metallo a tenuta di gas, depositare 30 microlitri di 1 milligrammo per millimetro di DOPC e la soluzione di cloroformio sulla superficie dell'acqua. Chiudere la barriera di PTFE fino a raggiungere la pressione desiderata di 27 millinewton per metro per comprimere il monostrato lipidico.

Quindi, utilizzando un morsetto motorizzato, immergere il vetrino preparato nell'involucro in PTFE. Tenere il cursore nel morsetto perpendicolare all'interfaccia aria-acqua. Sollevare il carrello attraverso l'interfaccia a una velocità di 15 millimetri al minuto mantenendo una pressione costante di 27 millinewton per metro.

Quindi, posizionare il vetrino orizzontalmente sulla superficie dell'acqua sopra una teglia in PTFE. Quindi, utilizzando una pinzetta di metallo, spingere il vetrino verso il basso nel vassoio in PTFE, immergendolo nell'acqua ultrapura. Utilizzare le pinzette per trasferire il vassoio in PTFE contenente il vetrino in un cristallizzatore riempito con acqua ultrapura.

Trasferire il vetrino rivestito sott'acqua in una camera di osservazione. Dopodiché, chiudere la camera, assicurandosi che all'interno sia intrappolato circa 1 millilitro d'acqua. Un'altra fase delicata è l'assemblaggio della camera del campione sott'acqua.

E si dovrebbe assolutamente evitare il contatto con l'aria dei doppi strati depositati, quindi per garantire ciò utilizzare un grande volume d'acqua e assicurarsi che l'intero processo di assemblaggio possa avvenire sott'acqua. Rimuovere la camera assemblata dall'acqua, verificare che la camera sia a tenuta stagna e priva di perdite. Aggiungere 500 microlitri di PBS, quindi rimuovere 500 microlitri di liquido dalla camera.

Ripetere questo processo 10 volte per sostituire completamente il millilitro di acqua ultrapura nella camera con PBS. Successivamente, introdurre 100 microgrammi per millilitro di albume sierico bovino nella camera di osservazione. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Successivamente, sciacquare il doppio strato rimuovendo e aggiungendo 500 microlitri dalla camera, 10 volte. Quindi, funzionalizzare con ligandi, depositare cellule e osservare il nanopattern proteolipidico e la fluidità SLB come delineato nel protocollo di testo. In questo protocollo, una maschera a perline viene utilizzata per creare una maschera metallica secondaria mediante deposizione controllata di alluminio.

Quindi, la maschera del tallone viene rimossa, lasciando uno strato di alluminio con dei fori. Successivamente, una silina organo-amminica, chiamata APTES, viene depositata nella fase vapore, seguita dalla deposizione di BSA-Biotina in fase acquosa. Quindi, l'alluminio viene rimosso, rivelando patch proteiche nanometriche.

Infine, lo spazio tra i punti viene riempito con un doppio strato lipidico supportato. Vengono quindi scattate immagini di epifluorescenza dei nano-punti e del doppio strato lipidico supportato. Un'immagine composita mostra una perfetta complementarietà con il doppio strato lipidico depositato in modo univoco attorno ai punti proteici, ma non su di essi.

In un'immagine di epifluorescenza di un doppio strato lipidico supportato appena depositato, i punti proteici appaiono come macchie scure in un mare luminoso di lipidi. Tuttavia, dopo un continuo sbiancamento fotografico per 50 secondi, l'immagine mostra un alone all'interno della regione delimitata dal diaframma di campo, indicando che i lipidi sono mobili. L'analisi del profilo di intensità media lungo il bordo del diaframma di campo, e il decadimento di questa intensità nel tempo durante il processo di sbiancamento, rivela che la costante di diffusione è di cinque micrometri quadrati al secondo.

Questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. È importante mantenere condizioni molto pulite durante la deposizione dell'alluminio e calibrare attentamente la curva di deposizione. Seguendo questa procedura, la guida modellata può essere ulteriormente funzionalizzata.

Ad esempio, aggiungendo un'altra biomolecola nel doppio strato. Lo usiamo per imitare l'antigene delle cellule erbivore, al fine di studiare l'attivazione delle cellule T. Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica dovrebbe interessare un pubblico eterogeneo.

Ad esempio, gli ingegneri dei tessuti potrebbero volerlo utilizzare come impalcatura per far crescere tessuti artificiali e gli oncologi potrebbero usarlo come piattaforma per porre domande fondamentali sull'aggiunta di cellule tumorali. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare un'area di nano-cluster proteici in un doppio strato lipidico supportato, che è compatibile con una tecnica di microscopia avanzata. Mentre lo usiamo per studiare le cellule T, crediamo che questo substrato abbia il potenziale per diventare la piattaforma di scelta per studiare l'interazione di qualsiasi tipo di cellula con la membrana proteolipidica a pattern controllato.