Name: Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer een efficiënte methode om integratie-vrije iPS-cellen te genereren uit menselijk perifeer bloed met behulp van episomale vectoren. Dit protocol ondersteunt stamcelonderzoek en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2015CB964902, 2013CB966902 en 2012CB966601), de Nationale Natuurwetenschappelijke Stichting van China (81500148, 81570164 en 81421002), de Loma Linda University School of Medicine GCAT-subsidie (2015), en het Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Al het menselijk PB monsters werden verkregen uit anonieme volwassen donoren met geen identificatie-informatie beschikbaar van Tianjin Blood Center met toestemming van de lokale ethische toetsingscommissie. 1. Endo-free plasmidepreparaat <ol><li> Gebruik commerciële Plasmid Purification Kit Maxi tot episomale vectoren extract van E. coli volgens het protocol van de fabrikant. Voor de laatste stap, vervanging TE buffer endotoxine-vrij steriel water om de DNA pellet lossen. </li><li> Meet DNA-concentratie onder toepassing van een commerciële UV / Vis spectrofotometer. De concentratie is gewoonlijk groter dan 1 ug / ul, met A260 / A280 en A260 / A230 verhoudingen groter dan 1,8 en 2,0, respectievelijk. </li></ol> 2. Cultuur Media <ol><li> Bereid erytroïde medium: expansie van hematopoietische stamcellen medium aangevuld met 100 ng / mL menselijk Stem Cell Factor (SCF), 10 ng / ml interleukine-3 (IL3), 2 U / mL Erytropoëtine (EPO), 20 ng / ml insuline groeifactor 1 (IGF1), 1 uM dexamethason en 0,2 mM 1-thioglycerol. Filter steriliseren met een 0,22 pm spuitfilter. Erytroïde medium kan voor maximaal een maand worden opgeslagen bij 4 ° C. </li><li> Bereid iPSC medium: DMEM / F12 medium (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12) aangevuld met 1 x L-glutamine, 1 x penicilline / streptomycine, 1 x niet-essentiële aminozuren oplossing, 50 ng / ml fibroblast groeifactor 2 (FGF2 ), 1x insuline-transferrine-Seleniet supplement (ITS), en 50 mg / ml ascorbinezuur. Filter steriliseren met een 0,22 pm spuitfilter. iPSC medium kan voor maximaal een maand worden opgeslagen bij 4 ° C. </li><li> Bereid MEF medium Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM, hoge glucose) aangevuld met 1 x penicilline / streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS). Filter steriliseren met een 0,22 pm spuitfilter. MEF medium kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende één maand of vers 1 x L-glutamine toe voor gebruik. </li><li> Prepareren iPSC cryopreservatie medium (2x): Los 5 g D-trehalose in 30 ml steriel water in een 37 ° C waterbad. Breng de temperatuur tot 4 ° C en voeg 10 ml FBS en 10 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Filter steriliseren met een 0,22 pm spuitfilter. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden 24. </li></ol> 3. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PB MNC&#39;s) <ol><li> Combineer 10 ml vers PB monster en 10 ml PBS-buffer in een 50 ml buis en meng goed. Breng PBS tot kamertemperatuur of 37 ° C vóór gebruik. LET OP: Ongeveer 1-3 x 10 6 MNO&#39;s (vers of gecryopreserveerd) zijn verkrijgbaar vanaf 1 ml van PB. Na 6 d van cultuur, verwachten tot 0,5 hebben - 1 x 10 6 totaal cellen als gevolg van de dood van volwassen cellen tijdens de cultuur. Ongeveer 1 x 10 7 cellen kunnen worden verkregen uit 10 ml vers PB. </li><li> Voeg 10 ml Ficoll naar de bodem van de buis met behulp van een 10 ml spuit bevestigd aan een lange naald. deze process moet langzaam worden gedaan om de Ficoll laag niet mengen met de PB. </li><li> Centrifugeren bij 400 g gedurende 30 minuten bij een lage acceleratie en deceleratie. Na het centrifugeren, de PB MNO&#39;s zijn in de witte laag (buffy coat) gelegen tussen de PB plasma en het Ficoll. </li><li> Langzaam aspireren ~ 10 ml PB plasma zonder verstoring van de bufferlaag. oogsten voorzichtig de witte laag met behulp van een 1 ml pipet tip om een ​​nieuwe 50 ml buis. Het totale volume van de verzamelde cellen van de witte laag zal tussen 3-6 ml. </li><li> Voeg PBS om het totale volume op 30 ml te brengen en meng met een 10 ml pipet. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in 20 ml kweekmedium (dwz Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s medium, IMDM) en meng. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min om de meerderheid van de bloedplaatjes te verwijderen. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1-2 ml IMDM. Cellen kunnen worden gebruikt fof onmiddellijke cultuur, of bevroren-down voor later gebruik. Voor cryopreservatie, voeg een gelijke hoeveelheid cryopreservatie medium. Aliquot cellen in cryovials (0,5-1 ml per flacon) en de overdracht cryovials naar een -80 ° C vriezer onmiddellijk. PB MNO&#39;s kunnen worden opgeslagen in -80 ° C vriezer gedurende enkele weken of overgebracht naar een vloeibare stikstof tank voor langdurige opslag. OPMERKING: Wanneer het ontdooien van de bevroren cellen, hoewel onze cryopreservatie medium levensvatbaarheid van de cellen kunnen ondersteunen, kan de cel te verlagen als gevolg van celdood tijdens het ontdooien proces. Aanbevolen wordt 1-10 x 10 7 cellen worden ingevroren in elk flesje. </li></ol> 4. Uitbreiding van PB multinationals in erytroïde Medium <ol><li> Bereid 5 ml IMDM medium in een 15 ml buis. Snel ontdooien de bevroren PB multinationals in een 37 ° C waterbad en vervolgens overbrengen naar de buis met de IMDM medium. LET OP: De lengte van de tijd in een waterbad is afhankelijk van het volume van de gecryopreserveerde cellen en de cryovial Used. Gewoonlijk zal de bevroren cellen ontdooien binnen 1 min. </li><li> Centrifugeren bij 400 g gedurende 5-10 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in erythroïde medium. Voeg 10 pi trypan Blue oplossing voor 10 pi celsuspensie en meng goed. Trypan blauw kleurt dode cellen in 1-3 min. Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer. </li><li> Cultuur PB MNO&#39;s in een niet-weefselkweek (non-TC) behandeld 6-wells plaat met 2 ml medium per putje, bij een celdichtheid van ~ 5 x 10 6 cellen / ml, bij 37 ° C in een 5% CO 2 bevochtigde incubator. </li><li> Voeg 1 ml vers medium erytroïde direct aan elk putje zonder dat het medium bij D 3 en 5. </li><li> Bij D 6, de oogst van de PB multinationals voor nucleofectie. </li></ol> 5. PB MNC Nucleofectie en herprogrammeren <ol><li> Een dag voor nucleofectie, voorbekleding TC behandelde 6-well platen met 0,1% gelatine bij 37 ° C gedurende 20 min. Dooi geïnactiveerde muriene embryonale Fibroblast (MEF) feeder-cellen in een 37 ° C waterbad en onmiddellijk overbrengen naar een 15 ml buis met 5 ml MEF medium. </li><li> Centrifugeren bij 400 g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Verwijder de gelatine van de 6-well plaat, resuspendeer de celpellet in MEF medium, en overbrengen naar de gelatine voorbehandelde 6-wells plaat. In elk putje, zaad 2-4 x 10 5 geïnactiveerde MEF cellen gesuspendeerd in 2 ml MEF medium. </li><li> Cultuur de MEF feeder-cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator. </li><li> Op de dag van nucleofection, zuigen de MEF medium en te vervangen door 1 ml erytroïd medium. Pre-evenwicht de kweekplaat voor 10 - 30 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator. </li><li> Voeg 2 ug PEV-OCT4-2A-SOX2, 1 ug PEV-MYC, 1 ug PEV-KLF4, en 0,5 ug PEV-BCL-XL in een 1,5 ml steriele Eppendorf buis. Verwarm de buis bij 50 ° C gedurende 5 minuten om besmetting te voorkomen, en afkoelen tot kamertemperatuur. Toevoegen57 pi nucleofectie buffer en 13 ul supplement. </li><li> Harvest 2 x 10 6 gekweekt PB multinationals aan een 5 ml buis door centrifugeren bij 200 xg gedurende 7 min. Verwijder de supernatant en voeg het plasmide en nucleofection buffer mix de celpellet. Meng goed door de knop van de buis met je vinger. OPMERKING: vanaf 2 x 10 5 cellen kunnen worden gebruikt voor nucleofectie, maar een lagere herprogrammering efficiëntie moet ook worden verwacht. </li><li> Breng de DNA en celsuspensie aan de cuvet in de kit en dop de cuvette. Selecteer het programma U-008 op het nucleofection apparaat. Plaats de cuvette in de houder en druk op OK om het programma U-008 toe te passen. </li><li> Neem de cuvet uit de houder, voeg 0,5-1 mL voorverwarmd erythroïde medium in elke cuvette, en overdracht cellen om de pre-evenwicht gebracht MEF plaat onmiddellijk. Vanwege de hoge efficiëntie en herprogrammering donor variatie zaaien verschillende aantallen cellen variërend van 1-10 x 10 5 cellen per goed wordt sterk aangemoedigd. </li><li> Breng de plaat een hypoxie kamer, en spoel de kamer met een gasmengsel bestaande uit 92% N2, 5% CO2 en 3% O2, 1 - 2 minuten bij een snelheid van 20 l / min. Na afdichten van de kamer, de cellen te kweken bij 37 ° C. </li><li> Bij D 2 post-nucleofectie, voeg 2 ml iPSC medium direct aan elk putje. </li><li> Bij D 4 post-nucleofectie, verwijder 3 ml medium en voeg 2 ml vers iPSC medium. Bij D 4 na nucleofectie, zal van levende cellen aan de voedingslaag hebben gehecht. </li><li> Na D 6 post-nucleofectie, wijzigt u het medium elke 2 d door het verlaten van 500 pi doorgebracht medium en het toevoegen van 2 ml vers E8 medium, aangevuld met 0,25 mM natriumbutyraat tot D 14-18. LET OP: Extra feeder cellen kunnen in de cultuur putten wanneer het waarnemen dat de feeder-cellen zijn losgemaakt worden toegevoegd. Na ontdooien MEF (zie 5,1 en 5,2), resuspendeer de celpellet in een klein volume medium E8 (dwz ~ 0.2 ml voor één putje van een 6-wells plaat) en vervolgens toe te voegen MEF in de cultuur putten. Ongeveer 2% FBS toegevoegd worden om celbinding te verhogen. Alternatief kan MEF-geconditioneerd medium worden gebruikt, maar het is bewerkelijker. </li></ol> 6. Uitbreiding van iPSC LET OP: In de meeste gevallen grote aantallen iPSC kolonies verschijnen op D 8-10 paal nucleofectie. Na D 14, grote iPSC kolonies zijn meestal klaar voor het plukken. <ol><li> Alvorens ze kolonies, voeg 500 ul E8 medium aangevuld met ROCK inhibitor, Y27632 (10 uM) in een putje van een feeder of Matrigel gecoate 24-well plaat. Gebruik een 10 of 20 ul pipet te krabben en plukken kolonies onder de microscoop. Breng de stukken van elke kolonie aan de wells die het kweekmedium. LET OP: De concentratie van Matrigel verschilt van de ene partij naar de andere. Gewoonlijk gebruiken we 1: 100 verdunning van Matrigel. <ol><li> Om kruisbesmetting te voorkomen, pickkolonies die grote en goed gescheiden van anderen. IPSCs kweek bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator. Opmerking: Het moet er rekening mee dat de iPSC polyklonale populatie kan het gevolg celmigratie als er tientallen of honderden kolonies in elk putje van een 6-wells plaat. </li></ol></li><li> Do medium niet wijzigen voor de eerste 2 d. ROCK-remmer kan voortbestaan van kleine kolonies 25 te promoten. </li><li> Vanaf D 2 verder, veranderen medium elke dag door het verwijderen van verbruikte medium en het toevoegen van 500 pi vers E8 medium in elk putje. </li><li> Ongeveer 1 week later, wanneer de kolonies groot genoeg zijn, verwijdert het medium en behandeling van de cellen met 300 pi cellen loslaten oplossing (0,5 mM EDTA in PBS) bij 37 ° C gedurende 1-3 min. Verwijder de cel detachement oplossing en voeg E8 medium dat ROCK-remmer (10 uM) om iPSCs op te schorten. Mis kolonies niet opgesplitst in enkele cellen, wat kan leiden tot buitensporige celdood. De cel klonten met 5-50 cells zijn geschikt voor iPSC passage. </li><li> Breng 50 - 100% van de celsuspensie aan elk putje van een 12- of 6-wells plaat die vooraf bekleed met Matrigel of feeders. </li><li> Voor de lange termijn cultuur in Matrigel-beklede platen (zie opmerking in 6.1), wijzigt het medium elke dag. Wanneer de cellen confluentie bereikt 40 - 60%, de behandeling van de cellen met 1 ml cel losraken oplossing (0,5 mM EDTA in PBS) bij 37 ° C gedurende 3 min ~. Wanneer de kolonies beginnen te krullen, verwijder de cel detachement oplossing en voeg E8 medium dat ROCK-remmer (10 uM) aan de iPSCs schorten. Passage cellen met een splitsing factor 4 - 8. ROCK inhibitor worden toegevoegd wanneer cellen passage overleving verhogen en verwijderd 1 d later om differentiatie te voorkomen. </li><li> Invriezen-down iPSCs behandelen cellen met cel losraken oplossing bij 37 ° C gedurende 3-5 min volgens het protocol van de fabrikant. Wanneer iPSC kolonies beginnen te krullen, zuigen de buffer en voeg 0,5-1 mL E8 medium. </li> &lt;li&gt; Voeg een gelijk volume cryopreservatie medium aan de celsuspensie en meng goed. Bevroren iPSC kunnen worden opgeslagen in een -80 ° C vriezer gedurende enkele weken of in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. </li></ol> 7. Selectie van iPSCs zonder blijvende Episomaal plasmiden <ol><li> Na passage 5, oogst iPSCs en pak genomische DNA. OPMERKING: Meestal na 5 passages van de cultuur, de resterende episomale plasmiden zijn niet op te sporen. Dus bijna alle iPSC kolonies doorgangen boven 5 (dwz passage 10) ontbreken resterende episomale plasmiden. </li><li> Gebruik genoom DNA van ongetransfecteerde PB multinationals als een negatieve controle. Voeg 1,6 pg PEV-OCT4-2A-SOX2 plasmide in 1 ug negatieve controle DNA aan cellen na te bootsen met een exemplaar van PEV plasmide per cel. </li><li> Voeg 9 ul PCR-grade water met inbegrip van 100 ng genoom-DNA en 1 pl specifieke primers (10 uM elk van voorwaartse en achterwaartse primers) in 10 pi High-Fidelity PCR Master Mix. Normaliseren van de AMount van DNA door GAPDH. Gebruik de volgende primers voor PCR: EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT, EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG, WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT, WPRE-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT, GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC, GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij 98 ° C gedurende 60 s; gevolgd door 98 ° C gedurende 10 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s. Na 30 cycli; breiden de reactie bij 72 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Belasting 5 pi PCR producten in elk putje van een 1% agarosegel. Voer de gel voor 20 - 30 minuten bij 100 V. Kies de iPSC klonen met ondetecteerbaar banden voor EBNA1 en WPRE voor verdere cultuur en downstream-analyse. </li></ol> 8. flowcytometrie <ol><li> Oogst iPSCs door ze te behandelen met Accutase bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten op een enkele celsuspensie te verkrijgen. Voeg 1 ul PE-geconjugeerd anti-TRA-1-60 of eFluor 570-geconjugeerd anti-SSEA4 of isotypische antilichaam aan 100 ul celsuspensie (1 - 5 x 10 5 cellen) In 5 ml buisjes. Incubeer de buizen in een donkere plaats bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Na kleuren gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, voeg 2 ml PBS en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in 300 ul PBS-Fluorescence Activated Cell Sorting analyse (FACS) met een flow cytometrie cell analyzer. 23,26 </li></ol> 9. Confocale Imaging <ol><li> Zaad iPSCs in Matrigel gecoate kamer dia&#39;s. </li><li> Na 3-4 d van de cultuur, verwijder het groeimedium en bevestig deze met 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de cellen tweemaal met PBS. Let op: PFA is giftig en schadelijk. </li><li> Behandel de cellen met 0,1% Triton X-100 in PBS (PBS-T) bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de cellen tweemaal met PBS. </li><li> Blokkeer de cellen met blokkerende buffer (5% geit serum in PBS, V: V) bij KT gedurende 1 uur. </li><li> Tijdens de blokkerende stap, verdunnen het primaire antilichaam (100x) in het blokkeren van buffer. LET OP: De antilichamen informatie staat vermeld in de tabel van Materialen / Equipment. </li><li> Incubeer cellen met verdund antilichaam bij 4 ° CO / N. </li><li> Was tweemaal met PBS-T gedurende 15 min, gevolgd door tweemaal met PBS gedurende 15 minuten. </li><li> Incubeer cellen met een verdunde fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS-T gedurende 15 min, gevolgd door tweemaal met PBS gedurende 15 minuten. </li><li> Vlekken op de kern met DAPI (1 ug / ml) in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS gedurende 15 minuten. </li><li> Maak foto&#39;s met een confocale microscoop. 23,27 </li></ol> 10. Teratoma Assay Oogst 1 x 10 6 cellen iPSCs met onthechting oplossing (0,5 mM EDTA in PBS) en resuspendeer cellen in 200 ul DMEM / F12 verdund (1: 1) Matrigel. <ol><li> Subcutaan injecteren cellen in de achterste heup van NOD / SCID immunodeficiënte muizen. </li><li> Bij 8-12 week na iPSC injectie, ontleden en oplossen teratomas in 10% formaline. 28 </li><li> Na microsectioning enkleuring met hematoxyline en eosine (H &amp; E), te analyseren monsters. 29 </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials%3A+Progress+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li>
<li>Hayes, M., Zavazava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+generate+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategies to generate induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Dorigo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+helper-dependent+adenovirus-Epstein-Barr+virus+hybrid+system+for+the+stable+transformation+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells.</a> J Virol. 78, 6556-6566 (2004).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Harms, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+Cytokeratin+20-negative+Merkel+cell+carcinoma+reveals+ultraviolet-signature+mutations+and+recurrent+TP53+and+RB1+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation.</a> Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
<li>Martincorena, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution.+High+burden+and+pervasive+positive+selection+of+somatic+mutations+in+normal+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin.</a> Science. 348, 880-886 (2015).</li>
<li>Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors.</a> Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Human+Peripheral+T+Cells+Using+Sendai+Virus+in+Feeder-free+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).</li>
<li>Gill, S., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+viral%3A+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies.</a> Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).</li>
<li>Su, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+ips+cells+from+human+adult+peripheral+blood+using+BCL-XL+together+with+Yamanaka+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors.</a> PLoS One. 8, e64496(2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p53-PUMA+axis+suppresses+iPSC+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation.</a> Nat Commun. 4, 2174(2013).</li>
<li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404(2009).</li>
<li>Wen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Generation+of+Integration-free+iPSCs+from+Human+Adult+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+with+an+Optimal+Combination+of+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors.</a> Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).</li>
<li>Zhang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+ameliorates+the+cryopreservation+of+cord+blood+in+a+preclinical+system+and+increases+the+recovery+of+CFUs%2C+long-term+culture-initiating+cells%2C+and+nonobese+diabetic-SCID+repopulating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells.</a> Transfusion. 43, 265-272 (2003).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+associated+with+abnormal+mitosis+observed+by+confocal+imaging+in+live+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells.</a> J Vis Exp. , e50568(2013).</li>
<li>Peterson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+generation+in+the+testis+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Teratoma generation in the testis capsule.</a> J Vis Exp. , e3177(2011).</li>
<li>Ritner, C., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+of+human+embryonic+stem+cells+by+teratoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Wen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Generation+of+Integration-free+iPSCs+from+Human+Adult+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+with+an+Optimal+Combination+of+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors.</a> Stem Cell Reports. , (2016).</li>
<li>Lo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Protein+Levels+in+Single+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of Protein Levels in Single Living Cells.</a> Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).</li>
<li>Liu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+generating+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Zhongguo+Shi+Yan+Xue+Ye+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells.</a> Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).</li>
<li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nat Methods. 13, 446-452 (2016).</li>
<li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+to+establish+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+adult+blood+cells+under+feeder-free+and+xeno-free+culture+conditions%3A+a+clinically+compliant+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach.</a> Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Howden, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Reprogramming+and+Gene+Correction+of+Patient+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts.</a> Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+reprogramming+of+human+fetal+and+adult+blood+CD34%2B+cells+into+mesenchymal+stem+cells+with+a+single+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor.</a> Cell research. 23, 658-672 (2013).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Cord+Blood+CD34%2B+Cells+Into+Neural+Stem+Cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4.</a> Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende of tegenstrijdige belangen om bekend te maken.

Het verwerven van bloedmonsters van gezonde donoren en patiënten is handig en niet-invasieve, waardoor het een aantrekkelijk cel bron voor fundamenteel onderzoek en klinische celtherapie. Hier hebben we een protocol voor zeer efficiënte generatie van integratie-vrij iPSCs uit perifere bloedmonsters beschreven. Deze reproduceerbare en betaalbare benadering moet het veld iPSC profiteren. We hebben gerapporteerd dat er twee kritische factoren die verantwoordelijk zijn voor de zeer efficiënte PB...

Na het gedwongen expressie van een aantal transcriptiefactoren (Dwz OCT4, SOX2, MYC en KLF4), kunnen somatische cellen worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die een grote belofte voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde en celvervangingstherapie 1-3 te houden. Tot op heden zijn verschillende werkwijzen ontwikkeld om het succes van herprogrammering 4-7 te verhogen. Virale vectoren geïnduceerde herprogrammering wordt veel gebruikt voor efficiënte generatie iPSC omdat virale integratie leidt tot een hoog niveau, stabiele expressie van de herprogrammering factoren. Echter kan permanente integratie van het vector DNA in het genoom insertie mutagenese 5 induceren. Bovendien kan onvoldoende inactivering van herprogrammering factoren iPSC differentiatie 8 verstoren. Als zodanig is het gebruik van iPSCs zonder integratie van herprogrammering factoren is noodzakelijk, met name voor toepassing bij celtherapie toepassingen. <p class="jove_content"&gt; Episomaal Vectors (EV) worden veel gebruikt bij het genereren van integratie-vrije iPSCs. De meest gebruikte EV is een plasmide dat twee elementen, oorsprong van virale replicatie (oriP) en EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), van het Epstein-Barr (EB) -virus 9. De oriP element bevordert plasmide replicatie in zoogdiercellen, terwijl de EBNA1 element aanbinden de oriP-bevattende plasmide-DNA aan het chromosomale DNA dat zorgt voor de verdeling van de episoom bij deling van de gastheercel. In vergelijking met andere integratie-vrij benaderingen, waaronder Sendai virus (SV) en RNA transfectie EV bezitten meerdere voordelen 5,6,10. Zoals plasmide-DNA, kunnen EV&#39;s gemakkelijk worden geproduceerd en gewijzigd in huis, waardoor ze zeer betaalbaar. Bovendien herprogrammering met EV is minder arbeidsintensief proces aangezien een enkele transfectie met EV volstaat iPSC productie, terwijl verschillende RNA transfecties nodig voor een succesvolle herprogrammering zijn. DErmal fibroblasten werden gebruikt in vele studies herprogrammering. Echter, huidbiopsie is niet alleen een invasieve en pijnlijk proces, maar ook tijdrovend voor uitbreiding cellen voldoende hoeveelheden herprogrammering. Van groter belang zijn huidcellen van volwassen donoren vaak blootgesteld aan langdurige UV-straling, hetgeen kan leiden tot mutaties geassocieerd met tumoren, waardoor de verzoeken om iPSCs afgeleid van huidfibroblasten 11,12 beperken. Onlangs is vermeld dat normale menselijke huidcellen ophopen somatische mutaties en meerdere kankergenen, waaronder de meeste van de drijvende krachten cutane plaveiselcelcarcinomen, onder sterke positieve selectie 13. In tegenstelling tot huidfibroblasten, perifeer bloed (PB) cellen een voorkeur bron van cellen voor herprogrammering omdat 1) bloedcellen gemakkelijk door een minimaal invasieve werkwijze kunnen worden verkregen, 2) perifere bloedcellen zijn het nageslacht van hematopoietische stamcellenwonende in het beenmerg, dus beschermd tegen schadelijke straling. Perifere mononucleaire bloedcellen (PB MNO&#39;s) kunnen worden verzameld in een uur van de bufferlaag na een eenvoudige gradiënt centrifugeren met behulp van Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De verkregen PB MNO&#39;s zijn samengesteld uit lymfocyten, monocyten en een paar haemapoietische voorlopercellen (HPC) 14. Hoewel humane T lymfocyten zijn een van de belangrijkste celtypen in PB, volwassen T cellen bevatten herrangschikkingen van het T-celreceptor (TCR) genen en ontberen een intact genoom teneinde hun voor toepassingen 15,16 beperken. Evenwel verjonging van T-cellen via iPSC generatie potentiële toepassingen in chimère antigeen receptor (CAR) T-celtherapie 17-19 hebben. In vergelijking, HPC&#39;s hebben een intact genoom en onmiddellijk herprogrammeerbaar. Hoewel slechts 0,01-0,1% cellen in de perifere circulatie zijn HPC&#39;s, kunnen deze cellen worden uitgebreid ex vivo in erythroïde medium dat proliferatie van erythr gunstenoid voorlopercellen 14. In onze eerdere studie, gebruikten we de factor BCL-XL naast de Yamanaka factoren (OCT4, SOX2, MYC en KLF4), wat resulteerde in een toename van 10x PB herprogrammering efficiëntie 20. BCL-XL, ook bekend als BCL2L1, is een krachtige remmer van celdood, door het remmen activatie van caspases 21,22. Maar kan BCL-XL ook een belangrijke rol spelen bij het handhaven pluripotentie 21,22. Onlangs hebben we verder geoptimaliseerd EV herprogrammering systeem afzonderlijk tot expressie MYC en KLF4 met twee vectoren, die leidt tot een ongeveer 100x verhoging herprogrammering efficiëntie 23. Met deze methode, de herprogrammering efficiency, gedefinieerd door kolonieaantal gedeeld door te beginnen celaantal bij transfectie is 0,2-0,5% van gezonde donoren. Als hieronder beschrijven we de gedetailleerde experimentele procedure voor het genereren integratie-vrij iPSCs van PB.

<table><tbody><tr><td>Hematopoietische Stamcel Expansie Medium</td><td>Sigma</td><td>S0192</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Human Stem Cell Factor (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Interleukine-3 (IL-3)</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-03</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Erytropoëtine (EPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Insulin Growth Factor-1 (IGF-1)</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>1-thioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Gibco</td><td>112660-012</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>L-glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Niet-essentiële Aminozuren oplossing (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrine-Selenium (ITS, 100x)</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>DMEM (high glucose) medium</td><td>Thermo</td><td>SH30243.01B</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SV30087.01</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare, SIGMA</td><td>17-5442-02</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma</td><td>T9531</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Bewaar bij RT, bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>Endofree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Human CD34+ Cell Nucleofection Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1003</td><td>Bewaar bij RT, nucleofectiebuffer en supplement moeten worden bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Natriumbutyraat</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>ROCK-remmer - Y27632</td><td>STEMGENT</td><td>04-0012-10</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Essential 8 basaal medium (E8)</td><td>Gibco</td><td>A15169-01</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, het supplement moet worden bewaard bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354277</td><td>Bewaar bij -20 of -80 &deg;C</td></tr><tr><td>2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye)</td><td>TransGen Biotech</td><td>AS111</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Celdetacheringsoplossing</td><td>STEMGENT</td><td>01-0006</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C, Accutase als celdetacheringsoplossing om een enkele cel suspensie te verkrijgen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Bewaar bij 4 of -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Nanog AF488</td><td>BD</td><td>560791</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, primaire antilichaam gebruikt voor Immunofluorescentie, verdun 1/100 bij gebruik</td></tr><tr><td>Anti-OCT4</td><td>abcam</td><td>ab19857</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, primaire antilichaam gebruikt voor Immunofluorescentie, verdun 1/100 bij gebruik</td></tr><tr><td>AF488 donkey anti-muis IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, secundair antilichaam gebruikt voor Immunofluorescentie, verdun 1/500 bij gebruik</td></tr><tr><td>PE anti-human TRA-1-60-R antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>330610</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, antilichaam gebruikt voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>eFluor 570-geconjugeerd anti-SSEA4</td><td>eBioscience</td><td>41-8843</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, antilichaam gebruikt voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Isotype antilichaam</td><td>eBioscience</td><td>11-4011</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, antilichaam gebruikt voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Alkaline Fosfatase Detectie Kit</td><td>SiDanSai</td><td>1102-100</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Genoom DNA Extractie Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP304-02</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Trypan Blauw oplossing</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Flowcytometrie cel analyzator</td><td>BD</td><td>LSRII</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Confocal microscoop (SDC)</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>voor confocale beeldvorming</td></tr><tr><td>Nucleofectine apparaat</td><td>Lonza</td><td>Nucleofector 2b</td><td>voor de nucleofectie van PB MNC</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4010</td><td>GE</td><td></td><td>om foto's van AP kleuring in bulk te maken</td></tr></tbody></table>

generatie van integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp episomaal vectors

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) houdt een grote belofte voor de ziekte van modellering en regeneratieve therapieën. We eerder gemeld het gebruik van Episomaal vectoren (EV) integratie-vrij iPSCs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (MNC PB) te genereren. De episomale vectoren gebruikte DNA plasmiden samengebouwd met oriP en EBNA1 elementen van het Epstein-Barr (EB) -virus, die het mogelijk maken replicatie en langdurige retainment plasmiden in zoogdierlijke cellen. Met verdere optimalisatie kan duizenden iPSC kolonies worden verkregen bij 1 ml perifeer bloed. Twee kritische factoren voor het bereiken van hoge rendementen herprogrammering zijn: 1) het gebruik van een 2A &quot;zelf-splitsing&quot; peptide koppelen OCT4 en SOX2, hetgeen moet equimolaire expressie van de twee factoren; 2) het gebruik van twee vectoren om MYC en KLF4 afzonderlijk drukken. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor het genereren van integratie-vrije iPSC&#39;s uit perifere bloedmonsters volwassene. De gegenereerde iPSCs zijn integratie-vrij als residuele episomale plasmiden zijn niet op te sporen na vijf passages. Hoewel de herprogrammering efficiëntie is vergelijkbaar met dat van Sendai virus (SV) vectoren, plasmiden EV aanzienlijk voordeliger dan de commercieel beschikbare vectoren SV. Deze betaalbare EV herprogrammering systeem houdt potentieel voor klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde en biedt een aanpak voor de directe herprogrammering van PB multinationals om de integratie-vrije mesenchymale stamcellen, neurale stamcellen, enz.

Met dit protocol, kunnen we honderden kolonies te verkrijgen van 1 x 10 5 nucleofected PB MDL (Figuren 1A en 1B). Herprogrammering efficiëntie bedraagt ongeveer 0,2-0,5% en de kolonies expressie pluripotentie markers (figuren 1C en 1D). iPSCs gegenereerd met de beschreven protocol zijn integratie-vrij en hebben de mogelijkheid om teratoma samenstellen van de 3 kiemlagen (Figuren 1E en ...

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van iPS-cellen uit mononucleaire cellen uit perifeer bloed van volwassen mensen met behulp van niet-integrerende episomale vectoren. Dit protocol kan wetenschappers in het vakgebied van stamcellen helpen die iPS-cellen willen genereren voor ziektemonitoring, drugscreening en reguliere radiomedicijnonderzoeken. Ons herprogrammeringsprotocol is zeer eenvoudig en toch zeer efficiënt.Door deze procedure te volgen, kan men gemakkelijk de techniek van bloedcelherprogrammering beheersen. De kwaliteit van het plasma is even belangrijk voor een succesvolle herprogrammering. Verontreinigingen kunnen de efficiëntie van de herprogrammering verlagen; daarom bevelen wij het gebruik van Endofree-kits aan om episomale plasmiden te zuiveren.iPS-cellen zijn fragieler dan andere cellen. Het voorbereiden van cellen voor meer dan één passage kan leiden tot massale celdood, in het bijzonder bij vroege passages. Bereid om met deze procedure te beginnen alle benodigde kweekmedia voor volgens het bijbehorende manuscript.Combineer vervolgens 10 mL van een vers PB-monster en tien mL PBS-buffer in een buis van 50 mL en meng goed. Breng de PBS voorafgaand aan gebruik naar kamertemperatuur of 37 °C. Voeg daarna 10 mL ficoll toe aan de bodem van de buis.Dit proces moet langzaam worden uitgevoerd om te voorkomen dat de ficoll-laag zich mengt met het PB. Centrifugeer het mengsel 30 minuten lang bij 400 x g met een lage acceleratie en deceleratie. Na centrifugatie bevinden de PB MNC's zich in de witte laag tussen het PB-plasma en ficoll. Aspireer langzaam 10 mL PB-plasma zonder de ficoll-bufferlaag te verstoren.Oogst vervolgens voorzichtig de witte laag in een nieuwe buis van 50 mL. Het totale volume van de verzamelde cellen uit de witte laag moet ongeveer drie tot zes mL zijn. Voeg daarna PBS toe om het totale volume aan te vullen tot 30 mL en meng goed.Centrifugeer het monster vervolgens 10 minuten bij 400 x g. Verwijder na tien minuten het supernatant en resuspendeer de celpellet in 20 mL kweekmedium. Meng goed en centrifugeer het monster vijf minuten bij 400 x g om het grootste deel van de bloedplaatjes te verwijderen.Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de celpellet in één tot twee mL IMDM. De cellen kunnen direct worden gebruikt voor kweek of worden ingevroren voor later gebruik. Voeg voor cryopreservatie een gelijke hoeveelheid cryopreservatiemedium toe. Verdeel de cellen over cryovials en plaats deze onmiddellijk in een vriezer van -80 °C. Bereid voor deze procedure vijf mL IMDM-medium voor in een 15 mL buis. Ontdooi de bevroren PB MNC's snel in een waterbad van 37 °C voordat u ze overbrengt naar de buis met IMDM-medium.Centrifugeer het monster bij 400 x g gedurende vijf tot tien minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de celpellet in erytroïd medium. Tel daarna de cellen onder een microscoop met behulp van een hemocytometer.Kweek vervolgens de PB MNC's in een niet-tissue-culture-behandelde zes-wells plaat met twee mL medium per well bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Voeg op dag drie en dag vijf één mL vers erytroïde medium direct toe aan elke well zonder het medium te vervangen. Oogst op dag zes de PB MNC's voor nucleofectie.Voorcoat de weefselkweek-behandelde six-well plaat één dag voor de nucleofectie met 0,1% gelatine gedurende 20 minuten bij 37 °C. Ontdooi de geïnactiveerde MEF-feedercellen in een waterbad van 37 °C en breng ze direct over in een 15 mL buis met vijf mL MEF-medium. Centrifugeer ze vervolgens gedurende vijf minuten bij 400 x g en verwijder het supernatant.Verwijder vervolgens de gelatine uit de six-wellplaat en resuspendeer de celpellet in MEF-medium. Zaai daarna de geïnactiveerde MEF-cellen in twee mL MEF-medium in elke well van een met gelatine voorbehandelde six-wellplaat en kweek ze bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Zuig op de dag van de nucleofectie het MEF-medium af en vervang dit door één mL erytroïde medium.Pre-equilibreer vervolgens de kweekplaat gedurende 10-30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Voeg twee microgram PEV OCT4 tot Sox2, één microgram PEV MYC, één microgram PEV KLF4 en 0,5 microgram PEV Bcl-XL toe in een steriele buis van 1,5 mL. Verhit de buis vijf minuten bij 50 °C om contaminatie te voorkomen en laat deze vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur.Voeg vervolgens 57 µL nucleofectiebuffer en 13 µL supplementbuffer toe aan het monster. Oogst 2 x 10⁶ gekweekte PBMNC's in een buis van 5 mL door centrifugatie bij 200 x g gedurende zeven minuten. Verwijder daarna het supernatant en voeg het mengsel van plasmide en nucleofectiebuffer toe aan de celpellet.Meng vervolgens goed door met een vinger tegen de buis te tikken. Breng daarna het DNA in de cel-suspensie over naar de cuvette die bij de kit is geleverd en sluit de cuvette af. Selecteer programma U-008 op het nucleofectie-apparaat.Plaats vervolgens de cuvette in de houder en druk op OK. Haal daarna de cuvette uit de houder. Voeg 0,5-1 mL voorverwarmd erytroïd medium toe aan elke cuvette en breng de cellen onmiddellijk over naar de vooraf geëquilibreerde MEF-plaat. Bij sommige monsters kunnen duizenden kolonies uit één ml bloed voortkomen.Als u een enkele kolonie wilt selecteren voor verdere kweek, is het mogelijk dat u één extra put moet zaaien met slechts 1 miljoen cellen. Schud de hypoxiekamer voorzichtig enkele keren vlak voordat u deze in de incubator plaatst, om een gelijkmatige verdeling van de cellen in de kweekputten te creëren. Plaats de plaat vervolgens in een hypoxiekamer.Spoel de kamer één tot twee minuten door met een gasmengsel met een snelheid van 20 Liter per minuut. Sluit daarna de kamer af en kweekHet monster bij 37 graden Celsius. Voeg op dag twee na de nucleofectie twee mL iPSC-medium direct toe aan elke put.Verwijder op dag vier na nucleofectie drie mL medium en voeg twee mL vers iPSC-medium toe. In dit stadium zijn de meeste levende cellen gehecht aan de feederlaag. Ververs na dag zes na nucleofectie het medium elke twee dagen door 500 µL verbruikt medium achter te laten en twee mL vers E8-medium toe te voegen, aangevuld met 0,25 mM natriumbutyraat, tot dag 14-18.Hier wordt een schema van het protocol voor het herprogrammeren van perifere bloedcellen getoond. Deze afbeelding toont de AP die in de kom staat, en deze afbeelding toont een typische ESC-achtige iPSC-kolonie op dag 14 na nucleofectie van PB MNC's. Hier zijn representatieve FACS-diagrammen van iPSC's bij passage vijf die TRA-1-60 of SSEA4 tot expressie brengen.Hier zijn de representatieve confocale beelden van iPSC-kolonies die NANOG en OCT4 tot expressie brengen. De beelden hier tonen de H&E-kleuring van een teratoom, bestaande uit alle drie de kiemlagen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u integratievrije iPS-cellen kunt genereren uit mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed.Zodra de methode beheerst is, kunnen er in drie weken grote hoeveelheden iPS-cellen worden gegenereerd, waarbij de effectieve werktijd minder dan drie uur bedraagt. We hebben een eenvoudig, episomaal vectorsysteem ontwikkeld voor efficiënte herprogrammering van bloedcellen. Wij geloven dat dit betaalbare systeem gemakkelijk kan worden overgenomen, in het bijzonder in kleine laboratoria met beperkte middelen.Vergeet niet dat het werken met menselijk bloed en plasma gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en laboratoriumjassen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

generation-integration-free-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Leer een efficiënte methode om integratie-vrije iPS-cellen te genereren uit menselijk perifeer bloed met behulp van episomale vectoren. Dit protocol ondersteunt stamcelonderzoek en regeneratieve geneeskunde.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors (Video) | JoVE Journal

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Meer video's verkennen