Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

L'obiettivo generale di questo protocollo è sviluppare tecnologie che consentano un efficace transduttore genico in cellule natural killer primarie. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunoterapia, come l'effetto della modifica genetica sui linfociti effettrici, ad esempio le cellule natural killer o NK. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'espressione efficiente di un gene di interesse in cellule NK primarie di topo o umane.

Dopo aver preparato e titolato i vettori lentivirali secondo il protocollo descritto, purificare le cellule NK primarie murine facendo passare sospensioni cellulari singole della milza attraverso colonne di lana di nylon per esaurire le popolazioni aderenti costituite da cellule B e macrofagi. Utilizzare 1.000 unità per millilitro di Interleuchina-2 in mezzo completo RPMI1640 per coltivare la popolazione non aderente che contiene le cellule NK. Al quarto giorno di coltura, sostituire il mezzo con 20 millilitri di mezzo completo RPMI1640 e 1.000 unità per millilitro di IL-2 per rimuovere le cellule T e NKT non aderenti.

Al settimo giorno, utilizzare marcatori specifici per cellule NK per verificare la purezza delle cellule NK murine mediante citometria a flusso, usando preparazioni con una popolazione superiore al 95% negativa per CD3 e positiva per NK1.1. Per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, stratificare con attenzione 35 millilitri di cellule dimezzate su un gradiente di densità di 15 millilitri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il gradiente in un rotore a cestelli oscillanti a 400 × g e 20 °C per 30 minuti senza frenata.

Dopo aver purificato le cellule NK primarie umane seguendo il protocollo descritto nel testo, determinare la purezza delle cellule aggiungendo due microgrammi per millilitro di anticorpi anti-CD3 e due microgrammi per millilitro di anticorpi anti-CD56. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Lavare le cellule due volte utilizzando PBS.

Quindi, analizzare le cellule mediante citometria a flusso. La popolazione di cellule NK sarà positiva per CD56 sulla superficie cellulare e negativa per CD3. Sospendere le cellule NK primarie di topo o umane nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti a 0,5 × 10⁵ per millilitro di mezzo con il sopranatante del lentivirus GFP, a un MOI di 5, 10 e 20.

Quindi, in presenza di polibrene, solfato di protamina o destrano, centrifugare le piastre a 1.000 × g per 60 minuti. Successivamente, senza decantare il sopranatante, coltivare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius arricchito con il 5,2% di anidride carbonica per tutta la notte.

Dopo aver lavato le cellule con 10 millilitri di PBS, utilizzare 2 millilitri di mezzo RPMI1640 con IL-2 per risospendere le cellule. Il giorno precedente il prelievo delle cellule, rivestire le piastre in polistirene altamente assorbente per proteine da 96 pozzetti con 2,5 microgrammi per millilitro di anticorpi monoclonali anti-MKG2D e incubare le piastre a temperatura ambiente o in frigorifero durante la notte.

Il giorno seguente, utilizzare 100 microlitri di PBS per lavare ogni pozzetto tre volte. Raccogliere le cellule NK transdotte dapprima agitando delicatamente le piastre, quindi aggiungere 100 microlitri di cellule in ogni pozzetto delle piastre a 96 pozzetti. Da 16 a 18 ore dopo l'attivazione, utilizzare una pipetta multicanale per raccogliere i supernatanti.

Quindi, utilizzando la citochina ricombinante proveniente da un kit ELISA, generare una curva standard e quantificare le citochine, come l'Interferone Gamma, nel sopernatante. Per valutare la vitalità delle cellule NK, a quattro giorni dalla trasduzione, lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS freddo. Successivamente, raccogliere le cellule e utilizzare XM5 7-aminoattinomicina D per colorarle.

Utilizzare la citometria a flusso per determinare la percentuale di cellule necrotiche tra le cellule NK trasformate e analizzare i dati seguendo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra che le cellule NK umane incubate con IL-2 ricombinante e successivamente trasdotte con Lentivirus GFP hanno raggiunto una maggiore efficienza di trasduzione e un aumento del titolo virale quando al mezzo di coltura è stato aggiunto dextrano, rispetto all'aggiunta di polibrene o solfato di protamina. Come mostrato qui, risultati simili sono stati ottenuti con cellule NK murine, in cui il dextrano ha aumentato l'efficienza dei vettori lentivirali rispetto al polibrene o al solfato di protamina.

In questo esperimento, la capacità citotossica di cellule NK primarie transdotte è stata esaminata mediante un saggio di rilascio di CR su cellule bersaglio K562 e YAC-1. La trasduzione delle cellule NK mediante destrano non altera negativamente il potenziale citotossico delle cellule NK trasformate rispetto alle cellule NK non transdotte. In questo caso, le cellule NK primarie umane transdotte sono state co-colture con K562 per 24 ore, e i supernatanti sono stati raccolti per misurare l'Interferone Gamma.

I risultati indicano che la destrina non ha alcun impatto sulla capacità delle cellule NK transdotte di produrre citochine. Inoltre, una validazione indipendente ha mostrato che le cellule NK trattate con destrina e attivate con anticorpi monoclonali anti-NKG2DA10 legati a piastra erano comunque in grado di produrre la citochina Interferon Gamma. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di centrifugare le cellule transdotte.

Successivamente a questa procedura, altri metodi come la trasfezione possono rivelarsi fondamentali per rispondere a ulteriori domande, ad esempio su come migliorare il trasferimento genico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'Immunologia, consentendo di esplorare la manipolazione genica nelle cellule NK. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trasdurre le cellule NK.