Name: Modulazione da analisi di inibitore HDAC genoma di microRNA e mRNAs in B le cellule indotte a sottoporsi switch classe DNA ricombinazione e differenziazione delle cellule di Plasma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Scopri come analizzare la modulazione epigenetica dello switch di classe degli anticorpi e della differenziazione delle cellule plasmatiche nei linfociti B utilizzando inibitori HDAC e sequenziamento ad alta portata.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni AI 105813 e AI 079705 (per PC), l'Alleanza per l'identificazione di Target di ricerca Lupus in Lupus Grant ALR 295955 (per PC) e la ricerca di artrite National Research Foundation concedere (HZ). TS è stato sostenuto dal centro medico pediatria, secondo Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Cina, nell'ambito del programma di visita di studente di medicina Xiangya-UT School di medicina San Antonio.

il protocollo segue le linee guida di cura degli animali di The Animal Care istituzionali e commissioni di utilizzo della University of Texas Health Science Center a San Antonio.
 1. stimolazione di cellule di B del topo per CSR, la differenziazione delle cellule di Plasma e HDI trattamento <ol><li>preparazione delle sospensioni di cellule di milza Nota: eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare ad eccezione del mouse eutanasia e dissezione.
	<ol><li>Euthanize gli specifici esenti da patogeni C57BL/6J mouse (8-12 settimane di età) per inalazione di CO 2.</li>
		<li>Pone il mouse sulla scheda di dissezione con l'addome rivolto verso l'alto. Perno di tutti e quattro i piedi del mouse con gli aghi ipodermici di 1.5 - in calibro 18,.</li>
		<li>Sterilizzare la pelle uso salviettine imbevuto di etanolo 70%.</li>
		<li>Utilizzare un set di strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave (pinze e le forbici per dissezione) per tagliare attraverso la pelle appena sotto la gabbia toracica per visualizzare la milza (sul lato sinistro dell'addome, appena sotto il fegato).</li>
		<li>Utilizzare un altro pinze sterili e le forbici per estrarre la milza, che si trova sotto la curvatura maggiore dello stomaco, milza di bloccaggio delicatamente con le pinzette e tagliando fuori tutto il tessuto di collegamento con la dissezione. Assicurarsi di rimuovere tutto il tessuto comunicante.</li>
		<li>Posizionare la milza in un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1.000 µ l di terreno di RPMI1640 completo (medium RPMI 1640 supplementato con 10% inattivati siero fetale del vitello (FBS), 2 mM L-Glutammina, 100 µ g/mL di penicillina, 100 µ g/mL streptomicina, 0,25 µ g/mL di amfotericina B e 50 µM β-mercaptoetanolo).</li>
		<li>Mettere un colino di cella di 70 µm in una provetta da centrifuga a fondo conico in polipropilene da 50 mL e versare la milza dal tubo del microcentrifuge sul filtro delle cellule. Usare la punta di un tubo di polipropilene centrifuga a fondo conico da 15 mL per schiacciare delicatamente la milza attraverso il colino. Sciacquare il filtro cella con 15-20 mL di terreno completo.</li>
		<li>Spin-down le cellule a 350 x g per 5 min e scartare il supernatante.</li>
		<li>Rimuovere i globuli rossi da sospensioni di cellule di milza. Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi ACK (5ml per milza). Incubare per 4 min a temperatura ambiente con agitazione occasionale e poi placare con 25 mL di terreno completo.</li>
		<li>Spin giù le cellule a 350 x g per 5 min e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 o 10 mL di terreno completo. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro.</li>
	</ol></li> <li>B-cella di isolamento Nota: B isolare cellule di selezione negativa dopo il produttore &#39; s istruzioni. Le cellule non-B sono mirate per la rimozione con anticorpi biotinilati contro cellule non-B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) e TER119) e particelle magnetiche rivestite con streptavidina.
	<ol><li>Preparare una sospensione di cellule 0,25 a 2 mL di 1 x 10 8 cellule/mL in terreno completo in un polistirolo sterile 5 mL (12 x 75 mm) tubo tondo-fondo. Aggiungere siero normale di ratto (50 µ l/mL) nell'esempio.</li>
		<li>Isolamento di aggiungere 50 µ l/mL cocktail al campione. Miscelare le cellule pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte e incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere particelle magnetiche rivestite con streptavidina µ l/mL 75 al campione. Mescolare la miscela pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte e incubare per 2,5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere terreno completo RPMI 1640. Mescolare le cellule pipettando delicatamente su e giù per 2 - 3 volte.</li>
		<li>Inserire il tubo (senza coperchio) il magnete e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 2,5 Pour il sovranatante contenente cellule B intatte in una provetta conica da 15 mL nuova.</li>
		<li>Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e macchia blu di Trypan. Valutare la purezza delle cellule di B dall'analisi di citometria a flusso degli indicatori della superficie delle cellule di B, come B220 e CD19.</li>
	</ol></li> <li>Stimolazione B-cellula e trattamento HDI <ol><li>risospendere le cellule B purificate in terreno completo RPMI 1640 ad una concentrazione finale di 0,3 x 10 6 cellule/mL.</li>
		<li>Utilizzare una piastra di coltura cellulare 48 pozzetti per colture cellulari. Per ogni bene, aggiungere 1 mL di sospensione di cellule B purificata (0,3 x 10 6 cellule/mL), LPS (concentrazione finale di 3 µ g/mL) da Escherichia coli, IL-4 (concentrazione finale di 5 ng/mL) e 0 o 500 µM HDI (acido valproico; VPA).</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 60 h per qRT-PCR e l'analisi del mRNA e miRNA sequenziamento high throughput o 96 h per analisi di citometria a flusso.</li>
	</ol></li> <li>Flusso cytometry analisi della RSI e la differenziazione delle cellule di plasma <ol><li>dopo 96 h di cultura, staccare le cellule da ogni pozzetto pipettando le celle su e giù più volte. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Rotazione verso il basso le cellule a 350 x g per 5 min utilizzando una centrifuga di banco e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule con 100 µ l di tampone HBSS contenente BSA 1% e 0,5 ng/mL della fluorescina (FITC) - capra coniugato anti IgM – anticorpo (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-ratto coniugati anti-topo IgG1 Anticorpo monoclonale (mAb), ficoeritrina di 0,2 ng/mL (PE)-coniugato ratto anti-topo B220 mAb, 0,2 ng/mL del ratto PE-Cy7-coniugato anti-topo CD138 mAb e 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).</li>
		<li>Incubare le cellule con anticorpi coniugati a fluorescenza (punto 1.4.2) al buio a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Lavare le cellule con 1 mL di HBSS con BSA 1%.</li>
		<li>Spin-down le cellule a 1.500 x g per 5 min utilizzando una centrifuga da banco e scartare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 300 µ l di HBSS con BSA 1% e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di polistirene di turno-fondo. Coprire il tubo con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.</li>
		<li>Eseguire analisi di citometria a flusso su una sospensione unicellulare. Raccogliere 50.000 eventi per ciascun campione di compensazione e 250.000 eventi per altri campioni. Analizzare i dati utilizzando attrezzature software.</li>
		<li>Eliminare i detriti e doppietti tramite un cancello di geometria di impulso (FSC-H x FSC-A e SSC-H x SSC-A). Cancello in modo appropriato la trama su 7-AAD per escludere le cellule morte.</li>
	</ol></li></ol> 2. High-Throughput mRNA-Seq <ol><li>dopo 60 h di cultura, estratto il RNA totale da 2-4 × 10 6 celle utilizzando un kit di isolamento di RNA totale che può recuperare il piccolo RNA seguendo il produttore &#39; s istruzioni. Includere una dnasi io passo trattamento.</li>
	<li>Verificare l'integrità di RNA con un bioanalyzer, seguendo il produttore &#39; istruzioni s.</li>
	<li>Utilizzare 500-1.000 ng di RNA totale di alta qualità (numero di RNA integrità RIN &#62; 8.0) per RNA-seq preparazione libreria con un RNA commerciale campione pkit Rep seguendo il produttore &#39; istruzioni s.</li>
	<li>Piscina le librerie di singoli mRNA-seq sulla loro parti rispettive 6-bp indice delle schede di base e le librerie a 50 bp/sequenza di sequenza. Utilizzare un sistema di DNA di alto-rendimento secondo il produttore &#39; protocolli di s.</li>
	<li>Dopo l'esecuzione di sequenziamento, demultiplex con CASAVA per generare il file fastq per ciascun campione. Eseguire letture di mappatura e l'analisi bioinformatica, come precedentemente descritto 11.</li>
	<li>Allineare tutte le letture di sequenziamento con loro genomi di riferimento (UCSC mouse genome compilazione mm9) utilizzando TopHat2 predefinito impostazioni 14. Elaborare i file bam dall'allineamento utilizzando HTSeq-conteggio per ottenere i conteggi al gene in tutti i campioni.</li>
</ol> 3. High-Throughput miRNA-Seq <ol><li>uso 100 ng-1 µ g di RNA totale di alta qualità, preparata nel passaggio 2.1, per piccoli RNA-seq preparazione di libreria utilizzando un kit commerciale piccolo RNA-seq.</li>
	<li>Legano il degenerato 3 &#39; adattatore sul 5 &#8242; estremità di partenza le piccole molecole di RNA con un kit commerciale legatura. Legare il degenerato 5 &#39; adattatore sul 3 &#8242; estremità di partenza le piccole molecole di RNA con un kit commerciale legatura. Convertire il RNA in cDNA da trascrizione d'inversione e amplificare la piccola biblioteca di RNA-seq dall'amplificazione di PCR con kit commerciali.</li>
	<li>Usa un gel di pagina 6% nativo di TBE per isolare la piccola biblioteca di RNA-seq finale. Esegua il gel con 1 tampone di X TBE a 200 V, fino a quando la band di bromofenolo tracciante si avvicina alla parte inferiore del gel (0,5 - 1 cm).</li>
	<li>Rimuovere il gel dalle lastre di vetro e macchia con etidio bromuro (0,5 µ g/mL in acqua) in un contenitore pulito per un minimo di 2-3 Visualize fasce per il gel su un transilluminatore UV o un altro strumento di documentazione gel.</li>
	<li>Tagliare fuori la band ~ 150-bp utilizzando un rasoio pulito e metterlo in una provetta 1,7 mL.</li>
	<li>Estrarre DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Verifica la distribuzione delle dimensioni della biblioteca finale con un dosaggio di DNA di alto-sensibilità commerciale e la concentrazione con un dosaggio di dsDNA commerciale per i produttori &#39; istruzioni.</li>
	<li>Piscina le librerie per amplificazione e un ordinamento successivo eseguito con un sistema di sequenziamento di DNA ad alta velocità commerciale per il produttore &#39; protocolli di s.</li>
	<li>Demultiplex con CASAVA per generare il file fastq per ciascun campione per il produttore &#39; protocolli di s.</li>
	<li>Per piccoli RNA-seq analisi di ciascun campione, utilizzare Flicker per l'allineamento per il produttore piccolo-RNA &#39; protocolli di s.
	<ol><li>Rimuovere letture che sono allineate agli agenti inquinanti, come i mitocondri, rRNA, primer e così via.</li>
		<li>Allineare i dati in modo maturo sequenze miRNA.</li>
		<li>Allineamento dei dati alle sequenze di ciclo tornante (precursore miRNA).</li>
		<li>Allineare i dati di altri piccoli RNA sequenze (utilizzando il database di fRNA) 15.</li>
	</ol></li> <li>Dopo tutti i campioni sono quantificati, definire i miRNA espressi differenziali tra diversi gruppi/campioni. Prevedere i miRNA che target selezionato mRNAs o mRNAs che possa essere la destinazione di un miRNA selettivo utilizzando strumenti di previsione di destinazione miRNA online, ad esempio TargetScan 16, microcosmo 17 e PicTar 18 .</li>
	<li>Se è necessaria l'analisi funzionale di annotazione o pathway, presentare geni predetti per analisi dei percorsi di ingegno (IPA) o DAVID.</li>
</ol> 4. RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) del mRNA e Mirna <ol><li>qRT-PCR analisi del mRNA <ol><li>estrarre RNA da 0.2-5 × 10 6 celle utilizzando un kit di isolamento del RNA commerciale per totale che può recuperare il piccolo RNA, seguendo il produttore &#39; s istruzioni. Includere una dnasi io passo trattamento.</li>
		<li>Sintetizzare cDNA da RNA totale con un sistema di sintesi del cDNA del primo-filo con primer oligo-dT.</li>
		<li>Quantificare cDNA mediante qRT-PCR con primer appropriato, utilizzando 2 x mix master di Real-Time PCR con il seguente protocollo: 95 ° C per 15 s, 40 cicli di 94 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s.</li>
		<li>Effettuare l'acquisizione di dati durante la fase di estensione 72 ° C ed eseguire analisi della curva di fusione da 72 a 95 ° C.</li>
	</ol></li> <li>analisi di miRNA qRT-PCR <ol><li>Aliquot RNA dai campioni preparati al punto 4.1.1.</li>
		<li>Reverse-trascrivere il RNA nel cDNA. Utilizzare un kit di trascrizione inversa commerciale microRNA, seguendo il produttore &#39; istruzioni s.</li>
		<li>Eseguire PCR in tempo reale per microRNA usando un mix master di PCR in tempo reale SYBR Green con 250 nM miRNA maturo avanti gli iniettori in combinazione con un primer universale inverso.
		<ol><li>Disgelo 2 x PCR Master Mix, miRNA specifici primer forward e reverse universal primer a temperatura ambiente. Mescolare le soluzioni individuali.</li>
			<li>Preparare una miscela di reazione come segue per un volume di reazione di 25 µ l per pozzetto (utilizzato in piastre da 96 pozzetti PCR): 2 x PCR Master Mix 12,5 µ l miRNA forward primer (2,5 μM) 2,5 µ l Universal reverse primer (2,5 μM) 2,5 µ l RN ASE-libero acqua5 µ l</li> <li>aggiungere 22.5 μL di miscela di reazione per una piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 2,5 µ l di modello cDNA (50 ng pg-3) singola piastra pozzetti.</li>
			<li>Sigillare ermeticamente il film piatto. Centrifugare la piastra per 1 min a 1.000 x g e a temperatura ambiente.</li>
			<li>Mettere la piastra il ciclatore in tempo reale e cominciare il seguente programma ciclismo: 95 ° C per 5 min, 40 cicli di 94 ° C per 15 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s.</li>
		</ol></li> <li>Utilizzare il metodo ΔΔCt per l'analisi di dati di qRT-PCR con un foglio di calcolo. Normalizzare l'espressione dei miRNA rilevanti per l'espressione del piccolo nucleare/nucleolar RNA Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 e Snord70/SNORD70.</li>
	</ol></li> <li>Analisi statistica <ol><li>eseguire analisi statistica per determinare i valori di p a accoppiato e spaiati studente &#39; s t - test utilizzando un foglio di calcolo e considerare i valori di p &#60; 0,05 come significativo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643790">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).</li>
<li>Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+Peripheral+B-Cell+Differentiation+and+the+Antibody+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response.</a> Front Immunol. 6, 631(2015).</li>
<li>Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+class-switch+DNA+recombination%3A+induction%2C+targeting+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).</li>
<li>White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+upregulate+B+cell+microRNAs+that+silence+AID+and+Blimp-1+expression+for+epigenetic+modulation+of+antibody+and+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses.</a> J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).</li>
<li>Farh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+fine+mapping+of+causal+autoimmune+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants.</a> Nature. 518, 337-343 (2015).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+selective+modulation+of+microRNAs+and+mRNAs+by+histone+deacetylase+inhibitor+in+B+cells+induced+to+uUndergo+class-switch+DNA+recombination+and+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation.</a> Front. Immunol. 6, 627(2015).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Kin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fRNAdb%3A+a+platform+for+mining%2Fannotating+functional+RNA+candidates+from+non-coding+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((doRiNA%3A+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo protocollo fornisce gli approcci completi per indurre switching di classe B delle cellule e differenziazione delle cellule di plasma; per analizzare l'impatto di modulatori epigenetici, vale a dire HDI; e per rilevare l'effetto di HDI sull'espressione del mRNA e miRNA in queste cellule. La maggior parte di questi approcci è utilizzabile anche per analizzare l'impatto del fattore epigenetico sull'espressione di funzione e mRNA/miRNA B-cellula umana. Per analizzare le cellule B isolate da topi trattati con modulator...

Segni epigenetici o fattori, quali la metilazione del DNA, modificazioni post-traduzionali degli istoni e RNA non codificanti (compresi i microRNA), modulano la funzione delle cellule alterando gene expression1. Modificazioni epigenetiche regolano la funzione dei linfociti B, come ricombinazione di immunoglobulina classe-interruttore del DNA (CSR), ipermutazione somatica (SHM) e differenziazione di cellule B memoria o le cellule di plasma, quindi modulando l'anticorpo e autoanticorpi le risposte2,3. CSR e SHM criticamente richiedono indotta da attivazione citidina deaminasi (aiuti, codificato come Aicda), che è altamente indotta in cellule di B in risposta a T-dipendente e di antigeni T-indipendenti4. Cellule di B di classe-acceso/hypermutated ulteriormente differenziano in cellule di plasma, che secernono grandi quantità di anticorpi in modo criticamente dipendente da proteina di maturazione dei linfociti B-indotta 1 (Blimp1, codificato come Prdm1)5. I cambiamenti epigenetici anormali in cellule di B possono provocare risposte aberranti anticorpo/autoanticorpi, che possono portare alla risposta allergica o autoimmunità1,4. Comprendere i fattori epigenetici come, ad esempio Mirna, modulano intrinseco delle cellule B espressione genica non è solo importante per lo sviluppo di vaccini, ma è anche essenziale per rivelare i meccanismi delle potenziali risposte anormali dell'anticorpo/autoanticorpi.
Deacetilazione e acetilazione dell'istone sono modifiche dei residui di lisina su proteine istoniche in genere catalizzate da istone acetiltransferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Queste modifiche portano all'accessibilità crescente o decrescente della cromatina e ulteriormente consentono o impediscono il legame di fattori di trascrizione o proteine a DNA e l'alterazione del gene espressione5,6, 7 , 8. gli inibitori HDAC (HDI) sono una classe di composti che interferiscono con la funzione di HDAC. Qui, abbiamo usato HDI (VPA) per affrontare il regolamento di HDAC sul profilo di espressione genica intrinseco delle cellule B e sul suo meccanismo.
Mirna sono piccole, non-codificazione RNAs circa 18 a 22 di nucleotidi di lunghezza generati attraverso diverse fasi. geni ospitanti miRNA sono trascritti e formano tornante microRNA primario (pri-miRNA). Sono esportati nel citoplasma, dove pri-miRNA sono ulteriormente trasformati in precursore Mirna (pre-miRNA). Infine, Mirna maturi si formano attraverso la scissione dei pre-miRNA. Mirna riconoscono le sequenze complementari all'interno della regione non tradotta 3' della loro destinazione mRNAs6,7. Attraverso silenziamento post-trascrizionale, Mirna regolano l'attività cellulare, quali proliferazione, differenziamento e apoptosi10,11. Poiché più miRNA possono avere come bersaglio mRNA della stessa, e un singolo miRNA potenzialmente può avere come bersaglio mRNA multipli, è importante avere una vista nel contesto del profilo di espressione di miRNA a comprendere il valore dell'individuo e l'effetto collettivo di Mirna. i miRNA sono stati indicati per essere coinvolti in sviluppo della B-cellula e differenziazione periferica, così come B-differenziamento fase-specifici, risposta anticorpale e autoimmunità1,4,9. Nel 3' UTR di Aicda e Prdm1, ci sono diversi siti previsti o convalidati evolutivamente conservati che possono essere la destinazione di Mirna8.
Modulazione epigenetica, tra cui modifica post-trascrizione dell'istone e Mirna, visualizzare un modello di regolamento fase-specifici delle cellule e cellula-tipo di gene espressione9. Qui, descriviamo i metodi per definire la modulazione HDI-mediata di miRNA ed espressione di mRNA, CSR e differenziazione delle cellule di plasma. Questi includono protocolli per indurre le cellule di B per subire la CSR e la differenziazione delle cellule di plasma; per il trattamento delle cellule di B con HDI; e per l'analisi di espressione di miRNA e mRNA da qRT-PCR, miRNA-seq e mRNA-seq10,11,12,8,13.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X con L-Glutammina (Dimensioni: 6 x 500mL; Con L-glutammina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT 10-040-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH300</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Soluzione Antibiotica Antimicotica 100 mL</td><td>Fisher Scientific - Hyclone</td><td>SV3007901&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-420-3250ML</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari di falco</td><td>Fisher Scientific</td><td>21008-952&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tintura blu di tripano 0,04%</td><td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampone di lisi&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW10-548E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Bright-Line Hausser Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in polistirene a fondo tondo Falcon con tappo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule B del topo EasySep</td><td>Stem Cell Tech</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>BD Ago Solo 18 Calibro 1,5 pollici SHORT BEVEL 100/box&nbsp;</td><td>BD Bioscienze</td><td>&nbsp; </td><td></td>305199</tr><tr><td>PE/Cy7 anti-topo CD138 (Syndecan-1) Anticorpo</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>142513 (25 ug)</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 B220 anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD (1 mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo/umano CD45R/B220 anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td></td></tr><tr><td>Topo APC-IgG1 200 &; g</td><td>Biolegend</td><td>406610</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgM anti-topo FITC</td><td>Biolegend</td><td>406506</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo FITC anti-topo/umano CD45R/B220</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-umano/Topo CD45R (B220) (RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-21-022-CM</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina, frazione V, Shock termico trattato&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>LPS 25mg (Lipopolisaccaridi da Escherichia coli 055:B5)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2880-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ricombinante IL-4 (senza carrier)</td><td>BioLegend</td><td>574302 (formato: 10 ug)</td><td></td></tr>Sale <tr><td>sodico di acido valproico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD e3 Classe II Tipo A2 Cabina di biosicurezza</td><td>The Baker Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore CO2 ad alta capacità&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Bagni d'acqua a controllo digitale: Modello 205</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5Q</td><td></td></tr><tr><td>5mL Provetta in polistirene a fondo tondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga Corning CentriStar da 15 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-538-59A</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta da 1,7 mL, trasparente</td><td>Genesee</td><td>22-282</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga in plastica Easy Reader ad alta velocità 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>ELMI SkySpin CM-6MT</td><td>ELMI</td><td>CM-6MT</td><td></td></tr><tr><td>Rotore 6M</td><td>ELMI</td><td>6M</td><td></td></tr><tr><td>Rotore 6M.06</td><td>ELMI</td><td>6M.06</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette sierologiche da 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette sierologiche da 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette sierologiche da 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>898130-896</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 48 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco Allegra 6,</td><td>coltro Beckman</td> non refrigerato <td>366802</td><td></td></tr><tr><td>rotore GH-3.8A, orizzontale, ARIES Smart Balance</td><td>Coltro Beckman</td><td>366650</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco Allegra 25R,</td><td>coltro Beckman</td> refrigerato <td>369434</td><td></td></tr><tr><td>rotore TA-15-1.5,</td><td>coltro Beckman</td> ad angolo fisso <td>368298</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Miscelatore a vortice analogico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio (circa 0,75% di etanolo come conservante/biologia molecolare)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Set di DNA senza RNAsi (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spettrofotometri</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Sistema di sintesi del primo filamento RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>175013897</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Piastre PCR semi-bordate a 96 pozzetti, confezione da 25</td><td></td> Fisher <td>14-230-244</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Guarnizioni adesive</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ Optics Module</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9744</td><td></td></tr><tr><td>iCycler Chassis</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8701</td><td></td></tr><tr><td>Kit ottico</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9752</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di citometria a flusso BD LSR II BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>S200 Ultrasuoni focalizzati</td><td>Covaris</td><td>S200</td><td></td></tr><tr><td>SPRIworks Sistema di libreria di frammenti I per Illumina</td><td>Beckman Coulter</td><td>A288267</td><td></td></tr><tr><td>cBot Cluster Generation Station</td><td>illumina</td><td>SY-312-2001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Sequenziatore del genoma</td><td>Illumina</td><td>SY-401-1001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di RNA TruSeq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di RNA piccoli TruSeq</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Small Kit di sequenziamento dell'RNA v3</td><td>Bioo Scientific</td><td>5132-05</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td></td></tr></tbody></table>

modulazione da analisi di inibitore hdac genoma di microrna e mrnas in b le cellule indotte a sottoporsi switch classe dna ricombinazione e differenziazione delle cellule di plasma

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Risposte anticorpali sono compiute attraverso diversi processi critici intrinseco delle cellule B, tra cui hypermutation somatico (SHM), classe-interruttore ricombinazione del DNA (CSR) e la differenziazione delle cellule di plasma. Negli ultimi anni, delle modificazioni epigenetiche o fattori, quali la deacetilazione degli istoni e microRNA (Mirna), hanno dimostrati di interagire con programmi genetici delle cellule di B di risposte anticorpali di forma, mentre la disfunzione dei fattori epigenetici è stata trovata per portare a risposte degli autoanticorpi. L'analisi di espressione di miRNA e mRNA di genoma in cellule di B in risposta a modulatori epigenetici è importante per comprendere la regolazione epigenetica della risposta di funzione e dell'anticorpo di B-cell. Qui, dimostriamo un protocollo per indurre le cellule B per subire la differenziazione di CSR e delle cellule di plasma, il trattamento di queste cellule di B con gli inibitori dell'istone deacetilasi (HDAC) (HDIs) e l'analisi di espressione di mRNA e microRNA. In questo protocollo, analizziamo direttamente sequenze complementari di DNA (cDNA) mediante sequenziamento di nuova generazione mRNA (mRNA-seq) e tecnologie di miRNA-seq, mappatura della sequenziazione legge al genoma e trascrizione d'inversione quantitativa (qRT)-PCR. Con questi approcci, abbiamo definito che, in cellule di B indotte per subire la CSR e la differenziazione delle cellule di plasma, HDI, un regolatore epigenetico, selettivamente modula l'espressione di mRNA e miRNA e altera la differenziazione di CSR e delle cellule di plasma.

Utilizzando il nostro protocollo, purificato le cellule B disposto con LPS (3 µ g/mL) e IL-4 (5 ng/mL) per 96 h può indurre il 30-40% della RSI a IgG1 e ~ 10% di differenziazione delle cellule di plasma. Dopo il trattamento con HDI (VPA 500 µm), la RSI a IgG1 è diminuito a 10-20%, mentre la differenziazione delle cellule di plasma è diminuito a ~ 2% (nella figura 1). HDI-ha mediato l'inibizione della RSI è stato ulteriormente confermato da un numero in diminuzione di post...

I fattori epigenetici possono interagire con programmi genetici di modulare l'espressione genica e regolare la funzione delle cellule B. Combinando la stimolazione in vitro delle cellule di B, qRT-PCR e microRNA-sequenza di alto-rendimento e sequenza di mRNA approcci, possiamo analizzare la modulazione epigenetica di miRNA e l'espressione genica in cellule di B.

Modulazione da analisi di inibitore HDAC genoma di microRNA e mRNAs in B le cellule indotte a sottoporsi switch classe DNA ricombinazione e differenziazione delle cellule di Plasma

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è indurre i linfociti B a subire il passaggio di classe degli anticorpi e la differenziazione in cellule plasmatiche, analizzando la modulazione e la regolazione epigenetica tramite l'espressione di mRNA dell'inibitore dell'HDAC e di microRNA nelle cellule B. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della risposta anticorpale delle cellule B, come ad esempio la modulazione epigenetica del passaggio di classe delle immunoglobuline e della differenziazione in cellule plasmatiche. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire un metodo semplice per modulare le funzioni delle cellule B e definire le alterazioni dei microRNA e degli mRNA indotte da regolatori epigenetici.Dopo aver soppresso un topo C57BL6J specific pathogen-free e aver sterilizzato la cute secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare pinze e forbici da dissezione autoclavate per tagliare la cute appena al di sotto della gabbia toracica, in modo da visualizzare la milza sul lato sinistro dell'addome, appena sotto il fegato. Stringere delicatamente la milza e recidere tutti i tessuti connettivi prima di estrarre l'organo. Successivamente, posizionare la milza in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1.000 microlitri di mezzo RPMI 1640 completo.Successivamente, inserire un filtro cellulare da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri in polipropilene e versare il milza dal tubo microcentrifuga sul filtro cellulare. Utilizzare la punta di un tubo conico da 15 millilitri in polipropilene per schiacciare delicatamente la milza attraverso il filtro. Quindi, con 15-20 millilitri di mezzo completo, risciacquare il filtro.Centrifugare le cellule a 350 x G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante. Utilizzare un millilitro di tampone di lisi ACK per risospendere il pellet cellulare e incubare per un minuto.Quindi aggiungere quattro millilitri di ACK e incubare la sospensione per rimuovere i globuli rossi dalla sospensione splenica per ulteriori quattro minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale. Poi aggiungere 25 millilitri di mezzo completo per arrestare la reazione di lisi. Centrifugare le cellule a 350 x G per cinque minuti.Eliminare il soprannatante e aggiungere un millilitro di mezzo completo per risospendere il pellet cellulare. Quindi, utilizzando un emocitometro, contare le cellule vitali. In un tubo sterile in polistirene da cinque millilitri con fondo rotondo, preparare una sospensione cellulare di 0,25-2 millilitri contenente 1 x 10⁸ cellule per millilitro in mezzo completo.Aggiungere siero di ratto normale al campione. Successivamente, aggiungere 50 microlitri per millilitro di cocktail di isolamento al tubo. Quindi, mescolare le cellule pipettando delicatamente su e gi&ugrave; due o tre volte e incubare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti.Aggiungere 75 microlitri per millilitro di particelle magnetiche rivestite con streptavidina al tubo. Pipettare delicatamente su e giù da due a tre volte e incubare il campione a temperatura ambiente per due minuti e mezzo. Portare il volume a 2,5 millilitri utilizzando mezzo RPMI 1640 completo e pipettare delicatamente da due a tre volte per omogeneizzare.Posizionare il tubo aperto sul magnete e incubare a temperatura ambiente per due minuti e mezzo. Quindi versare il soprannatante contenente le cellule B non modificate in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Contare le cellule utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.Sospendere nuovamente le cellule B purificate nel mezzo RPMI 1640 completo a una concentrazione finale di 0,3 x 10 alla sesta cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere alle pozzette di una piastra a 48 pozzette un millilitro di cellule B purificate a una concentrazione di 0,3 x 10 alla sesta cellule per millilitro, 3 microgrammi per millilitro di LPS da E. coli, 5 nanogrammi per millilitro di IL4 e 0 o 500 micromoli di HDI. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 60 ore per l'analisi di QRT-PCR e il sequenziamento ad alto rendimento di mRNA e miRNA oppure per 96 ore per l'analisi di citometria a flusso.Dopo 96 ore di coltura, staccare le cellule da ogni pozzetto aspirando e dispensando il liquido ripetutamente per diverse volte. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, utilizzando una centrifuga da banco, centrifugare le cellule a 350 x G per cinque minuti.Quindi, eliminare il soprannatante. Preparare un cocktail di buffer HBSS e i seguenti reagenti: BSA al 1%, 0,5 nanogrammi per millilitro di anticorpo secondario coniugato capra anti-topo IgM, 0,2 nanogrammi per millilitro di anticorpo monoclonale coniugato ratto anti-topo IgG1, 0,2 nanogrammi per millilitro di anticorpo monoclonale coniugato ratto anti-topo B220, 0,2 nanogrammi per millilitro di anticorpo monoclonale ratto anti-topo CD138 coniugato PE-Cy7 e 2 nanogrammi per millilitro di 7-AAD. Incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi, utilizzare un millilitro di HBSS con il 1% di BSA per lavare le cellule. Utilizzare una centrifuga da banco per centrifugare le cellule a 1.500 x G per cinque minuti. Dopo aver eliminato il sopranatante, utilizzare 300 microlitri di HBSS con il 1% di BSA per risospendere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo in polistirene con fondo rotondo.Coprire il tubo con carta d'alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Per eseguire l'analisi di RT-PCR quantitativa dell'mRNA, includere il trattamento con DNAse 1. Successivamente, utilizzare un kit commerciale per l'isolamento dell'RNA totale in grado di recuperare l'RNA di piccole dimensioni per estrarre l'RNA da 0,2 a 5 x 10 alla sesta cellule, seguendo le istruzioni del produttore.Dopo la sintesi del cDNA e l'esecuzione di QRT PCR sull'mRNA, eseguire la RT PCR per microRNA utilizzando una miscela master per PCR in tempo reale con cyber green, scongelata a temperatura ambiente, composta da miscela master PCR 2x, un primer specifico per miRNA in direzione forward a 250 nanomolar e un primer reverse universale. Dopo aver preparato una miscela di reazione da 25 microlitri secondo il protocollo indicato, aggiungere aliquote da 22,5 microlitri per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 2,5 microlitri di cDNA stampo nei singoli pozzetti.Chiudere ermeticamente la pellicola della piastra. Quindi centrifugare la piastra a 1.000 x G a temperatura ambiente per un minuto. Posizionare la piastra nel termociclatore in tempo reale e avviare il programma di ciclaggio indicato nel protocollo scritto.Utilizzando il protocollo dimostrato in questo video, le cellule B purificate incubate senza PS NIL4 per 96 ore possono indurre una ricombinazione di classe (CSR) verso IgG1 del 30-40% e una differenziazione in cellule plasmatiche di circa il 10%. Dopo il trattamento con HDI, la CSR verso IgG1 diminuisce al 10-20%, mentre la differenziazione in cellule plasmatiche si riduce a circa il 2%. L'inibizione della CSR mediata da HDI è stata ulteriormente confermata dalla riduzione del numero di trascritti post-ricombinazione I mu C gamma 1 e di trascritti maturi VHDJH C gamma 1. Come misurato mediante QRT-PCR, l'espressione di Aicda, fondamentale per CSR e SHM, e di Prdm1 e Xbp1, importanti per la differenziazione in cellule plasmatiche, è risultata inibita dal VPA.Come misurato mediante sequenziamento dell'mRNA di linfociti B stimolati senza PS Nil4, solo lo 0,3% di questi mRNA altamente espressi è stato upregolato dall'HDI di oltre due volte e solo lo 0,36% degli mRNA altamente espressi, inclusi Aicda, Prdm1 e Xbp1, è stato ridotto dall'HDI di oltre il 50%. L'analisi del profilo di miRNA mediante sequenziamento di miRNA in linfociti B trattati con HDI o Nil ha mostrato che gli HDI upregolano selettivamente i miRNA che bersagliano Aicda e Prdm1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore e mezza-cinque ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere un ambiente di lavoro sterile.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre le cellule B a subire il cambio di classe e la differenziazione in plasmacellule, nonché di come modulare queste funzioni mediante regolatori epigenetici.

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Modulazione da analisi di inibitore HDAC genoma di microRNA e mRNAs in B le cellule indotte a sottoporsi switch classe DNA ricombinazione e differenziazione delle cellule di Plasma (Video) | JoVE Journal

Modulazione da analisi di inibitore HDAC genoma di microRNA e mRNAs in B le cellule indotte a sottoporsi switch classe DNA ricombinazione e differenziazione delle cellule di Plasma

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