Name: Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri il metodo standardizzato per purificare le vescicole di membrana esterna di Legionella pneumophila e analizzarne l'effetto pro-infiammatorio sui macrofagi umani e murini. Questo protocollo migliora la comprensione delle interazioni ospite-patogeno.

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Ringraziamo il Prof. Dr. Markus Schnare per averci fornito TLR2 - / - e TLR2 / 4 - / - mice e Prof. Dr. Carsten Kirschning per TRIF / MyD88 - / - mice. Alcune parti di questo lavoro è stato finanziato dal Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: miRSys bio - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), e Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), tutti a BS.

1. Preparare medio e piastre di agar <ol><li> Preparare 1 l di brodo di coltura (YEB). Sciogliere 10 g di ACES e 10 g di estratto di lievito in 900 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 6,9 con KOH (5 N). Aggiungere 10 ml di L-cisteina (0,4 g in 10 mL di acqua distillata) e 10 mL di Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 mL di acqua distillata). Riempire fino a 1 L con acqua distillata e filtrare sterilizzare il (dimensione dei pori: 0,22 micron) soluzione. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare carbone tamponato estratto di lievito (BCYE) piastre di agar. Sciogliere 10 g di ACES e 10 g di estratto di lievito in 900 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 6,9 con KOH (5 N). Aggiungere 15 g di agar e 2,5 g di carbone attivo. Riempire fino a 1 L con acqua distillata e autoclave. <ol><li> Aggiungere 10 ml di L-cisteina (0,4 g in 10 mL di acqua distillata) e 10 mL di Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 mL di acqua distillata, sia sterilizzata mediante filtrazione attraverso 0,22 micronpori) a BCYE raffreddato (circa 50 ° C). Versare in piastre e conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Coltivare L. pneumophila <ol><li> Stendere L. pneumophila ceppo Corby (wild type, WT) su piastre di agar BCYE e incubare a 37 ° C per 3 giorni. Seminare 10 ml di YEB ad un diametro esterno 600 di 0,3 con L. pneumophila dalla piastra precoltura; incubare i batteri a 37 ° C su un agitatore rotante (150 rpm) per 6 ore. </li><li> Verificare la purezza della coltura liquida diffondendo 100 microlitri della sospensione su una piastra di agar sangue. Incubare per una notte a 37 ° C. </li><li> Aggiungere la coltura liquida restante 90 mL di terreno YEB fresco e incubare su un agitatore rotante (37 ° C e 150 rpm) per raggiungere un OD 600 di 3,0-3,5, che dura circa 16-20 h. </li></ol> 3. Preparare e quantificare L. pneumophila OMVS NOTA: Eseguire tutte le seguenti fase di centrifugaziones in condizioni sterili e a 4 ° C. <ol><li> Centrifugare la coltura liquida a 4.000 xg per 20 minuti per ottenere il pellet batteri. Trasferire il surnatante in provette da centrifuga freschi, scartare il pellet batterico, e ripetere la centrifugazione (4000 x g per 20 minuti). Ripetere questa operazione una sola volta. </li><li> Sterile-filter restante surnatante due volte (dimensione dei pori: 0,22 micron). Trasferire il surnatante priva di batteri ai tubi ultracentrifuga e ultracentrifuga a 100.000 xg per 3 ore. </li><li> Decantare il surnatante e gettarlo. Risospendere il pellet OMV in sterile tampone fosfato salino (PBS) e ultracentrifuge (100.000 xg per 3 h) per rimuovere le proteine ​​contaminanti e LPS. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet OMV in 500 ml di PBS sterile. Consecutive 20 microlitri su una piastra di agar sangue e su una piastra di agar BCYE escludere la contaminazione batterica delle vescicole preparati. Incubare la piastra di agar sangue durante la notte e la piastra di agar BCYE per 3 giorni (entrambe a 376; C). </li><li> Quantificare l&#39;importo proteina ottenuta dalla preparazione OMV usando un test di acido bicinconinico secondo le istruzioni del produttore. NOTA: La concentrazione di 100 ml di L. pneumophila cultura è di solito 1 mg / mL. Conservare le OMVS preparati e quantificabili a -20 ° C. </li></ol> I macrofagi 4. Pre-treat <ol><li> Preparare le cellule THP-1. NOTA: THP-1 è una linea cellulare monocitica derivata da un paziente leucemia. <ol><li> Aggiungere 2x10 5 cellule THP-1 ogni 24 pozzetti e differenziare con l&#39;aggiunta di 20 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) in cellule macrofagi-like. Incubare per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Sostituire il mezzo con 500 ml di mezzo fresco e incubare per altre 24 ore; il mezzo ottimale per cellule THP-1 è composto di RPMI 1640 alto glucosio supplementato con 10% di siero fetale di vitello. </li></ol></li><li> Isolare i macrofagi del midollo osseo murino (mBMDM), come descritto nella consultareENCE 20. </li><li> Trattare macrofagi THP-1-derivati ​​o mBMDM con OMVS. <ol><li> Scongelare i OMVS previste al punto 3 e aggiungerli in base alla loro quantità di proteine ​​(0,1, 1, e 10 mg / ml) al macrofagi murini umano o. Incubare le macrofagi con OMVS a 37 ° C per almeno 20 h. Utilizzare il surnatante per ELISA o andare avanti con il passaggio 5. </li></ol></li></ol> 5. Infettare i macrofagi e valutare replica batterica con un (CFU) Assay formanti colonia Unità <ol><li> Utilizzare L. pneumophila dal punto 2.1, pre-trattati cellule THP-1 o mBMDM dal punto 4.3, e non macrofagi pre-trattati come controlli (2x10 5/24 pozzi). Non scambiare il mezzo. </li><li> Infettare cellule THP-1 con L. pneumophila Corby WT e mBMDM con un mutante flagellin-privo di L. pneumophila Corby (entrambi con una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 pozzi) e incubare per 24 e 48 ore, rispettivamente. preparare boesimo L. pneumophila Corby (WT o flagellin-carente mutante) come descritto al punto 2.1. </li><li> Lisare le cellule nel loro mezzo mediante aggiunta di saponina (concentrazione finale: 0,1%) e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Risospendere i batteri pipettando e trasferire la sospensione in un recipiente di reazione. Preparare diluizioni seriali del pneumophila L. -contenenti media in PBS sterile. </li><li> Streak 50 ml delle diluizioni richieste su piastre di agar BCYE ed incubare per 3 giorni a 37 ° C. </li><li> Visivamente contare le colonie formate. Calcolare il CFU <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" /> Normalizzare il risultato del conteggio CFU di non pre-trattati, ma macrofagi, che sono impostati al 100% infetti. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I OMVS di batteri patogeni e l&#39;impatto di queste vescicole di membrana sulle loro cellule bersaglio sono attualmente in fase di studio intensivo. Ad esempio, Clostridium perfringens -derived OMVS inducono la secrezione di citochine nei macrofagi, linfociti B possono essere attivati da OMVS da Borrelia burgdorferi, e Helicobacter pylori -released vescicole di membrana in grado di agire sulle cellule epiteliali gastriche 21, 22, 23. L. pneumophila, un patogeno intracellulare in grado di indurre una grave forma di polmonite atipica, rilascia anche OMVS che sono in grado di attivare le cellule ed i macrofagi 16, 19 epiteliali polmonari. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l&#39;isolamento su piccola scala di L. pneumophila OMVS da coltura liquida per studiare il ruolo potenziale di OMVS in polmonite. E &#39;fondamentale per lavorare sotto Condit sterileioni e per escludere la contaminazione da altri batteri per ottenere una pura L. pneumophila -derived preparazione OMV. L&#39;isolamento di OMVS comprende una fase di filtrazione attraverso pori 0,22 micron per impedire la contaminazione del pellet OMV ottenuto con L. pneumophila, anche se questo riduce la resa OMV, poiché i grandi OMVS vengono persi da questa fase di filtrazione. Inoltre, abbiamo testato la risposta dei macrofagi umani e murini a tali vescicole isolate e le cellule infettate con L. pneumophila per approssimare più da vicino la situazione in polmonite da Legionella, dove OMVS vengono rilasciati all&#39;interno del LCV da batteri extracellulari 15. Le dosi OMV impiegati sono stati stimati in base alla quantità OMV gratuitamente un&#39;infezione in vitro di macrofagi umani dopo 24 ore di incubazione (descritti nel riferimento 20). Per la stimolazione di altre cellule riceventi o in vivo,altre dosi OMV potrebbero essere necessari e devono essere stabiliti. L&#39;analisi degli effetti della L. pneumophila OMVS rappresenta un avanzamento al protocollo descritto da Jager e Steinert 24. Qui, PMA-differenziate cellule THP-1 servono da modello per macrofagi alveolari a causa della limitata disponibilità di materiale umano primario. L&#39;aggiunta di PMA differenzia i monociti cellule THP-1 in cellule macrofagi come 25. Inoltre, essi sono una linea cellulare modello ben noto per la L. pneumophila studia 26. Oltre a questa linea cellulare monocitica umana, vengono utilizzate le cellule mBMDM. mBMDM sono ampiamente accettate per lo studio degli effetti della L. pneumophila 27, 28, 29. La possibilità di utilizzare fori genetiche per i diversi TLR o altre proteine ​​di loro uno strumento prezioso per lo studio degli effetti OMV fare. in order per abbassare la quantità di topi per esperimento, mBMDM sono utilizzati al posto dei macrofagi alveolari causa delle limitazioni dei macrofagi. esperimenti chiave potrebbero richiedere macrofagi alveolari per la convalida. Oltre al protocollo qui descritto di ultracentrifugazione per purificare OMVS, è possibile effettuare una centrifugazione in gradiente di densità, che è incluso nel protocollo da Chutkan et al. 30. Ciò potrebbe migliorare la purezza della preparazione OMV ottenuto e ridurre la quantità di aggregati co-purificata proteine, flagellina, e LPS. La purezza della preparazione OMV ottenuto può essere analizzata mediante microscopia elettronica a trasmissione o nanoparticelle analisi inseguimento a titolo supplementare nel controllo qualità. Questo può fornire un ulteriore mezzo di quantificazione, al di là della procedura di misurazione della proteina qui presentata. Opzionalmente, la concentrazione di LPS può essere analizzato da un test di lisato di amebociti di Limulus. Se la resa OMV è basso, unfase di concentrazione aggiuntive tramite filtri centrifughe potrebbe essere eseguita, che non è stato fatto qui. Se la resa è stata inferiore al previsto, i OMVS sono stati scartati. Come parte del continuo sforzo per chiarire i meccanismi biologici e le funzioni dietro OMVS, l&#39;influenza delle diverse condizioni di stress sulla produzione OMV potrebbe essere testato. La privazione di nutrienti, le variazioni di temperatura di incubazione, o l&#39;esposizione ad agenti nocivi potrebbe avere un impatto sulla secrezione OMV 31. Le possibili condizioni di stress sono discussi nel protocollo da Klimentova e Štulík 32. Inoltre, iper- o hypovesiculating mutanti di L. pneumophila potrebbero essere generati. Le diverse preparazioni OMV potrebbero poi essere analizzati in esperimenti di infezione con macrofagi, espianti tessuto polmonare umano (descritti in riferimento 17), o anche in modelli in vivo. Oltre al ruolo di OMVS in innato segnalazione immunitario, la loro influenza nella comunicazione battericapossono essere affrontati sperimentalmente. Inoltre, l&#39;impatto delle varie cascate di segnalazione immunitario innato potrebbe essere analizzato con l&#39;uso di cellule murine knockout o la generazione di CRISPR / Cas9 ko in linee cellulari umane. Questa ricerca di base in OMVS assisterà allo sviluppo di nuove strategie vaccinali, che esistono già per la meningite B trasmessa da Neisseria meningitidis 33. A partire dal protocollo sull&#39;isolamento OMV e la caratterizzazione, si può applicare questo ad altri batteri Gram-negativi e ad altre cellule ospiti; deve soltanto essere regolato per la crescita dei batteri in coltura liquida. Il protocollo pubblicato da Chutkan et al. fornisce informazioni dettagliate sulla generazione di OMVS da Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa 30. La cultura non deve raggiungere la fase stazionaria tardiva per evitare aumenti di batteri lisati e proteine ​​contaminanti e membrane. Inoltre, la dose OMV utilizzato per la stimolazione delle cellule ospiti deve essere determinato in funzione della quantità di OMVS presente durante infezioni in vivo, pur garantendo un basso tasso di citotossicità. In questo modo, il ruolo patologico della OMVS, il loro impatto sulla comunicazione inter-specie, e le interazioni ospite-patogeno potrebbe essere esaminata. Per studiare ulteriormente il ruolo di L. pneumophila OMVS in polmonite, sono necessari preparativi OMV standardizzati con rendimenti sufficienti e esperimenti di infezione comparabili. Questo protocollo contribuirà a standardizzare le procedure di isolamento e di estendere gli studi OMV ad altri batteri Gram-negativi e ad altre cellule ospiti. Inoltre, la ricerca beneficerà il dettaglio nella conoscenza vitro, che può essere utilizzata per estendere gli esperimenti alle impostazioni in vivo. In futuro, questo protocollo potrebbe essere esteso a l&#39;isolamento di OMVS da materiale biologico primario, come il siero o lav broncoalveolareil fluido di età, al fine di conoscere la composizione del OMVS rilasciata in condizioni fisiologiche. Ciò contribuirà a determinare i parametri chiave della composizione OMV e per comprendere le proprietà di OMVS generate da in vitro.

<html> I batteri possono secernere fattori di virulenza attraverso diversi meccanismi 1. Oltre ai sistemi di secrezione ben noti, batteri Gram-negativi possono scambiarsi informazioni e fornire fattori di virulenza tramite vescicole membrana esterna (OMVS), che sono piccole vescicole, sferoidali 10-300 nm di diametro e con una struttura a membrana a doppo strato. Essi sono secreti in una varietà di ambienti di crescita (coltura liquida, solida cultura e biofilm) e in tutte le fasi di crescita 2, 3. OMVS sono un importante mezzo di trasporto (ad esempio, per le proteine, adesine, tossine e gli enzimi, così come per i LPS, che si trova sulla superficie OMV) 4. Il carico intraluminale è protetta dalla degradazione proteolitica, quindi è in grado di agire su lunghe distanze, e le vescicole si trova nei fluidi corporei e organi distanti 5, 6,&quot;xref&quot;&gt; 7, 8. Non possono essere riconosciuti solo ed assorbiti dalle cellule eucariotiche 9, 10, ma, inoltre, sono in grado di facilitare il legame di batteri e loro invasione nelle cellule ospiti 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) è un batterio Gram-negativo che può rilasciare OMVS. Nel polmone umano, che infetta principalmente macrofagi alveolari, anche se il suo ospite naturale sono amebe acqua dolce 11. Un&#39;infezione pneumophila L. può causare la malattia del legionario &#39;, una grave forma di polmonite 12. Esso blocca la fusione phagosome-lisosomi nella cellula ospite. Si recluta anche organelli ospitanti, per cui una nicchia di replica, la Legionella -aventi tenore vacuolo (LCV), si forma 13, 14. degradazione lisosomiale è inibito non solo da proteine ​​effettrici Translocation tramite il sistema di secrezione di tipo IV, ma anche dal rilascio di OMVS 15. La purificazione di OMVS da colture batteriche è necessario per analizzare il loro effetto sulle cellule riceventi. Studi precedenti focalizzati sul tenore in proteine di L. pneumophila OMVS e sull&#39;influenza delle vescicole sulle cellule epiteliali alveolari 16, ma gli studi successivi con trapianti di tessuto polmonare umano hanno dimostrato che L. pneumophila OMVS sono ripreso da macrofagi alveolari 17. Come OMVS attuali modelli molecolari associati ai patogeni (PAMPs) e altri antigeni batterici, potrebbero avere un impatto sul l&#39;infezione di cellule eucariotiche e modulare la risposta immunitaria 18. L. pneumophila OMVS rapidamente si fondono con le membrane della cellula ospite e, inoltre, attivano il membranosa TLR2 19. Come è noto che L. pneumophila OMVS stimolare macrofagi e cellule epiteliali in maniera pro-infiammatoria 16, 17, abbiamo analizzato l&#39;impatto OMVS sul processo di infezione nei macrofagi umani e murini. Qui, descriviamo un protocollo per la coltivazione di L. pneumophila in coltura liquida per isolare i OMVS secrete da ultracentrifugazione differenziale e per valutare l&#39;impatto delle vescicole sulle cellule ospiti eucariotiche, direttamente o dopo un&#39;infezione.

<table><tbody><tr><td>Piastra Petri da 10 cm</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Rotore 70 Ti</td><td>Beckman Coulter Incorporation (California, USA)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>carbone attivo</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar, Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar con il 5% di sangue di pecora</td><td>Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germania)</td><td>254005</td><td></td></tr><tr><td>cuvette</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (umano)</td><td>BD OptEIA&trade;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germania)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (murino)</td><td>DuoSet, R& D (Minneapolis, USA)</td><td>CXCL1: DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germania)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Ciclo di inoculazione&nbsp;</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td><td>gentilmente fornito da Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlino, Germania)</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby & Delta; flaA</td><td>---</td><td>---</td><td>gentilmente fornito dal Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlino, Germania)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mBMDM</td><td>---</td><td>---</td><td>gentilmente fornito dal Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germania) e dal Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlin, Germany)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>agitatore rotante (MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 high glucose</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germania)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponina</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (Cambridge, Inghilterra)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>filtro sterile (dimensione dei pori: 0,22 &; m)</td><td>Corning Incorporated (new York, USA)</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germania)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

legionella pneumophila membrana esterna vescicole: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

I batteri sono in grado di secernere una varietà di molecole attraverso vari sistemi secretori. Oltre alla secrezione di molecole nello spazio extracellulare o direttamente in un'altra cellula, i batteri Gram-negativi possono anche formare vescicole della membrana esterna (OMV). Queste vescicole di membrana possono trasportare il loro carico su lunghe distanze e il carico è protetto dalla degradazione da proteasi e nucleasi. 
La Legionella pneumophila (L. pneumophila) è un patogeno intracellulare, Gram-negativo, che causa una grave forma di polmonite. Nell'uomo, infetta i macrofagi alveolari, dove blocca la degradazione lisosomiale e forma un vacuolo di replicazione specializzato. Inoltre, L. pneumophila produce OMV in varie condizioni di crescita. Per comprendere il ruolo degli OMV nel processo di infezione dei macrofagi umani, abbiamo messo a punto un protocollo per purificare le vescicole di membrana batterica da colture liquide. Il metodo si basa sull'ultracentrifugazione differenziale. Gli OMV arricchiti sono stati successivamente analizzati per quanto riguarda la loro quantità di proteine e lipopolisaccaridi (LPS) e sono stati quindi utilizzati per il trattamento di una linea cellulare monocitica umana o di macrofagi derivati dal midollo osseo murino. Le risposte pro-infiammatorie di queste cellule sono state analizzate mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico. Inoltre, sono state analizzate le alterazioni di una successiva infezione. A tal fine, la replicazione batterica di L. pneumophila nei macrofagi è stata studiata mediante saggi di unità formanti colonie. 
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la purificazione di OMV di L. pneumophila da coltura liquida mediante ultracentrifugazione e per l'analisi a valle del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi.

L&#39;apparato sperimentale per preparare L. pneumophila OMVS e di analizzare la loro influenza sulla risposta pro-infiammatoria dei macrofagi seguenti infezione è raffigurato nella figura 1. Il potenziale pro-infiammatoria delle OMVS preparati possono essere analizzati su PMA dissociati cellule THP-1, che è illustrato nella figura 2. cellule THP-1 rispondono con un aumento di tempo e dose-dipendente di IL-8 e IL-6 secrezione. Inoltre, l&#39;influenza dei diversi TLR sul riconoscimento L. pneumophila OMV può essere analizzato utilizzando mBMDM da diversi background genetico, così come presentati dal CXCL1 ELISA in figura 3. mBMDM da topi WT secrete CXCL1 dopo stimolazione OMV, mentre mBMDM TLR2 / 4 - / - secreto significativamente meno. Per studiare l&#39;impatto di L. pneumophila OMVS sulla replicazione batterica in THP-1 macrofagi, le cellule sono state pre-incubate con OMVS e poi ulteriormente infettaticon L. pneumophila (Figura 4 A). Il pre-stimolazione dei macrofagi THP-1-derivati ​​primo riduce la replicazione batterica dopo 24 h di infezione, ma porta ad un raddoppio CFU conteggio nel punto più tardi (48 h pi). L&#39;impatto dei recettori Toll-like (TLR) di segnalazione sul riconoscimento OMV dopo l&#39;infezione dei macrofagi può essere valutata mediante mBMDM, come illustrato nella figura 4 B. Aumenta batteriche replica di dieci volte in mBMDM da animali WT dopo OMV pre-incubazione, mentre TLR2 - / - e TRIF / MyD88 - / - cellule non mostrano questo aumento di L. pneumophila replica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> Figura 1: Procedura sperimentale. (A) L. pneumophila Corby WT da 10-cm BCYE agar piastre sono utilizzate per inoculare una piccola coltura liquido (10 mL), che viene trasferito in 90 mL di YEB frescamedia dopo 6 h. Un piccolo volume è anche placcato su una piastra di agar sangue per verificare la purezza. I batteri vengono incubate a 37 ° C fino alla fase stazionaria precoce (OD 600 = 3,0-3,5). (B) La coltura liquido viene centrifugato e sterile filtrata per eliminare i batteri. Il supernatante -free Legionella viene quindi ultracentrifugato per ottenere un pellet OMV, che viene risospeso in PBS e ultracentrifugato nuovo. Le vescicole isolate sono risospese, controllati per purezza e quantificati per la quantità di proteine. La barra di scala rappresenta 2,5 cm. (C) macrofagi umani o murini sono stimolati con i OMVS quantificati. Il supernatante di coltura cellulare può essere utilizzato per ELISA, o macrofagi possono essere infettati con L. pneumophila per determinare replicazione batterica mediante saggio CFU su 10 cm-BCYE agar piastre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </a&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> Figura 2: attivazione pro-infiammatoria di cellule THP-1 di L. pneumophila OMVS. (A) Qui, la linea cellulare THP-1 monocitica è usato come modello per macrofagi alveolari. PMA-differenziati THP-1 le cellule sono state trattate con dosi crescenti di L. pneumophila OMVS (0,01-25 mg / ml) per 24 e 48 ore, rispettivamente. Il supernatante privo di cellule è stata usata per IL-8 ELISA. mostra i valori medi dei tre esperimenti indipendenti ± SEM. Cellule THP-1 ha risposto a soli 0,01 mg / mL L. pneumophila OMVS con significativa secrezione di IL-8, che era tempo e dose-dipendente. (B) L. pneumophila OMVS (0,1-10 mg / ml) sono stati usati per stimolare la PMA dissociati cellule THP-1. Il supernatante è stato raccolto dopo 24 e 48 ore di incubazione, e rilasciato IL-6 è stata misurata nel supernatante mediante ELISA. mostra i valori medi dei tre esperimenti indipendenti ± SEM. cellule THP-1 secreti notevoli quantità di IL-6, anche con la dose più bassa di OMVS (0,1 mg / mL). La secrezione di IL-6 aumenta con dosi crescenti OMV e con tempi di incubazione prolungati. Statistiche: test di Mann-Whitney; * P &lt;0.05 e ** p &lt;0,01 rispetto al corrispondente 0 mg / mL OMV. Ristampato con il permesso di riferimento 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> Figura 3: L&#39;attivazione pro-infiammatoria dei macrofagi dipende TLR2 / 4. mBMDM da WT e TLR2 / 4 - / - topi sono stati incubati con L. pneumophila OMVS (0,1 o 1 mg / ml). CXCL1 secrezione è stata analizzata mediante ELISA dopo 24 e 48 ore, rispettivamente. Ilsono riportati i valori medi ± SEM di tre esperimenti indipendenti. mBMDM da topi WT ha risposto con una secrezione CXCL1 dose-dipendente dopo L. pneumophila OMV incubazione. TLR2 / 4 - / - mBMDM secreti significativamente meno CXCL1 rispetto al WT mBMDM, e questa secrezione non ha aumentato la dose-dipendente. Statistiche: test di Mann-Whitney; * P &lt;0,05 rispetto al corrispondente 0 mg / mL OMV; #p &lt;0.05 confrontata con un campione WT altrettanto trattata. Ristampato con il permesso di riferimento 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> Figura 4: replica L. pneumophila OMV pre-incubazione aumenta batterica nei macrofagi. (A) differenziata THP-1 cellule sono state pre-incubate con OMVS (0,1, 1 o 10 μ; G / mL) o LPS / IFN-γ (200 ng / mL ciascuno) o sono stati lasciati non trattati per il controllo. Dopo di pre-incubazione (20 h), THP-1 cellule sono state infettate con L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) per 2, 24, e 48 ore, rispettivamente. THP-1 cellule sono state lisate mediante aggiunta di saponina, ed i batteri sono stati piastrati su piastre di agar BCYE. CFU sono stati calcolati rispetto a 0 mg / ml OMV dopo ogni punto di tempo. Le barre rappresentano i valori medi ± SEM di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in duplicato tecnici. Non ci sono state differenze nella diffusione batterica (2 ore dopo l&#39;infezione (pi)) rispetto alle cellule non pre-trattati. Alterazioni nella replicazione batterica sono stati determinati dopo 24 e 48 ore, rispettivamente. LPS / pretrattati cellule THP-1 IFN-γ hanno mostrato una riduzione del carico batterico 24 h Pi Questa è stata anche osservata dose-dipendente per L. pneumophila OMV cellule pre-trattati. Al punto secondo momento (48 h PI), OMV pre-trattati cellule THP-1 ha mostrato un raddoppio in L. pneumophila replicatura, che LPS / IFN-gamma macrofagi pretrattati mostrato un&#39;ulteriore riduzione di carica batterica. Statistiche: test di Mann-Whitney; * P &lt;0.05 e ** p &lt;0,01 rispetto al corrispondente 0 mg / mL OMV. (B) mBMDM da topi con differenti background genetico (WT, TLR2 - / -, e TRIF / MyD88 - / -) sono stati pre-incubate con 0,1 mg / ml L. pneumophila OMVS per 20 ore e sono stati poi infettati con un flagellin- mutante carente di L. pneumophila Corby (MOI 0.5) per 48 ore. mBMDM state lisate mediante aggiunta di saponina, e la Legionella sono state piastrate su piastre di agar BCYE. La CFU sono stati calcolati rispetto a 0 mg / mL OMV, indicato dalla linea continua. Le barre rappresentano i valori medi ±± SEM di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in duplicato. mBMDM da topi WT ha mostrato un aumento in L. pneumophila replica dopo OMV pre-trattamento. TLR2 - / - macrofagi hanno mostrato significativamente ridotti <em&gt; Replica Legionella, che era paragonabile a TRIF / MyD88 - / - mBMDM. Statistiche: test di Mann-Whitney; p &lt;0,05 rispetto al campione WT. Ristampato con il permesso di riferimento 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, descriviamo la purificazione di Legionella pneumophila (L. pneumophila) vescicole membrana esterna (OMVS) da colture liquide. Tali vescicole purificate sono poi utilizzati per il trattamento dei macrofagi per analizzare il loro potenziale pro-infiammatoria.

Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

L'obiettivo generale di questo studio è purificare in modo standardizzato le vescicole della membrana esterna, o OMV, da Legionella pneumophila e analizzarne l'influenza sulla replicazione batterica nei macrofagi umani e murini. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulle vescicole della membrana esterna. Ad esempio, la procedura standardizzata per la preparazione delle OMV può aiutare a studiarne l'impatto sull'interazione ospite-patogeno.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornirà un protocollo standardizzato per studiare l'impatto delle OMV di Legionella pneumophila sui macrofagi umani o murini, migliorando così la nostra comprensione della patogenicità di Legionella pneumophila. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo considerato il possibile potenziale pro-infiammatorio delle OMV e il modo in cui questo potrebbe influenzare l'andamento dell'infezione, dato che le OMV vengono rilasciate da Legionella sia all'interno della cellula ospite che in forma extracellulare. La procedura sarà dimostrata da Kerstin Hoffmann, tecnica del mio laboratorio, e da Analina Young, ricercatrice post dottorato.Per iniziare, in condizioni sterili, distribuire il ceppo core B di L.pneumophila su piastre di agar BCYE e incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. Utilizzare il ceppo di L.pneumophila proveniente da una piastra di precoltura per inoculare 10 millilitri di terreno YEB a un OD600 di 0.3 e incubare i batteri a 37 gradi Celsius su un agitatore rotante per sei ore. Verificare la purezza della coltura liquida distribuendo 100 microlitri della sospensione su una piastra di agar sangue.Incubare la piastra di agar sangue durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere la coltura liquida rimanente a 90 millilitri di mezzo YEB fresco e incubare la coltura in agitazione rotante fino a quando non raggiunge un OD600 compreso tra 3,0 e 3,5. Centrifugare la coltura liquida a 4.000 ×g per 20 minuti per ottenere il pellet batterico.Quindi trasferire il soprannatante in nuove provette da centrifuga. Scartare i pellet batterici e centrifugare nuovamente i campioni prima di ripetere il passaggio di centrifugazione un’altra volta. Successivamente, filtrare e sterilizzare due volte il soprannatante rimanente.Trasferire quindi il surnatante privo di batteri in provette per ultracentrifuga e centrifugare i campioni a 100.000 g a quattro gradi Celsius per tre ore. Decantare il surnatante e scartarlo. Successivamente, utilizzare PBS sterile per risospendere i pellet di OMV e raccoglierli in un unico campione.Ripetere il passaggio di ultracentrifugazione per rimuovere le proteine contaminanti e il LPS libero. A questo punto, scartare il soprannatante e asciugare il tubo dell'ultracentrifuga con un bastoncino di cotone sterile. Risospendere il pellet di OMV con 500 microlitri di PBS sterile.Successivamente, effettuare un’incocciatura di 20 microlitri ciascuno su piastre di agar sangue e agar BCYE per escludere la contaminazione batterica delle vescicole preparate. Incubare la piastra di agar sangue per tutta la notte e la piastra di agar BCYE per tre giorni. Utilizzare il saggio BCYE seguendo le istruzioni del produttore per quantificare la quantità di proteina presente nella preparazione ottenuta di OMV.Dopo aver differenziato le cellule THP-1 in macrofagi seguendo il protocollo descritto nel testo, utilizzare 500 microlitri di mezzo fresco per sostituire il mezzo di differenziazione e incubare le cellule per ulteriori 24 ore a 37 gradi Celsius. Per trattare le cellule THP-1 o i macrofagi derivati da midollo osseo murino (BMDM) con OMV, scongelare le OMV precedentemente preparate e aggiungere la quantità appropriata alle cellule. Incubare i macrofagi con le OMV a 37 gradi Celsius per almeno 20 ore per infettare cellule THP-1 pretrattate o non trattate con il ceppo wild-type L.pneumophila core B o cellule BMDM murine con un mutante privo di flagelli di questo ceppo, senza cambiare il mezzo delle cellule.Aggiungere i batteri a un MOI di 0,5, pari a una volta 10 alla quinta L. pneumophila per pozzetto. Incubare le colture rispettivamente per 24 e 48 ore. Per lisare le cellule, aggiungere saponina a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare le cellule per cinque minuti.Quindi risospendere i macrofagi lisati mediante pipettaggio e trasferire la sospensione in un recipiente di reazione. Utilizzare PBS sterile per preparare diluizioni seriali della sospensione di L.pneumophila. Successivamente, seminare 50 microlitri delle diluizioni richieste su piastre di agar BCYE e incubare le piastre per tre giorni.Contare visivamente le colonie formate ad occhio nudo ed eseguire i calcoli secondo il protocollo indicato nel testo. In questo esperimento, volto a esaminare il potenziale pro-infiammatorio delle OMV di L.pneumophila, le cellule THP-1 differenziate con PMA rispondono con un aumento dipendente dal tempo e dalla dose nella secrezione di IL-8 e IL-6. Qui, l'influenza di diversi recettori toll-simili sul riconoscimento delle OMV di L.pneumophila è stata analizzata in BMDM murini con diversi background genetici, utilizzando un saggio ELISA per CXCL-1.I BMDM murini di topi di tipo selvaggio hanno secreto CXCL-1 dopo la stimolazione con OMV, mentre i BMDM murini di topi knockout doppio per TLR2/4 ne hanno secreto significativamente meno. Per studiare l'impatto delle OMV di L.pneumophila sulla replicazione batterica nei macrofagi THP-1, le cellule sono state pre-incubate con OMV per 20 ore e successivamente infettate con L.pneumophila. La pre-stimolazione dei macrofagi derivati da THP-1 riduce inizialmente la replicazione batterica in modo dose-dipendente dopo 24 ore di infezione, mentre conduce a un raddoppio del numero di UFC in un momento successivo.Come mostrato in questo esperimento, la pre-stimolazione dei BMDM murini con OMV determina un aumento di dieci volte del conteggio delle UFC nei BMDM murini provenienti da animali wild-type, mentre i macrofagi privi di TLR2 o privi di TRIF/MyD88 non mostrano tale aumento nella replicazione di L.pneumophila dopo la pre-incubazione con OMV. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di lavorare in condizioni sterili e di verificare la contaminazione batterica delle OMV purificate. In caso contrario, l'analisi successiva non fornisce risultati conclusivi.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio quale mutante di Legionella produce un numero maggiore o minore di OMV, oppure per studiare l'impatto di diverse condizioni di stress sulla secrezione di OMV. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio delle OMV per esplorare l'impatto delle OMV sulle interazioni tra patogeno e ospite in vitro e successivamente in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare le OMV e di come iniziare ad analizzarne l'effetto sull'infezione successiva dei macrofagi.Questo protocollo può quindi essere applicato a diversi batteri Gram-negativi e alle rispettive cellule ospiti, adattando i tempi di incubazione e di crescita. Non dimenticare che il lavoro con Legionella pneumophila può essere estremamente infettivo per l'uomo, pertanto tutte le operazioni devono essere sempre eseguite sotto una cappa sterile durante la manipolazione di Legionella e l'esecuzione di questa procedura.

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Purificazione di Vacuoli patogeno da<em&gt; Legionella</em&gt;-Infetti fagociti

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Saggio della replicazione di Legionella pneumophila nei macrofagi pretrattati con vescicole della membrana esterna

Fonte: Jung, A. L., et al. Vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi. J. Vis. Esp. (2017)Questo video dimostra l'isolamento delle vescicole della membrana esterna (OMV) da Legionella pneumophila tramite centrifugazione sequenziale, filtrazione sterile e ultracentrifugazione. Gli OMV purificati, arricchiti con proteine di membrana e lipopolisaccaridi, sono adatti per studi di interazione ospite-patogeno.

Isolamento basato su ultracentrifugazione delle vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila

In questo video, quantifichiamo la Listeria monocytogenes intracellulare ed extracellulare, un batterio patogeno intracellulare, in seguito alla loro infezione di macrofagi in coltura in vitro utilizzando la citometria a flusso.

Analisi con Citometria a Flusso di Listeria monocytogenes intracellulare ed extracellulare emergente in vitro

Questo video dimostra una tecnica per studiare la formazione di inflammasomi NLRP3 (NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3) nei macrofagi primari tramite immunofluorescenza. I macrofagi vengono prima innescati con lipopolisaccaride batterico (LPS) per sovraregolare l'espressione della proteina NLRP3. L'esposizione dei macrofagi alla nigericina, uno ionoforo di potassio, porta all'attivazione di NLRP3 e alla formazione di inflammasomi, che vengono visualizzati tramite...

Una tecnica in vitro per studiare la formazione di complessi inflammasomici nei macrofagi

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

La larva di tarma della cera Galleria mellonella è stato recentemente stabilito come un modello in vivo per studiare l'infezione da Legionella pneumophila. Qui, dimostriamo tecniche fondamentali per caratterizzare la patogenesi della Legionella nelle larve, tra cui l'inoculazione, la misurazione della virulenza batterica e la replica così come l'estrazione e l'analisi delle hemocytes infetti.

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I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

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L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

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Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

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