Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

L'obiettivo generale di questo studio è quello di purificare le vescicole della membrana esterna o OMV da Legionella pneumophila in modo standardizzato e di analizzare la loro influenza sulla replicazione batterica nei macrofagi umani e murini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle vescicole della membrana esterna. Ad esempio, la procedura standardizzata per la preparazione dell'OMV può aiutare a studiare il loro impatto sull'interazione ospite-patogeno.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornirà un protocollo standardizzato per studiare l'impatto degli OMV della Legionella pneumophila sui macrofagi umani o murini e questo migliorerà la nostra comprensione della patogenicità della Legionella pneumophila. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo pensato al possibile potenziale pro-infiammatorio degli OMV e a come questo potrebbe influenzare il decorso dell'infezione poiché gli OMV vengono rilasciati dalla Legionella sia all'interno della cellula ospite che extracellulare. La procedura sarà dimostrata da Kerstin Hoffmann, un tecnico del mio laboratorio e Analina Young, una ricercatrice post-dottorato.

Per iniziare, lavorando in condizioni sterili, spargere il nucleo B del ceppo di L. pneumophila su piastre di agar BCYE e incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. Utilizzare L.pneumophila da una piastra di pre-coltura per inoculare 10 millilitri di terreno YEB a un OD600 di 0,3 e incubare i batteri a 37 gradi Celsius su un agitatore rotante per sei ore. Verificare la purezza della coltura liquida distribuendo 100 microlitri di sospensione su una piastra di agar sanguigno.

Incubare la piastra di agar sanguigno durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere la coltura liquida rimanente a 90 millilitri di terreno YEB fresco e incubare la coltura su un agitatore rotante fino a raggiungere un OD600 compreso tra 3,0 e 3,5. Centrifugare la coltura liquida a 4.000 g per 20 minuti per pellettare i batteri.

Quindi trasferire il surnatante in provette da centrifuga fresche. Scartare i pellet batterici e centrifugare nuovamente i campioni prima di ripetere nuovamente la fase di centrifugazione. Quindi, filtrare sterilizzare due volte il surnatante rimanente.

Quindi trasferire il surnatante privo di batteri in provette per ultracentrifuga e centrifugare i campioni a 100.000 g a quattro gradi Celsius per tre ore. Decantare il surnatante e gettarlo. Quindi utilizzare PBS sterile per risospendere i pellet OMV e raggrupparli.

Ripetere la fase di ultracentrifugazione per rimuovere le proteine contaminanti e liberare l'LPS. A questo punto, scartare il surnatante e asciugare la provetta per ultracentrifuga con un batuffolo di cotone sterile. Risospendere il pellet OMV con 500 microlitri di PBS sterile.

Quindi strisciare 20 microlitri ciascuno sulle piastre di agar sanguigno e BCYE agar per escludere la contaminazione batterica della vescicola preparata. Incubare la piastra di agar sanguigno durante la notte e la piastra di agar BCYE per tre giorni. Utilizzare il test BCYE secondo le istruzioni del produttore per quantificare la quantità di proteine per il preparato OMV ottenuto.

Dopo aver differenziato le cellule THP-1 in macrofagi secondo il protocollo di testo, utilizzare 500 microlitri di terreno fresco per sostituire il terreno di differenziazione e incubare le cellule per altre 24 ore a 37 gradi Celsius. Per trattare le cellule THP-1 o BMDM murine con OMV, scongelare le OMV precedentemente preparate e aggiungere la quantità appropriata alle cellule. Incubare i macrofagi con OMV a 37 gradi Celsius per almeno 20 ore per infettare le cellule THP-1 pretrattate o non trattate con il nucleo B del ceppo di L.pneumophila wild-type o le cellule BMDM murine con un mutante privo di flagelli di questo ceppo senza cambiare il terreno dalle cellule.

Aggiungere batteri a un MOI di 0,5 che equivale a una volta 10 al quinto L.pneumophila per pozzetto. Incubare le colture rispettivamente per 24 e 48 ore. Per lisare le cellule, aggiungere saponina a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare le cellule per cinque minuti.

Quindi risospendere i macrofagi lisati mediante pipettaggio e trasferire la sospensione in un recipiente di reazione. Utilizzare PBS sterile per preparare diluizioni seriali della sospensione di L. pneumophila. Quindi strisciare 50 microlitri delle diluizioni necessarie su piastre di agar BCYE e incubare le piastre per tre giorni.

Conta visivamente le colonie formate a occhio ed esegui calcoli secondo il protocollo di testo. In questo esperimento, esaminando il potenziale pro-infiammatorio degli OMV di L.pneumophila, le cellule THP-1 differenziate da PMA rispondono con un aumento dipendente dal tempo e dalla dose della secrezione di IL-8 e IL-6. Qui, l'influenza di diversi recettori toll-like sul riconoscimento dell'OMV di L.pneumophila è stata analizzata in BMDM murini con diversi background genetici utilizzando un test ELISA CXCL-1.

I BMDM murini di topi wild-type secernevano CXCL-1 dopo stimolazione OMV, mentre i BMDM murini da doppio knockout TLR2/4 secernevano significativamente meno. Per studiare l'impatto degli OMV di L.pneumophila sulla replicazione batterica nei macrofagi THP-1, le cellule sono state pre-incubate con OMV per 20 ore e poi ulteriormente infettate con L.pneumophila. La pre-stimolazione dei macrofagi derivati da THP-1 riduce la dose di replicazione batterica in modo dipendente dopo 24 ore dall'infezione, mentre porta a un raddoppio della conta delle CFU in un momento successivo.

Come mostrato in questo esperimento, la pre-stimolazione dei BMDM murini con OMV determina un aumento di dieci volte della conta delle CFU nei BMDM murini da animali wild-type, mentre il knockout TLR2 e i macrofagi TRIF/MyD88 non mostrano questo aumento della replicazione di L.pneumophila dopo la pre-incubazione di OMV. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare in condizioni sterili e di verificare la presenza di contaminazione batterica degli OMV purificati. In caso contrario, l'analisi a valle non fornisce risultati conclusivi.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle per rispondere a ulteriori domande, come quale mutante della Legionella sta producendo più o meno OMV o per studiare l'impatto di diverse condizioni di stress sulla secrezione di OMV. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sugli OMV per esplorare l'impatto degli OMV sulle interazioni ospite-patogeno in vitro e poi in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare gli OMV e come iniziare ad analizzare il loro effetto sulla successiva infezione dei macrofagi.

Questo protocollo può quindi essere applicato a diversi batteri gram-negativi e alla rispettiva cellula ospite dopo aver adattato i tempi di incubazione e crescita. Non dimenticare che lavorare con la Legionella pneumophila può essere estremamente contagioso per l'uomo, quindi il lavoro dovrebbe sempre essere svolto sotto un banco sterile durante la manipolazione della Legionella e l'esecuzione di questa procedura.