Modulazione da analisi di inibitore HDAC genoma di microRNA e mRNAs in B le cellule indotte a sottoporsi switch classe DNA ricombinazione e differenziazione delle cellule di Plasma

L'obiettivo generale di questo esperimento è indurre i linfociti B a subire il passaggio di classe degli anticorpi e la differenziazione in cellule plasmatiche, analizzando la modulazione e la regolazione epigenetica tramite l'espressione di mRNA dell'inibitore dell'HDAC e di microRNA nelle cellule B. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della risposta anticorpale delle cellule B, come ad esempio la modulazione epigenetica del passaggio di classe delle immunoglobuline e della differenziazione in cellule plasmatiche. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire un metodo semplice per modulare le funzioni delle cellule B e definire le alterazioni dei microRNA e degli mRNA indotte da regolatori epigenetici.

Dopo aver soppresso un topo C57BL6J specific pathogen-free e aver sterilizzato la cute secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare pinze e forbici da dissezione autoclavate per tagliare la cute appena al di sotto della gabbia toracica, in modo da visualizzare la milza sul lato sinistro dell'addome, appena sotto il fegato. Stringere delicatamente la milza e recidere tutti i tessuti connettivi prima di estrarre l'organo. Successivamente, posizionare la milza in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1.000 microlitri di mezzo RPMI 1640 completo.

Successivamente, inserire un filtro cellulare da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri in polipropilene e versare il milza dal tubo microcentrifuga sul filtro cellulare. Utilizzare la punta di un tubo conico da 15 millilitri in polipropilene per schiacciare delicatamente la milza attraverso il filtro. Quindi, con 15-20 millilitri di mezzo completo, risciacquare il filtro.

Centrifugare le cellule a 350 x G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante. Utilizzare un millilitro di tampone di lisi ACK per risospendere il pellet cellulare e incubare per un minuto.

Quindi aggiungere quattro millilitri di ACK e incubare la sospensione per rimuovere i globuli rossi dalla sospensione splenica per ulteriori quattro minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale. Poi aggiungere 25 millilitri di mezzo completo per arrestare la reazione di lisi. Centrifugare le cellule a 350 x G per cinque minuti.

Eliminare il soprannatante e aggiungere un millilitro di mezzo completo per risospendere il pellet cellulare. Quindi, utilizzando un emocitometro, contare le cellule vitali. In un tubo sterile in polistirene da cinque millilitri con fondo rotondo, preparare una sospensione cellulare di 0,25-2 millilitri contenente 1 x 10⁸ cellule per millilitro in mezzo completo.

Aggiungere siero di ratto normale al campione. Successivamente, aggiungere 50 microlitri per millilitro di cocktail di isolamento al tubo. Quindi, mescolare le cellule pipettando delicatamente su e giù due o tre volte e incubare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti.

Aggiungere 75 microlitri per millilitro di particelle magnetiche rivestite con streptavidina al tubo. Pipettare delicatamente su e giù da due a tre volte e incubare il campione a temperatura ambiente per due minuti e mezzo. Portare il volume a 2,5 millilitri utilizzando mezzo RPMI 1640 completo e pipettare delicatamente da due a tre volte per omogeneizzare.

Posizionare il tubo aperto sul magnete e incubare a temperatura ambiente per due minuti e mezzo. Quindi versare il soprannatante contenente le cellule B non modificate in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Contare le cellule utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.

Sospendere nuovamente le cellule B purificate nel mezzo RPMI 1640 completo a una concentrazione finale di 0,3 x 10 alla sesta cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere alle pozzette di una piastra a 48 pozzette un millilitro di cellule B purificate a una concentrazione di 0,3 x 10 alla sesta cellule per millilitro, 3 microgrammi per millilitro di LPS da E. coli, 5 nanogrammi per millilitro di IL4 e 0 o 500 micromoli di HDI. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 60 ore per l'analisi di QRT-PCR e il sequenziamento ad alto rendimento di mRNA e miRNA oppure per 96 ore per l'analisi di citometria a flusso.

Dopo 96 ore di coltura, staccare le cellule da ogni pozzetto aspirando e dispensando il liquido ripetutamente per diverse volte. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, utilizzando una centrifuga da banco, centrifugare le cellule a 350 x G per cinque minuti.

Quindi, eliminare il soprannatante. Preparare un cocktail di buffer HBSS e i seguenti reagenti: BSA al 1%, 0,5 nanogrammi per millilitro di anticorpo secondario coniugato capra anti-topo IgM, 0,2 nanogrammi per millilitro di anticorpo monoclonale coniugato ratto anti-topo IgG1, 0,2 nanogrammi per millilitro di anticorpo monoclonale coniugato ratto anti-topo B220, 0,2 nanogrammi per millilitro di anticorpo monoclonale ratto anti-topo CD138 coniugato PE-Cy7 e 2 nanogrammi per millilitro di 7-AAD. Incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi, utilizzare un millilitro di HBSS con il 1% di BSA per lavare le cellule. Utilizzare una centrifuga da banco per centrifugare le cellule a 1.500 x G per cinque minuti. Dopo aver eliminato il sopranatante, utilizzare 300 microlitri di HBSS con il 1% di BSA per risospendere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo in polistirene con fondo rotondo.

Coprire il tubo con carta d'alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Per eseguire l'analisi di RT-PCR quantitativa dell'mRNA, includere il trattamento con DNAse 1. Successivamente, utilizzare un kit commerciale per l'isolamento dell'RNA totale in grado di recuperare l'RNA di piccole dimensioni per estrarre l'RNA da 0,2 a 5 x 10 alla sesta cellule, seguendo le istruzioni del produttore.

Dopo la sintesi del cDNA e l'esecuzione di QRT PCR sull'mRNA, eseguire la RT PCR per microRNA utilizzando una miscela master per PCR in tempo reale con cyber green, scongelata a temperatura ambiente, composta da miscela master PCR 2x, un primer specifico per miRNA in direzione forward a 250 nanomolar e un primer reverse universale. Dopo aver preparato una miscela di reazione da 25 microlitri secondo il protocollo indicato, aggiungere aliquote da 22,5 microlitri per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 2,5 microlitri di cDNA stampo nei singoli pozzetti.

Chiudere ermeticamente la pellicola della piastra. Quindi centrifugare la piastra a 1.000 x G a temperatura ambiente per un minuto. Posizionare la piastra nel termociclatore in tempo reale e avviare il programma di ciclaggio indicato nel protocollo scritto.

Utilizzando il protocollo dimostrato in questo video, le cellule B purificate incubate senza PS NIL4 per 96 ore possono indurre una ricombinazione di classe (CSR) verso IgG1 del 30-40% e una differenziazione in cellule plasmatiche di circa il 10%. Dopo il trattamento con HDI, la CSR verso IgG1 diminuisce al 10-20%, mentre la differenziazione in cellule plasmatiche si riduce a circa il 2%. L'inibizione della CSR mediata da HDI è stata ulteriormente confermata dalla riduzione del numero di trascritti post-ricombinazione I mu C gamma 1 e di trascritti maturi VHDJH C gamma 1. Come misurato mediante QRT-PCR, l'espressione di Aicda, fondamentale per CSR e SHM, e di Prdm1 e Xbp1, importanti per la differenziazione in cellule plasmatiche, è risultata inibita dal VPA.

Come misurato mediante sequenziamento dell'mRNA di linfociti B stimolati senza PS Nil4, solo lo 0,3% di questi mRNA altamente espressi è stato upregolato dall'HDI di oltre due volte e solo lo 0,36% degli mRNA altamente espressi, inclusi Aicda, Prdm1 e Xbp1, è stato ridotto dall'HDI di oltre il 50%. L'analisi del profilo di miRNA mediante sequenziamento di miRNA in linfociti B trattati con HDI o Nil ha mostrato che gli HDI upregolano selettivamente i miRNA che bersagliano Aicda e Prdm1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore e mezza-cinque ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere un ambiente di lavoro sterile.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre le cellule B a subire il cambio di classe e la differenziazione in plasmacellule, nonché di come modulare queste funzioni mediante regolatori epigenetici.